Transcrição de Aula Bacilos Gram

Prévia do material em texto

Bacilos Gram-negativas Não Fermentadoras 
Hoje a gente vai falar sobre bacilos gram-negativos não fermentadores. Quando a gente começa a estudar esses bacilos, a gente não pode esquecer que eles não fazem parte da família Enterobacteriaceae. Se são bacilos não-fermentadores é porque oxidam, e se oxidam é porque precisam de oxigênio. Se precisam de oxigênio, elas são aeróbias. Então a gente parou de estudar a Família Enterobacteriaceae, que são anaeróbias facultativas, para estudar bactérias que são aeróbias restritas. Quando Kesia mostrou na pratica aquele teste para saber se as bactérias são aeróbias, aeróbias facultativas, microaerófilas ou anaeróbias, vocês viram que cada resultado do teste indica cada uma dessas condições. Nesse caso, como são aeróbias restritas, esses bacilos crescerão na superfície do meio, que é líquido, região em maior contato com o ar, e, portanto, mais oxigenado. Se elas precisam de oxigênio, era de se esperar que todas elas tivessem resultados positivos naquela reação, que serve para diferenciar os oxidantes dos fermentadores, que é a citocromo oxidase. Mesmo que dê uma prova negativa na bancada para citocromo oxidase, não necessariamente significa que eles não têm o sistema citocromo, que é tão importante para as bactérias aeróbias. Na prova de citocromo oxidase é necessário que a bactéria mostre na bancada o poder extremamente oxidante no reativo que nós usamos, que é o parafenilenodiamino, indicando a presença do citocromo A3. Aí, era de se esperar que todos os gêneros desse grupo de bactérias não fermentadoras fosse Citocromo Oxidase positiva, mas isso não acontece. Isso não quer dizer que eles não tenham sistema citocromo, que eles não tenham aquela cadeia transportadora de elétrons, não gere água e que não tenham ATP ao final de todo o processo. Quer dizer que ele não tem aquele citocromo A3 responsável pela oxidação do reagente. 
Como é que a gente descobre, na bancada, que a gente está lidando com um bacilo gram-negativo não-fermentador? Até agora a gente não vai falar de gênero, vamos falar de grupo. O primeiro de tudo é fazendo a coloração de Gram e o semeio em um meio de cultura onde cresce tudo e onde só cresce gram-negativo. No meio de crescimento seletivo para gram-negativo, é de se esperar que eles cresçam bastante. Os meios seletivos para gram-negativos são direcionados para bactérias que são oriundas do TGI, devido à presença de sais biliares, então elas podem crescer inibidas, mesmo sendo gram-negativos. Muitos desses bacilos gram-negativo não-fermentadores são ditos como fastidiosos, são mais exigentes em relação aos substratos oferecidos nos meios. Quando é semeado, muitas vezes muitos deles nem aparecem, e quando aparecem são colônias tão pequenas que parecem poeira. Se não olhar com a lupa e a luz, provavelmente vai achar que é uma bactéria gram-positiva, daí a importância de fazer a coloração de Gram. Em qualquer momento de dúvida, refaz o Gram com a colônia isolada, principalmente para saber se a colônia está pura e se direcionar na prova bioquímica ou do grupo de provas bioquímicas que vai ser utilizado. 
 Então, a primeira coisa que a gente faz quando se depara com esse grupo aí, é saber realmente se ele é não fermentador. Nós só sabemos isso por que, já no protocolo, que quando nos deparamos com Gram-negativo, devemos fazer o isolamento em meio seletivo para Gram-negativo e fazer os 6 testes bioquímicos (TSI, Ureia, SIM, Citrato de Sódio, Fenilalanina Desaminase, Descarboxilases). Se na leitura de 24h aparecer um TSI Alcalino/Alcalino (lembrando da espessura da base e da inclinação do tubo, se não sempre vai dar alcalino/alcalino, independentemente se a bactéria for a mais fermentadora de todas), isso já vai dar indícios de que você está trabalhando com uma bacilo Gram-negativo não-fermentador. Sendo assim, visualmente, o tubo vai ficar todo cor-de-rosa. A citocromo-oxidase positiva e a incapacidade de cre scer em MacConkey são duas provas que não servem para a gente difere nciar o grupo não-fermentador, mas para diferenciar os gêneros entre si. Por exemplo, Pseudomonas cresce em MacConkey, aparece com um pigmento m arrom (piocianina), que é hidrofílico, então eles v ão permear sob o meio e muda a colo ração; e nem todos são citocromo-oxidase positiva, só aqueles que possui o Citocromo A3 e isso é muito importante por que vamos com eçar a separar os gêneros entre s i. Uma coisa importante que não tem nos livros, m as que vocês v erão na prática é que muitos dos gêneros Gram-negativos não-fermentadores são coloridos. As Pseudomonas são v erde-cana, as Xantomonas são amarelas, etc. Então, d e cara, no isolamento em Ágar Sangue e no MacConkey, vocês já vão se deparar com colônias que tem coloração, diferente daquelas da fam ília Enterobacteriaceae que só tem duas que são colo ridas. Esses pigmentos existem, são sintetizados para defender o grupo bacteriano de alguma agressão. No caso das Pseudomonas, a piocianina tem um grupamento que é ext remamente letal para as células eucarióticas; então ela no solo ou na água convive muito bem com as outras bactérias que produzem enzimas, substancias oxidantes, mas quando ela toma lugar numa infecção é um caso gravíssimo. Todas as bactérias desse grupo que causam infecções hospitalares são infecções graves por que elas não têm um poder patogênico, m as elas têm fatores de v irulência, uma série de enzimas que se ativadas vão colocar em prática todo esse arsenal metabólico com um poder invasor muito grande, tornando difícil o tratamento da infecção. 
A oxidase é importante nesse sentido, de você sai r separando os grupos bacterianos. Pseudomonas aeruginosa é ox idase positiva. Vamos supor que você est eja lidando c om duas bactérias que tenham a mesma cor de c olônia, como é o caso do Acinetobacter e do Alcaligenes que tem uma colo ração cinza, você vai separar pela citocromo-oxidase. Se tiver Alcalineges e Pseudomonas, pela coloração e pela o rigem do espécime você já separa. O odor também ajuda nessa diferenciação de gênero. Existem características marcantes entre os microorganismos, então quando há uma secreção, essa secreção já toma a coloração da colônia. Então retomando, a prova da c itocromo ox idase vai diferencias as bactérias desse grupo. O sufixo “monas” significa grupo de bacilos que possui flagelo. 
Quando a gente relac iona esse grupo bacteriano com o da Família Enterobacteriaceae, a gente vê que epidemiologicamente falando ele não é tão comum de ser encontrado como uma Shigella, Salmonella, Enter obacter. Essas são as m ais prevalentes (marcado de vermelho no slide que não é o mesmo que eu tenho). 
Quais são os métodos de identificação? Se você estiver em um laboratório de alta demanda, m ais de 100 exames por dia, aí o método indicado é o automatizado, por que não tem c omo fazer tudo isso manualmente, e as vezes não é possível contratar tantos profissionais para fazer os testes. Isso não é específico para esse grupo de bactérias, mas para todas que tem importância epidemiológica, que aparece em isolamentos em grande quantidade. Nos métodos automatizados, vem cartelas com substratos, que dão reações e amáquina faz uma leitura em percentual de similaridade com o banco de dados que já existe nos equipamentos. Nesses, s ó servem para aquele grupo bacteriano específico para aquela cartela. Uma exceção é que se houver uma bactéria rara no isolamento, o equipamento vai dar erro, com grau de similaridade abaixo de 50%, que não pode ser liberado. 
O método automatizado fo i criado com base nos métodos comerciais. Nos mét odos comerciais, vêm cartelas estéreis com substrato liofilizado. Então, a única coisa que é prec iso é que tenha s olução salina e uma co lônia bem isolada. Daí v ocê vai pegar essa colônia e colocar na solução salina, o u mesmo na solução tampão que vem em alguns kits, numa quantidade que é calibrada através do espectofotômetro. Depois de ter a absorbância correta para realização do teste, você vai colocar a quantidade adequada de suspensão bacteriana nos pocinhos das cartelas, para que aquele substrato que está liofilizado possa ser hidratado e ao mesmo tempo tenha contato com a bactéria. Isso você encuba e lê com 24h através de mudanças de coloração. Nessas cartelas vêm uma série de substratos que vai lhe dar como reação positiva ou negativa um número, e esse número vai corresponder a um banco de dados que vai lhe dizer quem é a bact éria ao qual os resultados daqueles testes condizem. Ele é indicado para laboratório que não tem uma demanda m uito grande, porque para realizar os testes bioquímicos manualmente você requer t ubos, placas, meios diversos para cada teste, tem o prazo de validade dos meios. Os testes manuais são para os laboratórios que tem um aporte m aior, mas que não t em t antos recursos para c omprar os equipamentos, que são as provas bioquímicas que nós fazemos nas aulas com vocês. A LEITURA DA LISINA VAI SER MUITO IMPORTATE PARA A GENTE SEPARARA ALGUNS GÊNEROS, JUNTAMENTE COM A CITOCROMO OXIDASE.
Quem são esses gram-negativos não-fermentadores? Quando a gente fala de Pseudomonas aerug inosa aí dizem “eita, extremamente patogênica”, mas a gente vê que elas só demonstram essa patogenicidade toda, quando o organismo está im unodeprimido. Então eu não posso dizer que Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria que tem alto poder de virulência. Esses bacilo s gram-negativos não-fermentadores são aeróbios estritos, não esporulam, não utilizam carboidratos com fo nte de energia através do processo ferment ativo, mas sim por via oxidativa, tem baixa incidência em amostras ambulatoriais, cont udo em amostras de pacientes de UTI com recidiva de infecções é mais comum, são resistentes a vários antibióticos, a maioria apresent a baixo grau de v irulência por que a maior part e dessas bactérias não estão no corpo humano ( localizam-se mais em plantas, so lo, água) e por isso ocorrem principalmente em pacientes imunodeprimidos, são responsáveis por infecções nosocomiais, principalmente nas se pticemias, pneumonias, artrite sé ptica e feridas pós-operatória. Quando esse grupo se aproveita da baixa imunidade dos pacientes que estão hospitalizados, ele causa infecções gravíssimas como septicemias, meningite, bacteremia, et c., porque tem enzimas, fatores de v irulência que conseguem ultrapassar as barreiras que são resistentes no nosso corpo e ganhar a corrente sanguínea. 
Quais são os testes utilizados na identificação dos BGNNF? 
Prova de Fermentação/Oxidação 
Nessa prova eu sempre faço uma analogia com o TSI. O TSi foi formulado para a gente utilizar ou estudar a fermentação. Por isso que os microorganismos que são oxidantes dão reação negativa, justamente por que a fermentação é v ista através da m udança de coloração para am arelo. Como eles não são fermentadores, são oxidantes, vocês o bservam uma reação alcalina que é oriunda da utilização das peptonas, ficando na cor rosa. Já o meio que foi idealizado por Hugh e Leifso n vocês poderão observar tanto a fe rmentação c omo a oxidação porque ele modificou as quantidades de carboidratos e de peptonas, ou seja, entre a fonte de nitrogênio e a fonte de carbono. Eles aumentaram a fo nte de carbono para que fornecesse condições às bactérias que fo ssem oxidantes (de glicose, sacarose) fazerem isso, e diminuíram a fonte de nitrogênio. Esse meio foi fe ito primeiramente com glicose mas existem umas chaves de mic roorganismo n esse grupo que não necessariamente ut ilizam a glicose, podem utilizar carboidratos que não são comumente testados nas análises como arabinose, e aí você pode substituir nes se m eio para fazer e sse teste. Esse aumento de carboidrato foi idealizado para que o t este mostrasse a sua utilização, mesmo em micro-organismos que oxidam, coisa que a gente não vê no TSI. Se no TSI Alcalino/Alcalino tivesse como ver que o micro-organismo utilizou a fonte de glicose, ficaria amarelo, mas a gente não v ê, ent ão tem a necessidade de realizar esse tes te. Eles modificaram o substrato, modificou também o indicador de pH, já que, por saberem que estavam lidando com micro-organismos que oxidam carboidratos, iriam produzir ácidos mais fracos do que aqueles produzidos através da fermentação. No TSI o indicador de pH é o Vermelho de Fenol e no Meio de Hugh e L eifson é o Azul de Bromotimol. Para saber se esse micro-organismo utiliza a fonte de carbono mesmo na ausência de oxigênio eles propuseram vedar o tubo de ensaio com parafina ou com ó leo mineral, e isso bloqueia a difusão do oxigênio at ravés do meio de cultura. Se ele v eda e, me smo assim, o m icro-organismo em questão utiliza da fonte de carbono é porque ou é anaeróbio facultativo ou anaeróbio restrito. Então eles conseguiram separar os m icro-organismos que são realmente fermentadores dos oxidantes. Mas, depois de um tempo, eles descobriram que existia um grupo de bactérias denominadas não-sacarolíticas. Lembra que a ideia principal er a ut ilizar a glicose? Mas quando eles inocularam uma determinada bactéria no meio, ela não cresceu e aí denominaram não-sacarolíticas po rque utilizam fontes mais complexas, diferentes da glicose. Aí, quando coloca fontes de carbono nada a ver c om glicose, elas vão e degradam, i sso porque são bactérias adaptadas ao meio ambiente e nem sempre no me io ambiente elas en contram a molécula de glicose disponível e daí precisam degradar fontes bem mais complexas para utilizar a glicose. Não é que não utilizam glicose, eles utilizam, m as a busca por essa glicose vem de carboidratos complexos, como amido, celulose. A part ir disso eles v iram que poderia ter tipos diferentes de reações químicas e visualizações. 
Toda vez que forem preparar o meio de cultivo, deve inocular com o tubo aberto, sem a parafina ou o óleo m ineral, ou seja, o m eio vai es tar em c ontato com o ar. Deve-se inocular 2 tubos, um deixa aberto e o o utro, após a inoculação, fe cha com a parafina. O azul de bromotimol, no momento da inoculação, irá estar no pH próximo da neutralidade, que confere uma coloração verde ao meio. Se o m icro-organismo oxida o u fermenta a fonte de c arbono, que não será neutralizado pela utilização das peptonas presen tes no meio, necessário para o crescimento do micro-organismo, o meio vai ficar ácido e, portanto, amarelo devido ao indicador de pH.Mas ainda tem aqueles que não utilizam de jeito nenhum a fonte de carbono, mas pode utilizar a fonte de nitrogênio, e aí, nessa situação, pode-se observar uma colo ração azul, ou ainda não utilizar nada ou muito pouco da fonte de nitrogênio, e o m eio cont inuar verde. Uma dica para não confundir é lembrar da Prova do Citrato, que utiliza o mesmo indicador de pH, e quando utilizado o citrato há uma baixa do pH, mas logo e sse pH sobe devido a utilização do fosfato de amônio liberando grupamentos amina, alcalinizando o m eio, que fica azul. 
Tudo isso na parte de cima do s egundo tubo é parafina. Na parte de baixo houve a formação de b olhas. Isso é uma reação positiva de tubo fechado onde fo i utilizado a fonte de carbono e que acidificou o meio. Que tipo de micro-organismo é esse? Anaeróbio facultativo, pois formou ácido também me tubo aberto. Ele fermentou, formou gás, s ó não sabemos que tipo de gás é esse pois não há indicador para formação de Gás Sulfídrico, por exemplo. 
Nesse caso ele não cresceu em tubo aberto, só no tubo que tem parafina. Ou seja, só houve crescimento no tubo em c ondições de anaerobiose promovida pela parafina no fechamento do tubo. No tubo aberto não cresceu nada. Isso indica que são anaeróbios restritos, fermentadores da fonte de carbono. 
Nesse caso, não houve crescimento no tubo fechado com parafina, apenas no tubo aberto, inclusive com produção de gás. Então el e é aeróbio. Esse grupo de bactérias demonstradas nesse par de tubos são os Gram-negativos não-fermentadores. 
Nesses tubos não houve m udança de coloração. É característico do grupo de micro-organismo não-s acarolítico. Os tubos poderiam estar azuis também, e indicariam a mesma coi sa, diferindo apenas na coloração, que indica que houve a utilização da fonte de nitrogênio. 
Se e u perguntar “Quais são as diferenças m arcantes entre o meio de Hugh e Leifson e o TSI?” É a alteração da relação entre as fontes de c arbono e nit rogênio, onde no meio de Hugh e Leifson vai est ar aumentada a fonte de carbono e diminuída a fonte de nitrogênio; a utilização de vedação dos tubos com parafina/óleo m ineral; a modificação do indicador de pH que no TSI é o vermelho de fenol e no me io de Hugh e Lei fson é o azul de bromotimol; e o meio de Hugh e L eifson não utiliza apenas os 3 carboidratos que são utilizados no TSI, e le pode utilizar outras fontes diferentes desses açúcares.
Citocromo Oxidase
A prova para detecção da citocromo oxidase é idêntica à que é utilizada nos testes com a família Enterobacteriaceae, que é negativ a para esse teste. Quando dá negativa, vocês têm que prestar atenção na forma da colônia e no isolamento em MacConkey, porquê, quando ser ausente, vocês terão dois c aminhos: poderá ser um membro da f amília Enterobacteriaceae ou poderá ser algum gênero do grupo de BGNNF, por que nem todo s os B GNNF são citocromo oxidase positivo. Vocês terão que prestar atenção também na placa de isolamento, se a colônia tem coloração. Por exemplo, vo cê pode se deparar com um Acinetobacter: cresceu no M acConkey, mas aí no TSI deu Alcalino/Alcalino. Aí você já faz a citocromo oxidase, que dá negativa. Daí você já mata a charada dizendo que não se trat a de ser da família Enterobacteriaceae, é um membro do g rupo de BGNNF por conta do TSI Alcalino/Alcalino, mas ele não t em reação positiva para c itocromo o xidase. Já está mais do que sabido que essa prova pode ser feit a em fita, em swab, em disco, que a solução é de cloridrato de parafenilenodiamina à 0,5%. Essas fitas ou discos podem ficar oxidadas com o tempo ou mesmo, ficam cinzas, escuras, o que invalida o teste porquê você não v ai ter como saber se houve ou não positividade do teste, já que ela já está ox idada pelo ar e não pela bactéria. 
Para os BGNNF o número de provas bioquímicas é bem mais reduzido do que as provas para as bactérias da família Ent erobacteriaceae, já que há mais de um teste por tubo, como o SIM o u TSI por ex emplo. Quando v ocê descobre que é um BGNNF ex istem provas já direcionadas, mas a gente não pode esquec er que aqueles 6 t ubos já foram feitos e que eles 	servem para alg uma coisa, principalmente o TSI, o citrato de sódio, a ureia, mas que para fechar o diagnóstico, você t erá que fazer a citocromo oxidase e vai t er que fazer algumas provas que caracterizam esse poder invasor que são gelatinase e DNAse. A prova de motilidade deve ser repetida mesmo já tendo feito a do SIM, por que corre o risco de liberar o resultado como negativo. Todas as B GNNF v ão apresentar motilidade negat iva no SIM porque a maior parte delas ou é monotríquio (um flagelo) ou é lofotríquio (poucos flagelos e uma única extremidade). Para isso, para saber se são realmente móveis ou não, ex iste uma prova chamada Prova da Gota Pendente. 
 Existe uma lâmina de microscópio chamada lâmina escav ada. É uma lâmina m ais grossa do que a que comumente vemos, e que tem uma escavação circular no meio. Aí você vai pegar uma colônia, faz uma suspensão microbiana, pega uma got a da suspensão, coloca na lamínula e v ira a lamínula na lâmina es cavada de forma que onde a gota fo i colocada fique no centro da es cavação, como se fosse um sanduiche, e leva ao microscópio. A maior parte dos BGNNF são formadores de biofilme. Esse biofilme faz com que e xista entre as bactérias uma ligação que geralmente é promov ida por exopolissacarídeos. É dito prova da got a pendente, porque, devido ao biofilme, a gota não cai, e no m icroscópio v ocê vai visualizar m ovimentos circulares das bactérias no próprio eixo porque ela está “pendurada”, grudada na lamínula. Até na retirada da colônia para fazer a suspensão, já dá para notar a viscosidade na alça, do biofilme sendo formado. Até suspensão bacteriana fica meio viscosa. Se quando você visualizar a bac téria estiver fazendo movimentos circulares em t orno do próprio eixo, você sabe que ela é móvel. É diferente das bactérias no sumário de urinária, que aparecem em zig-zag. 
Essa prova da detecção da atividade da lisina ou arginina descarboxilase você lê no tubo de lisi na que você fez quando nem sabia se era BGNNF ou se era da família Enterobacteriaceae. Quando a ge nte tem con dições, já compra um kit para BGNNF, que vem todos os t estes. Esse grupo de bactérias tem um crescimento ótimo em 42 °C, e tem produção de gelatinase e DNAse que estão extremamente relacionadas ao seu poder invasor. 
Existe um meio de cultura específico para a es pécie Pseudomonas aeruginosa que é o Ágar Setrimida, só cresce essa espécie. Setrimida é uma substancia extremamente biocida para outros mic ro-organismos. Se tiver um TSI alcalino/alcalino, verificando que tem uma coloração verde, fazendo a oxidase que vai ser positiva, semeando no ágar setrimida, você mata a charada e já diz a espécie. 
Geralmente, quando a gente está nas análises clínicas, a gente nunca faz uma prova bioquímica sem um controle positivo e um cont role negativo. Geralmente esses controles são de uma cepa de correção, que se sabe tudo sobre ela: de onde foi isolada, como ela cresce, se ela tem genes específicos, se é multirres istenteou não. O que nós utilizamos para essas provas de lisina, de gelatinase e de DNAse é o controle positivo que é da American Type Culture Collection (ATCC) 27853. Esse número indica que essa bactéria, e ssa cepa de P seudomonas aeruginosa, é positiva esses testes que eu falei para poder comparar com o que você está fazendo. 
Gelatinase 
Para fazer esse teste você pode fazer de várias formas. Pode comprar a gelatina e fazer seu próprio m eio de gelatina v erificando se ela liquefaz. Se você faz o meio, inocula a bactéria e a gelatina liquefaz, é porque aquela bactéria tem a enzima gelatinase. Você observa isso quando o meio que era sólido (gelatina) para a ser liquido em um me io mais baixo do que a temperatura ambiente, geralmente eles mandam colocar a 4 °C, por que quando ela tem a gelatinase, mesmo em temperatura baixa, v ai haver a liquefação desse material, dando a certeza de que aquilo foi liquefeito pela bactéria e não pela temperatura. No kit quando a gente compra, é uma fitinha que tem uma base de alumínio e em cima dessa base fica o meio de gelatina. Então eles produzem em série v árias fitinhas des sa que são impregnadas com gelatina. É um aporte similar ao da crom atografia, diferindo apenas no que fica em cima da base, que no caso da cromatografia é sílica. A gen te vai pegar e ssa fita, colocar no tubo seco e aí prepara uma suspenção microbiana e coloca no tubo, inc ubando por 24h. No dia seguinte você vai verificar que: quando é negativo, fica do mesmo jeito, porque as fontes de nutrientes estão na gelatina, se ela não t em a gelatinase, não há ob tenção; quando é positivo, você já verifica através da t urbidez da suspenção que você tinha colocado, porque há o crescimento bacteriano devido à quebra da gelatina que tinha o s nutrientes para crescimento bacteriano. Essa suspensão que v ai ser colocada no tubo com a gelatina deve ser calibrada no espectofotômetro, não pode ser aleatoriamente não.
Lisida descarbixilase
A mesma coisa serve para o caldo lisina. O que a gente utiliza no teste com a família Enterobacteriaceae é o meio sólido. O caldo lisina também pode ser utilizado por que a descarboxilase ela é a mesma. Mesmo sendo um micro-organismo que é aeróbio, a gente está usando um caldo e está vedando. Porquê? Usa o caldo para que a bactéria tenha um contato mais amplo com o substrato e veda por que a atividade enzimática é maior quando há uma depleção do ox igênio, mesmo que o micro-organismo seja aeróbio. Essa vedação é feita com óleo mineral e não com parafina, por que com a parafina fica uma vedação m uito drástica, aí realmente vai haver a inibição do crescimento do micro-organismo. Aí o caldo vai ficar púrpura, vai voltar ao pH original, do mesmo jeito que acontece no outro.
DNAse
Aqui tem uma reação negativa para DNAse e outra positiva. Em torno do semeio há um halo de digestão, de hidrólise do DNA que est á presente no meio de cultura. É um meio comprado, e prepara c omo todos os outros. Ele pode vim com o m arcador, o azul de toluidina, onde el e fica t odo azul, ou o utro meio mais clarinho que voc ê vai ter que revelar o halo de hidrólise com uma solução de ácido clorídrico 1N. Quando você colo ca o ácido clorídrico, tudo o que é DNA que não foi digerido vai precipitar e o meio vai ficar opaco, e só a região que t eve a hidrólise vai ficar transparente. Quando maior o halo de digestão, maior a atividade da DNAse. Esse meio possui Caseína Enzimática Hidrolisada, D igestão Papaica de Farinha de Soj a como fonte de nitrogênio, ácido desoxirribonucleico ( DNA), cloreto de sódio e revela com o ácido c lorídrico. Essas provas bioquímicas não são exclusivas para bactérias gram-negativas. Você pode utilizar a DNAse, a gelatinase para identificar de outros micro-organismos que não tem nada a ver com BGNNF. 
Principais gêneros
Pseudomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Stenotrophomonas, Acinetobacter, Chryseobacterium, Ochrobactrum. Esses são os principais, m as há uma infinidade. Essa são as mais comuns de serem encontradas nos laboratórios de hospitais.
Principais espécies
Pseudomonas aeruginosa: infecções graves e fatais (80% a 90% dos isolados de BGNNF dos hospitais são dessa espécie), Acinetobacter baumannii, Burkholderia cepacia, Stenotrophomonas mal tophilia, Chryseobacterium meningosepticum: infecções graves e fatais (se no LCR v ier uma coloração amarelada, principalmente em crianças, desconfiar e ssa espécie), Achromobacter xylosoxidans, Achromobacter piechaudii, Ochrobactrum anthropi.
Qual é a divisão dos BGNNF? A divisão é através da enzima citocromo oxidase, e da motilidade e posição de flagelo s (polar ou peritríquio). A Stenotrophomonas possui cepas que são móveis e outras não. Essa oscilação de motilidade entre alguns gêneros v ai depender das cepas e das espécies trabalhadas. É cert o que para verificar a motilidade deve ser feit o o t este da gota pendente, e não apenas o t este de motilidade do meio SIM, que pode aparecer com motilidade negativa, principalmente se tiver flagelos po lares. Outra coisa que se pode comentar é que através da oxidase, se s ão positivos ou negat ivos, a gente já pode separar os grandes gêneros em que aparecem com mais frequência em hospitais.
Classificação dos mais comuns: 
Móveis, flagelos polares: Pseudomonas, Burkolderia, Stenotrophomonas, Ralstonia. 
Móveis, flagelos peritríquios: Alcaligenes, Achromobacter, Oligella. 
Imóveis, oxidase positivos Oligella, Flavobacterium, Chryseobacterium. 
Imóveis, oxidase negativos: Acinetobacter.
Gênero Pseudomonas
Uma coisa que nos c hama atenção é a separação de dois gêneros bacterianos: um que não aparece tanto na clínica, m as que aparece em lavradores principalmente; e o outro que aparece muito na clínica.
Dessas pseudomonas que c oloquei algumas que são mais evi dentes, que aparece com mais frequência, principalmente a P. aerug inosa. Eu disse na última aula que ela é uma bactéria produtora de muita sec reção, então ela está enquadrada como bactéria piogênica. Ela não é fermentadora porque o TSI aparece u Alcalino/Alcalino, aí faz a c itocromo ox idase que vai dar positiva, e ela é verde. Se voc ê ver que ela a colônia é verde, você encaminha essa amostra para o Ágar Setrimida que é o meio de seleção e crescimento única e exclusivamente para Pseudomonas aeruginosa. Se não crescer nada, não descarta a possibilidade de ser outro tipo de Pseudomonas, só não vai ser a espécie Pseudomonas aeruginosa. Você aproveita o teste de Lisina e Arginina (positiva) dos primeiros tubos feitos, antes mesmo de saber que era Gram-negativo não-fermentador, e ob serva se é colorida por que em algumas partes v ocê vai ver que elas não têm pigmento o u que es se pigmento é diferente do pigmento verde. 90% doscasos de Pseudomonas isolados em secreção, ponta de cateter, cirurgia, prót ese são da espécie Pseudomonas aeruginosa, então só haverá a necessidade de fazer o t este da gota pendente quando essa Pseudomonas isol ada não for da espécie Pseudomonas aeruginosa. Nesses casos vocês terão que lançar mão das leituras de lisina e arginina, bem como das outras em crescimento à 42 °C ( teste de gelatinase), e v erificar a produção dos pigmentos(pioverdina, piocianina, piorrubina ou piomelanina). Todas es sas pseudomonas produzem os mesmos pigmentos, mas por exemplo, a Ps eudomonas aeruginosa produz todos os pigmentos, mas o que a gente vê mesmo no m eio de c ultura é o pigmento verde, a pioverdina; já a P. fluorences possui a piocianina, piomelanina e a pioverdina, mas o t om de ver de completamente diferente. Elas possuem citocromo oxidase positiva, motilidade positiva apenas na got a pendente e arginina descarboxilase. O crescimento a 42 °C não vai servir como parâmetro determinativo para separar um gênero de o utro, pois v ários gêneros têm como temperatura ótima para crescimento 42°C. 
 Quais são as o utras que vocês podem isolar, diferente da Ps eudomonas aeruginosa? P. fluorences e P. putida. Só que a coloração delas no crescimento e no não c rescimento no Ágar Setrimida faz com que vocês proc urem ver se eles têm uma lisi na o u uma arginina diferente daquelas que v ocês fizeram no s primeiros tubos, porque todas essas v ão dar Citocromo Oxidase positiva. Então vocês irão atrás de coisas que diferenciem a Pseudomonas aer uginosa, de Pseudomonas fluorences ou Pseudomonas putida. Em relação à epidemiologia, a P. fluorences aparece me nos do que a P. putida. Como o nome já diz, ela tem um odor característico de putrefação; essa putrefação a gente vê muito nas descarboxilases, um odor que vem da pro dução dessas aminas voláteis. Se você faz o TSI (alcalino/alcalino) e o citocromo oxidase positivo, viu a coloração e jogou no ágar setrimida, pronto! Só se não crescer no cet rimida é que você v ai ter que investigar. É importante saber se é P. fluorences ou P. putida para a clínia? Não, por que no laudo vai constar apenas Pseudomonas spp. por que o tratamento é igual, mas se estiver fazendo pesquisa, tem que ir atéOs meios Ágar Sangue e Ágar Mac Conkey não são apropriados para o crescimento das pseudomonas, por que as pseudomonas não são bactérias de habitat intestinal, são bactérias das p lantas, da água. Então, quando faz o s emeio nesses meios de cultura, possa ser que algumas cepas fiquem inibidas, mas como ela t em m uitas enzimas que podem muito bem quebrar os sais biliares, fo nte rica de colesterol, e utilizá-los de várias formas, isso não seria um problema t ão grande. A gente diz que elas crescem de fo rma inibida porque esse m eio possui muito inibidores, para que o crescimento se restrinja a bac térias que habitam o intestino, então tem altas concentrações de sais biliares e tem outros inibidores como a eosina, o azul de metileno que servem como inibidor de cres cimento de Gram positivos e de toda bactéria que se diz fastidiosa (Neisseria, Moraxella, etc). Não é porque a bacté ria é Gram negativo que vai ser semeado e encontrado todos nesses me ios seletivos não. No ágar sangue é notável uma coisa bem interessante com as pseudomonas, que por ela ter uma série de enzimas, ela pode ter as hemolisinas. Então de cara vo cê pode encontrar uma β -hemólise. Lembrando que o tipo de hemólise é bem utilizado para a classificação de Steptococcus, m as o gênero Ps eudomonas tem s im uma série de en zimas que vai estar presente no ágar sangue. E esse pigm ento no ágar sangue vai ser m arrom, e não verde. A cor verde você só verá em um meio líquido ou em um meio ex tremamente clarinho. Vai ser marrom por que vai misturar a cor do meio com o pigmento que é extremamente hidrossolúvel e aí fica m arrom em torno da c olônia. Q uando comparado o diâmetro de crescimento das colônias no meio Ágar Sangue e no meio MacConkey, é perceptível que cresce m elhor no Ágar Sangue, po r isso que dito que c resce inibida no MacConkey. 
No Ágar MacConkey, os que são lactose positivas, se apresentam com uma precipitação cor-de-rosa em torno da colônia devido ao indicador de pH presente no meio (vermelho neutro). Elas vão utilizar a lactose como fonte de carbono de forma oxidativa, vão baixar o p H, mas não vai ser uma reaç ão tão exagerada como a que acontece com as Enterobacteriaceaes, como por exemplo a espécie Escherichia coli.
Você pode t er dois tipos de infecções causadas por Pseudomonas aeruginosa: as infecções adquiridas na comunidade, como uma fibrose cística pulmonar (pneumonia comunitária), uma foliculite e otite externa de nadadores, infecções oculares (perceptível rapidamente pela coloração da sec reção e do odor) até uma endocardite aguda em usuários de drogas ilícitas, principalmente das drogas injetáveis (uso de drogas baixa muito a imunidade e aí as Ps eudomonas se aproveitam disso e coloniza esse paciente. Se a droga for injetável, a bactéria pode e star formando um biofilme na ponta da agulha e ser inoculada diretamente na corrente sanguínea); e as infecções hospitalares, como as pneumonias (principalmente em pacientes com respiração artificial), se pticemias, bacteremia, infecções do trato urinário, infecções de feridas, inoculação direta por próteses, em cirurgias, por exemplo.
 No geral as Pseudomonas aeruginosa são bem resistentes a c ondições desfavoráveis pois no meio Ágar Setrimida ela cresce tranquilamente enquanto que nenhuma outra bactéria cresce. Esse meio possui m uitos inibidores t óxicos para as bactérias que não afet am tanto a Pseudomonas aeruginosa por possuir uma série de enzimas.
Acinetobacter spp.
A primeira coisa que v ocês v ão querer saber quando chegar a amostra é se é Gram negativo ou Gram positivo, e isso voc ê só vai saber fazendo a coloração de Gram e o bservando no microscópio. Quando vocês encontrarem cocobacilos Gram-negativos, com TSI alcalino/alcalino, fiquem atentos para indícios de BGNNF c omo Acinetobacter, Moraxella. Daí você vai prestar atenção na col ônia; se ela for colorida ou não. No caso do Acinetobacter, ela vai aparecer acinzentada no ágar sangue e no M acConkey vai crescer mais inibida do que a Pseudomonas. Se a prova da citoc romo oxidase for negativa, v ocê já fica esperando ser Acinetobacter, porque epidemiologicamente falando, é a segunda m ais frequente em infecções, perdendo apenas para Pseudomonas, então fica muito mais fác il você fazer o isolamento de Acinetobacter em um hospital, do que de Moraxella, por exemplo. O gênero Acinetobacter está classificado como ox idase e m otilidade negativa. Da s es pécies A. baumannii, A. calcoaceticus, A. haemolyticus, a mais prevalente n o caso de fazer um isolamento até encontrar uma espécie é o Acinetobacter baumannii; o Acinetobacter calcoaceticus é menos isolado, menos provável, do que o A. baumannii. Ele não é po sitivo para a citocromo o xidase, mas no meio de Hugh e Leifson, eles só crescem no tubo aberto, que fica amarelinho, indicando que é oxidativo e aeróbio.
Na prova do c itrato, o único que é negat ivo é o Acinetobacter baumannii. A catalase também é positiva para e ssa espécie, o que a diferencia do Acinetobacter calcoaceticus. Para fazer a catalase não pode pegar colônias iso ladas no meio Ágar Sangue, pois pode vim junto com a colônia um pouco do meio de cultura, e a catalase ser positiva devido à enzima presente nas hemácias; ent ão pode ser feito em colônias crescidas em TSA, Müller Hington, Set rimida. É gelatinase positiva. Não há c omo se confundir ent re os gêneros pela coloração:se a amostra vier e sverdeada é Pseudomonas, se vier amarelada é Stenotrophomonas, que é a terceira mais comum em infecções, e se não t iver nenhuma dessas c olorações voc ê já começa a pensar em Acinetobacter. Cresce bem no MacConkey, com lactose positivas, da mesma forma que a Pseudomonas, só que a Pseudomonas t ambém está lançando no meio o pigmento, coisa que não acontece com o Acinetobacter. O gênero Acinetobacter é resistente à penicilina. Já que são cocobacilos e você pode confundir com Moraxella, que também está nesse grupo bacteriano, e NÃO com Neisseria, o médico pode pedir um antibiograma, aí v ocê vai prestar a atenção se a bactéria é resistente ou não à penicilina. O t ratamento para Neisseria e para Moraxella são os β-lactâmicos. Se no antibiograma ele se m ostra resistente ao disco de penicilina G, e é cocobacilo Gram-negativo, TSI alcalino/alcalino, c itocromo ox idase negativo, sem precipitação em torno da c olônia, sem coloração v erde ou amarela, você vai pensar que é Acinetobacter; se quiser fazer a catalase pode fazer, mas é tão bestinha e saber a espécie não influencia em nada no tratamento, então você pode para por aí e soltar o resultado como Acinetobacter spp.
A distribuição, como um todo, se dá no solo, na água e em alguns alime ntos. Te m resistência à dissecação, m uito embora não é esporulada, mas el a está no solo e no solo há uma m icrobiota diversa que produz várias enzimas e isso é importante, por que quando ela atinge um nível de c olonização no corpo hum ano ela começa t ambém a ter uma resposta par a biossíntese de uma s érie de enzimas para degradar os substratos que ela encontra: hialuronidases, desaminases, fo sfatases, tudo isso para destruir as células e obter um substrato rico para crescimento. Infecções desse tipo são difíceis de serem debeladas quando encontradas no s angue ou no LCR por que fazem um estrago celular m uito grande. As es pécies mais comuns são Acinetobacter calcoaceticus e Acinetobacter baumannii e e las es tão associadas com pneumonias associadas a vent ilação mecânica, septicemias, bacteremia, tudo o que é grave. Infecções de pele e de feridas, geralmente naqueles pacientes imunocomprometidos e que têm ferida de decúbito, e aí nessas feridas de decúbito você tem a contam inação ext erna ou m esmo durante a manipulação. O paciente vai ter que ser manipulado por paramédicos e/ou enfermeiros e ocorre a contaminação direta por que existe um campo aberto para que ela ganhe a corrente sanguínea.
Se durante o isolamento apareceu no MacConkey ou no Ágar Sangue colônias amarelas, vocês vão pensar que pode ser Burkolderia, ou S tenotrophomonas ou Chryseobacterium. Como separar? A primeira coisa a ser feit a é a oxidase. Na ox idase, você vai ver essa oxidase não vai ser rápida, c omo acontece com a Pseudomonas e com o Acinetobacter; vai ser lenta para Burkolderia e Stenotrophomonas. Mas você vai prestar atenção também de onde está vindo essa amostra, já que tanto Stenotrophomonas como Burkolderia não são muito isoladas na clínica. Elas aparecem, mas não são muito isoladas, então se vocês t iverem no ágar sangue umas colônias amarelas e que tem certeza que é Gram negativa, c om TSI alcalino/alcalino, você v ai pensar nessas três. Você já tem uma lisina. 93% é positivo para S tenotrophomonas maltophilia. Aí você po de se deparar com o s outros 7% de negativa? Pode (Pelo que eu entendi, lisina é positiva em 93% nes sa espécie, mas pode acontecer de dar negativo e continuar sendo e ssa espécie; é raro mais acontece). E essas enzimas, se o paciente est iver fazendo an tibioticoterapia, ela pode ser alterada, principalmente as descarboxilases, mas faz a leitura. Faz a leitura porque não existe só essas bactérias que e stão envolvidas, elas e stão com maio r intensidade, m as não só e las. Se fo r feito uma DNAse e for positiva, provavelmente a gelatinase também será positiva, então você escolhe uma o u outra. M as o mais importante mesmo é quando chegar no antibiograma: a polimixina e o imipenem, carbapenêmicos utilizados durante o tratamento, e que será obrigatório inserir no antibiograma, por que v ocê separa o complexo Burkolderia do Stenotrophomonas. Polimixina B é um antibiótico de amplo espectro retirado do Bacillus polymyxa, que é ex tremamente tóxico, mas que é a última dro ga de escolha na clínica quando todas as out ras não dão sensibilidade, por que essa bactéria já tem, intrinsecamente, resistência a vários antibióticos, haja vista que a pol imixina é produzida por um bacilo que vive no solo juntinho delas, então para o bacilo sobreviver foi nec essário criar antibióticos que agisse contra certos tipos de bactéria.
Você deve prestar atenção ao tipo de colônia, porque existem colônias cremosas, umas maiores out ras me nores, o tom do amarelo, porque o amarelo da Stenotrophomonas é pálido, já o amarelo da Burkolderia é um amarelo ouro, parecido com o do Staphylococcus aureos.
Chryseobacterium
Oxidase positiva. Veja, o outro era lento, fic a positivo, mas lentamente, já essa vai dar rapidamente. No Indol, tanto Chryseobacterium meningocepticum como a Chryseobacterium indologenes são indol positivo. Eles colocaram porque um a delas a C. indologenes, é produtora mesmo de indol. Se você fizer o indol do Chryseobacterium meningocepticum e do Chryseobacterium indologenes, o anel v ermelho no SIM é muito maior. A DNAse, no Chryseobacterium meningocepticum po r ser extremamente patogênico, obviamente vai dar positiva, porque ele t em que atravessar a barreira hematoencefálica. Se fossemos classificar, o Chryseobacterium meningocepticum é muito mais patogênico do que o Chryseobacterium indologenes. A polim ixina v ai ser boa para separar a Burkolderia da Stenotrophomonas, mas não vai ser interessante para o Chryseobacterium.
Quando o TSI for alcalino/alcalino, quais testes reaproveitar: as descarboxilases, o citrato, a ureia e o indol, por que dependendo da citocromo que você fizer, você vai para as chaves que precisar desses t estes. Você faz o isolamento, 24h depois faz a leitura do TSI, 24h depois você vai s aber que ele é um Gram negativo não fermentador e já faz a citocromo oxidase. Se a colônia for amarel a, você já faz a DNAse também, Hoektoen, ureia, c itrato, e faz o antibiograma. No antibiograma, você tem que se ligar que esse antibiograma deve ter penicilina, polimixina e imipenem; só que se ela for realmente amarela, você diretamente olha a penicilina. No CLSI tem dizendo “bac térias isoladas de hemocultura, com pigmento amarelo, TSI alcalino/alcalino” e nessa part e, ele descreve uma série de antibiót icos que você deve colocar no antibiograma: polimixina imipenem, coagulonatos, fluoroquinolona, enfim , t udo o que fo r de am plo espectro. Enfim, gente o protocolo é esse c omo para to dos, isolamento em meio não seletivo e em meio seletivo, realização dos testes bioquímicos, coloração de Gram, outras provas bioquímicas, no caso de BGNNF e se eles t iverem pigmento amarelo, você já se liga nessas 3 Burkolderia, Stenotrophomonas e Chryseobacterium. C laro que a chance de ser Chryseobacterium meningocepticum é muito alta no liquido cefalorraquidiano.Quando vocês se depararem com um TSI alcalino/alcalino, lembrar de encubar na temperatura ótim a de c rescimento. Essas bactérias não são da mic robiota do organismo, são do ambiente, o nde as t emperaturas tendem a ser um pouco m ais altas. Então, quando for encubar, colocar numa temperatura em torno de 42°C, que ajudará as bactérias a se reproduzirem.
Stenotrophomonas maltophilia
São bacilos mesmo, não cocobacilos, Gram negativos, com c rescimento à 42 °C. Citocromo oxidase nem sempre negativa. Uma c oisa interessante na identificação, é que se comprar um kit comercial, deve prestar atenção no O/F glicose e no O/F m altose, onde ela é negativa no O/F glicose e produtora de ác idos no O/F maltose. Caso você não tenha esses kits, não tem problema, é só prestar a at enção naquelas chaves de identificação que eu falei: tipo de coloração, lisina, arginina, citocromo oxidase, e principalmente a polimixina, o im ipenem e o DNAse, que vocês se param os três. Se eu perguntasse na prova “A partir do isolamento primário no M acConkey, a bactéria cresce de forma inibida, mas com a coloração am arela. Quais as prováveis bactérias e quais as provas vocês fariam para diferenciar os gêneros?”.
Algumas amostras sintetizam pigmento amarelo, mas nem todas. A exacerbação desse pigmento acontece quando o paciente ainda não começou o tratamento, ou quando o tratamento parou de fazer efeito. Aí o paciente começ a a entrar em falência. M uitas vezes, essa pigmentação só aparece no final das et apas de identificação, já lá no antibiograma. Quando o paciente já es tá bem imunodeprimido e com a an tibioticoterapia sem fazer efe ito é que as colorações dessas colônias aparecem, por que e sses pigmentos ficam inibidos c om o uso dos antibióticos. São lisina descarboxilase positivas.
É a terceira espécie mais frequente em isolados. Não sei se vocês perceberam, mas essas bactérias sempre são iso ladas de situações complicadas, como pneumonias, bacte remia e infecções de ferida de cirurgia, líquido cefalorraquidiano, hemoculturas, punção de líquidos estéreis. Eles são naturalmente re sistentes à aminoglicosídeos, penicilinas, imipenem, fluoroquinolonas. Então, quando forem fazer o antibiograma, v ocês não colocarão e sses antibióticos já que eles são naturalmente resistentes, claro que vocês terão a tabela do CLSI do lado, m as já sabem! Geralmente não existe monoterapia para esse tipo de microorganimo; o que fazem são associações de vários antibióticos.
Moraxella catarrhalis 
Faz parte da microbiota normal do trato respiratório superior, mas quando ela migra para os brônquios, para os pulmões, aí complica. Quando o paciente está em ventilação mecânica o u imunodeprimido por vários fatores, ou por uma doença de base, aí pode haver essa m igração. Comparando com o Acinetobacter, pode confundir quando o Gram não é bem feito, ou até mesmo com as características da colônia na placa. Nos sinos e no trato respiratório superior há muitos Streptococcus, Staphylococcus, então po de confundir com bactérias que são realmente cocos; então como diferenciar? Através de uma coloração de um Gram bem feito, pigmentos precipitados, fazer um bom esfregaço, e observar o arranjo nas lâminas, que são bem diferentes dos arranjos dos Staphylococcus e dos Str eptococcus. Muitas vezes a amostra vem tão densa que a coloração não fica bem-feita, então as vezes é necessário fazer uma diluição em soro fisiológico para remover o excesso de m uco que vem junto com a amostra, e aí fica mais fácil a visualização e a coloração fica bem melhor.
Ele cresce bem em ágar sangue (bordas regulares, côncava, fosca, coloração variando de branco à bege) e mal em ágar MacConkey, mas esse mal é que elas crescem bem diminutas, parece um a areia que fo i soprada no meio. Se não prestar atenção mesmo, não percebe que há a formação de colônias. Geralmente essa visualização se dá quando a placa é observada contra a luz ou com o uso de uma lupa. Esse c rescimento é m uito diferente do cre scimento de um Acinetobacter, Stenotrophomonas. 
Como ela é isolada do trato respiratório inferior ou das sinusites, otites, e do pulmão; é diferente daquelas que são isoladas de do enças mais graves, com bacteremia. Ela pode ser encontrada nesses sít ios mais graves, mas só se elas m igrarem para lá, mas é bem mai s difícil. Você tem que se ligar no citrato (que é positivo para Moraxella) e principalmente na penicilina, porque o Acinetobacter, que é meio acinzentado no ágar Sangue, mas cresce mal no MacConkey (em comparação com a Moraxella catarrhalis, ela cresce muito melhor, d á para visualizar as colônias, mas ainda assim é inibida) é resistente à penicilina, e é justamente isso que separa o Acinetobacter da Moraxella; tem que se ligar também de onde ele é isolado. O citrato não é tão importante na identificação do Acinetobacter, o mais importante é a catalase, mas isso quando vo cê já sabe que é Acinetobacter. 
Como já havia dito, a Moraxella faz parte da m icrobiota do trato respiratório superior, pode causar bronquite, broncopneumonia em pacientes com doença pulmo nar crônica, sinusite, o tite. São sens íveis à penic ilina, eritromicina, tetraciclina, sulfazotrim e clavulanatos. Se v ocê fizer, por exemplo, amoxilina e ácido clavulânico, aí vai ser positivo; a penicilina vai ser positivo também.
REPETINDO MAIS UMA VEZ NESTA TRANSCRIÇÃO SOCORRO M EU DEU S ELA NÃO LEMBRA O QUE FALA
Para identificação de BGNNF 
Quando você faz a coloração de Gram, você vai descobrir que são bastonetes que são Gram negativos. Aí vai isolar a amostra em um m eio que cresc e tudo e em um meio que é seletivo para a família Enterobacteriaceae. Nes se meio você pode não t er um crescimento satisfatório e isso pode ser uma diferenciação. Com a colô nia isolada, você faz os testes bioquímicos, principalmente o TSI, prestando atenção ao resultado dele . Se for alcalino/alcalino, ele já vai entrar no grupo dos BGNNF.
1) TSI alcalino/alcalino 
2) Crescimento inibido no MacConkey 
3) Citocromo oxidase 
4) Coloração das colônias 
5) Sítio de coleta do material