Artigo sobre Licopeno - 06

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Revista Brasileira de Ciências Farmacêuticas
versão on-line ISSN 2175-9790
Braz. J. Pharm. Sci. vol.51 no.3 São Paulo jul./set. 2015
http://dx.doi.org/10.1590/S1984-82502015000300010
ARTIGOS
Desenvolvimento e avaliação de uma emulsão contendo licopeno para combater a aceleração do envelhecimento da pele
Letícia Caramori Cefali 1
Tatiana Maria Souza-Moreira 1
Marcos Antônio Corrêa 1
Hérida Regina Nunes Salgado 1
Vera Lucia Borges Isaac * 1
1 Laboratório de Cosmetologia, LacCos, Departamento de Drogas e Medicamentos, Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, UNESP, Araraquara, SP, Brasil
ABSTRATO
O licopeno, um antioxidante carotenóide e potente, é encontrado em grandes quantidades nos tomates. O licopeno combate doenças, como doenças cardiovasculares e diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de próstata. No entanto, seu uso tópico em forma de emulsão para o combate ao envelhecimento da pele é pouco explorado. O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma emulsão contendo licopeno extraído de tomate salada e avaliar sua citotoxicidade, estabilidade, comportamento reológico, atividade antioxidante e permeação fitocosmética. O cosmético desenvolvido compreendeu uma fase oleosa composta por derivados da manteiga de carité e foi avaliado quanto à estabilidade físico-química, espalhabilidade, análise térmica, comportamento reológico, qualidade microbiológica, citotoxicidade, atividade antioxidante, permeação e retenção cutânea. Os resultados demonstram que este fitocosmético é estável, apresenta comportamento reológico satisfatório para uma fórmula tópica e é um produto promissor no combate ao envelhecimento da pele.
Palavras-chave: Carotenóide / atividade antioxidante; Licopeno / emulsão / citotoxicidade; Licopeno / emulsão / permeação; Licopeno / emulsão / reologia; Licopeno / emulsão / análises térmicas; Fitocosméticos; Envelhecimento da pele / tratamento
RESUMO
Licopeno é um carotenóide com grande atividade antioxidante encontrada em grande quantidade de tomate e usado no combate a doenças cardiovasculares e diferentes tipos de cânceres, incluindo o câncer de próstata. O objetivo deste trabalho foi desenvolver uma emulsão com extrato de licopeno com cobertura de tomate e avaliar a citotoxicidade do extrato, a estabilidade, o comportamento reológico, a atividade antioxidante e a permeação do fitocosmético. O cosmético foi desenvolvido em fase oleosa contendo derivados de Karité e submetido à avaliação físico-química, dispersibilidade, análise térmica, comportamento reológico, qualidade microbiológica, citotoxicidade, atividade antioxidante e testes de permeação e retenção cutânea. Os resultados demonstram que o fitocosmético é estável, apresenta um comportamento reológico desejável para uma formulação tópica e é um produto promissor para ser utilizado no combate à aceleração do cutâneo.
Palavras-Chave: Carotenóide / atividade antioxidante; Licopeno / emulsão / citotoxicidade; Licopeno / emulsão / permeação cutânea; Licopeno / emulsão / reologia; Licopeno / emulsão / análise térmica; Fitocosméticos;Envelhecimento cutâneo / tratamento
INTRODUÇÃO
O licopeno é um carotenóide natural usado para combater doenças, como doenças cardiovasculares e diferentes tipos de câncer, incluindo câncer de próstata ( Shami, Moreira, 2004 ). É encontrado principalmente no tomate, mas também é apresentado no mamão, goiaba e melancia (Shami, Moreira, 2004; Sentanin, Amaya, 2007 ). Também pode ser consumido com outros compostos ativos para uma ótima função em humanos ( Kong et al., 2010 ).
O licopeno carotenóide é um potente antioxidante com atividade pró-vitamina A e é mais eficaz contra o oxigênio singlete, que é potencialmente a mais perigosa espécie reativa de oxigênio gerada na pele após exposição à luz solar ( Giacomoni, 2007 ).
Fórmulas cosméticas antioxidantes ou fitocosméticos são comumente usados ​​para combater o envelhecimento da pele, e muitos desses produtos contêm pelo menos uma substância com esse propósito ( Isaac, 1998 ; Giacomoni, 2007). A fim de proporcionar ação antienvelhecimento satisfatória por meio da atividade antioxidante, a fórmula deve ser estável e permitir a liberação efetiva do princípio ativo na pele (Giacomoni, 2007).
A determinação do comportamento reológico de uma fórmula auxilia na avaliação de sua natureza físico-química e permite a detecção de sinais precoces de instabilidade física, bem como o controle de qualidade dos componentes, fórmulas de teste e produtos finais ( Barry, 1993 ). Os produtos cosméticos também podem ser submetidos a análises térmicas, que podem ser aplicadas à medição de propriedades físicas, estudo de reações químicas, avaliação da estabilidade térmica, determinação da composição química dos materiais e desenvolvimento de uma metodologia analítica ( Faria, et al ., 2002 ; Guillen et al. , 2006 ). Testes de permeação cutânea podem ser realizados usando métodos in vitro . O sistema de difusão de células Franz permite a avaliação da permeação ou retenção de compostos ativos em uma fórmula ( Alencastre, et al ., 2006 ; Franz, 1975).
O objetivo do presente estudo foi desenvolver uma emulsão contendo licopeno extraído de tomate salada e avaliar sua atividade antioxidante para combater a aceleração do envelhecimento da pele. A estabilidade da fórmula foi determinada através de ensaios de centrifugação, testes acelerados e preliminares para estabilidade físico-química, espalhamento e análise térmica, e análises de comportamento reológico, qualidade microbiológica e permeação e retenção cutânea. O extrato de licopeno também foi submetido a testes de citotoxicidade para avaliar sua segurança.
MATERIAL E MÉTODOS
Material
O padrão de referência de licopeno (pureza atribuída 90,0%) foi fornecido pela Sigma-Aldrich. A emulsão foi realizada utilizando matérias-primas (manteiga de karité, manteiga de karité líquido, Sheabutterate oleoso, manteiga de manteiga de karité PEG-23 e glicéridos de manteiga de karité PEG 75) doados pela empresa Ion-Química. O extrato de licopeno foi obtido por tomate salada (adaptado para Nune, Mercadante, 2004).Hidroxitolueno butilado (BHT), propilparabeno, metilparabeno, ácido etilenodiamina tetracético (EDTA), propilenoglicol, goma xantana, carbómero, trietanolamina, 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH), resazurina, tripsina, clorofórmio, isopropanol, tampão fosfato , ágar polissorbato 80, tioglicolato e ágar Sabouraud, ágar xilose-lisina-desoxicolato, ágar bismuto sulfito, MacConkey ágar, Vogel e Johnson ágar e cetrimida ágar foram fornecidos pelas empresas Galena, PharmaSpecial, Lubrizol, Sigma-Aldrich, Interlab e Synth. O padrão de referência de vitamina C (pureza atribuída a 99,0%) também foi fornecido pela Sigma-Aldrich. Acetato de etila, acetonitrila e metanol apresentaram grau de HPLC e foram fornecidos pela empresa Merck.
Desenvolvimento de uma emulsão contendo extrato de licopeno
Uma emulsão óleo-em-água (O / A) foi desenvolvida com: manteiga de karité (1,2%), sheabutterato de oléo (0,8%), manteiga de karité PEG-23 (1,5%), imidazolidinil uréia (0,1%), BHT (0,02 %), propilparabeno (0,02%), metilparabeno (0,18%), EDTA (0,02%), propilenoglicol (4%), goma xantana (0,15%), carbómero (2% de dispersão) (25%), trietanolamina (qs pH 6,0) e Aqua (água) (qsp 100%). A emulsão O / A foi preparada usando o método padrão. A 75 ° C a fase aquosa foi transferida para a fase oleosa a 75 ° C e a agitação manual foi realizada até a emulsão ter arrefecido. O extrato de licopeno obtido de salada de tomate (35,6 µg / mL de licopeno no extrato) (adaptado de Nunes, Mercadante, 2004 ) foi incorporado diretamente na emulsão em uma concentração de 0,1% usando o método de diluição geométrica. O fitocosmético teve uma concentração final de licopeno de 0,58 mg em 100 g de amostra.
Testes de estabilidade
Antes dos testes de estabilidade, 5 g de fórmula foram submetidos a três ciclos de centrifugação a 3000 rpm por 30 minutos / ciclo a 27 ± 2 ºC ( Brasil, 2004 ; Idson, 1993 a, b). Seguindo o Brasil (2004) e Isaac etal. (2008), as preparações foram armazenadas a 5 ± 2 ºC, 45 ± 2 ºC, -5 ± 2 ºC, à temperatura ambiente (27 ± 2 ºC), expostas à luz indireta e submetidas à avaliação macroscópica, pH, densidade e testes de viscosidade ao longo de 15 dias consecutivos (teste preliminar de estabilidade) e superior a 90 dias para o teste de estabilidade acelerada (ensaios realizados nos dias 1, 7, 14, 21, 30, 45, 60, 75 e 90). Para os ciclos de congelamento e descongelamento, as amostras foram submetidas a condições extremas de temperatura, alternando entre 24 horas a alta temperatura (45 ± 2 ºC) e 24 horas a baixa temperatura (-5 ± 2 ºC) durante 12 dias consecutivos.A variação nos resultados não deve exceder 10% e os ensaios foram realizados em triplicata (Brasil, 2004).
Para a avaliação macroscópica, foram avaliados cor, fragrância, aparência da emulsão e separação. O pH foi determinado preparando uma dispersão aquosa a 10% (p / p) da amostra em água recentemente destilada, utilizando um medidor digital de pH. O eletrodo foi inserido diretamente na dispersão aquosa ( Davis, 1977 ). Um valor compatível com o pH da pele (5,5 a 6,5) foi considerado aceitável nos testes de estabilidade e as variações nos resultados não devem exceder 10%. Os ensaios foram realizados em triplicata (Brasil, 2004). A densidade foi determinada usando um picnômetro vazio e um picnômetro contendo 5 mL da amostra. A densidade foi calculada como a diferença entre as massas dos picnômetros completo e vazio, dividido pelo volume da amostra (Farmacopeia, 2010). A variação nos resultados não deve exceder 10%. Os ensaios foram realizados em triplicata (Brasil, 2004).
O ensaio para a determinação da viscosidade das emulsões submetidas aos ensaios de estresse foi realizado utilizando ensaio de curva de fluxo reológico, com os seguintes parâmetros: taxa de variação variando de 0 a 100 s- 1 para a curva ascendente por 120 segundos e de 100 para 0 s -1 para a curva descendente também por 120 segundos. O reograma foi avaliado quanto à viscosidade (Pa.s) em relação à taxa de cobertura. O teste foi realizado em triplicata a 25 ± 1 ºC ( Cefali, et al ., 2009 a) e a variação nos resultados não deve exceder 10% (Brasil, 2004).
Determinação da quantidade de licopeno incorporado na emulsão
A quantidade de licopeno incorporado na emulsão foi determinada pela dissolução de alíquotas de 400 mg do fitocosmético das cinco condições de estresse a que foi submetido em um sistema de solvente composto de clorofórmio e isopropanol (1: 1, v / v) (Isaac, 1993) e transferi-lo para frascos de 5 mL para uma concentração final de licopeno de 0,4 µg / mL. Os valores foram analisados ​​usando cromatografia líquida de alta performance (HPLC) (Waters 1525- Binary HPLC Pump), acoplada a um detector de absorbância (Waters 2487). O programa de software Empower foi usado. O licopeno foi identificado utilizando uma coluna de fase reversa ( C18 ) com a fase móvel de acetonitrilo / metanol / acetato de etilo numa proporção de 48:26:26 (v / v / v) durante 5 minutos a um caudal de 1,0 mL / min e o comprimento de onda utilizado foi de 472 nm (adaptado de Nunes, Mercadante, 2004). Os ensaios foram realizados em triplicado.
Determinação de spreadability
A determinação da espalhabilidade do fitocosmético foi realizada em triplicata, medindo-se a mudança de diâmetro da amostra em milímetros após um minuto de ser englobado dentro de duas placas de vidro com uma placa de vidro de 200 g posicionada no topo. O procedimento foi repetido introduzindo placas adicionais de 200 g em intervalos de um minuto ( Knorst, 1991 ), atingindo um peso máximo de 800 g na amostra.
Determinação do comportamento reológico
O comportamento reológico foi avaliado utilizando um reômetro HAAKE, sensor cone / placa (C35 / 2º Ti) e os dados foram analisados ​​com o programa Rheowin 3.5. O comportamento reológico completo foi determinado usando ensaios de curva de fluxo com taxas de variação de 0 a 100 Pa / s para a inclinação ascendente por 120 segundos e de 100 a 0 Pa / s para a inclinação descendente por 120 segundos. A tensão na qual a amostra exibiu fluxo limitado (submetido a deformação) foi determinada através do teste de rampa de tensão limite de fluxo com uma faixa de tensão de 0 a 10 Pa por 120 segundos (Isaac et al ., 2013a). Testes de varredura de tensão e freqüência foram realizados para analisar a viscosidade dinâmica (η) e o módulo de estocagem (G) da amostra.Para o teste de varredura de tensão, foi utilizado um intervalo de tensão entre 0 e 100 Pa e frequência de 1 Hz.O teste de varredura de freqüência foi realizado utilizando uma faixa de freqüência de 0,01 a 100 Hz a uma tensão de 1 Pa. Assim, determinou-se o módulo elástico (G ') e o módulo viscoso (G ") ( Chiari, et al. , 2009 ; Isaac et al. , 2013b) O ensaio de fluência e relaxamento foi realizado para determinar a viscoelasticidade da amostra usando uma tensão de 1 Pa por 300 segundos para fluência e 300 segundos para relaxamento (Cefali, et al.,2009a; Isaac e cols. . , 2013b) Todos os ensaios foram realizados em triplicata, a 25 ± 0,5 ºC, utilizando aproximadamente 1 g de amostra para cada teste.
Análise térmica
O fitocosmético foi submetido à análise de calorimetria exploratória diferencial (DSC) e termogravimetria (TG) utilizando o sistema de análise térmica TA-4000 em triplicata. A massa da amostra foi de 7,4mg, e uma palheta de alumínio com tampa perfurada foi usada para a análise de DSC. A taxa de aquecimento foi de 10 ° C / min numa atmosfera de N2, utilizando um intervalo de temperatura de 30 a 600 ± 1 ° C. A análise de TG exigiu uma palha de platina, massa de amostra de 6,31 mg e taxa de aquecimento de 10 ºC / min em atmosfera de N 2 , com faixa de temperatura de 30 a 900 ± 1 ° C (Faria, et al., 2002; Guillen, et al., 2006; Ribeiro, Morais, Eccleston ,2004 ).
Avaliação da atividade citotóxica in vitro
O teste de citotoxicidade in vitro foi realizado utilizando alíquotas do extrato contendo licopeno. J774 macrófagos e fibroblastos CCL-60 foram adicionados para determinar o índice de citotoxicidade ou viabilidade. A concentração do extrato variou de 200 a 1,56 μg / mL. O método consistiu na coleta de macrófagos por raspagem e fibroblastos por tripsinização (0,25% de tripsina e 0,53 mM de solução de EDTA). As culas foram contadas utilizando corante de Turk, ajustadas para uma concentrao de 1 x 10 5 culas / mL de meio de cultura. As células em cada suspensão foram incubadas em diferentes microplacas de 96 poços a 37 ± 2 ° C em atmosfera com 5% de CO 2 por 72 h ( Ohno, Miyajima, Sunouchi , 1998 ; Takahashi et al., 2008 ). Quinze miligramas de solução aquosa de resazurina (0,1 mg / mL) foram então adicionados, e as microplacas foram incubadas durante 3 h a 37 ± 2 ºC numa atmosfera com 5% de CO2. Vinte miligramas de solução de DMSO / meio (1: 5; v / v) sem células em uma sequência de poços de microplaca foram usados ​​como controle negativo. Uma solução contendo apenas células vivas sem extrato foi usada como controle positivo. Os resultados foram determinados visualmente pela diferenciação entre as cores azul (ausência de células vivas) e rosa (presença de células vivas) (O'brien et al.,2000) bem como com o auxílio de um leitor de fluorescência (Spectra Fluor Plus - Tecan) com filtros de 530 e 590 nm, utilizando o programa Magellin para a análise. Os ensaios foram realizados em triplicado.
Controle microbiológico
Um grama de amostra foi diluído em 9 ml de solução tampão fosfato, pH 7,2. Um mL dessa solução foi pipetado, diluído e adicionado a 20 mL de ágar tioglicolato para bactérias e Sabouraud para leveduras em placas de Petri, que foram posteriormente incubadas a 35 ± 2 ° C por 24 horas e a 25 ± 2 ° C por sete dias para o exame do crescimento de bactérias e fungos, respectivamente. Para o estudo de Salmonella sp, Escherichia coli, Staphylococcus aureus e Pseudomonas aeruginosa , as amostras diluídas foram espalhadas em ágar xilose-lisina-desoxicolato, ágar sulfito de bismuto, ágar MacConkey, ágar Vogel e Johnson e pratos contendo ágarcetrimida.As placas foram incubadas a 35 ± 2 ºC por 24 horas e as características das colônias avaliadas (Farmacopéia, 2010; Pinto, Kaneko, Ohara , 2003 ; USP 36, 2013). Os ensaios foram realizados em triplicado.
Permeação da pele
Para o teste de liberação, necessário para determinar a liberação de licopeno da emulsão (Alencastre et al.,2006; Sasson, 2006 ), membranas sintéticas de celulose (Millipore, 0,45 μm) foram colocadas nas células de difusão em contato com o receptor. meio (7 mL de tampão fosfato, pH 7,2 e contendo 2 mM de polissorbato 80).Duzentos miligramas da amostra foram colocados nas membranas. Para o teste de permeação cutânea, a pele da orelha de porco foi obtida no frigorífico Olho D'agua, na cidade de Ipua, estado de São Paulo. Todas as orelhas, incluindo o cabelo, foram limpas e dermatomizadas imediatamente após a aquisição. As peles foram mantidas a uma temperatura de -5 ± 2 ° C e usadas após 24 h. A pele da orelha de porco dermatomizada foi colocada nas células de difusão com a derme em contato com o mesmo meio receptor. Duzentos miligramas da amostra foram colocados no estrato córneo. Esses experimentos foram realizados a 37 ± 2 ºC e a solução receptora foi constantemente agitada a 300 rotações por minuto (rpm). O meio receptor foi coletado após 2, 4 e 8 horas, e a concentração de licopeno foi determinada através de HPLC, utilizando as mesmas condições descritas anteriormente.
No final da experiência, as amostras de pele foram removidas das células de difusão, o excesso de fórmula foi removido com água destilada e as amostras foram secas com papel absorvente. Os espécimes foram fixados em uma superfície plana e a área de retenção para a remoção do estrato córneo foi delimitada. O estrato córneo foi removido pelo método de decapagem, que consiste em 12 cortes usando fita adesiva (3M (r)) . A primeira remoção removeu a fórmula em excesso na pele e foi descartada. Os restantes 11 segmentos foram transferidos para tubos de ensaio contendo 4 mL de metanol e agitados num agitador durante um minuto. Os tubos foram então sonicados durante 15 minutos num banho de ultra-sons. O sobrenadante foi analisado usando HPLC. As amostras de pele sem o estrato córneo foram cortadas com tesoura e transferidas para tubos cônicos contendo 4 mL de metanol, e então sonicadas por 30 minutos. A solução final foi analisada quanto à quantidade de licopeno retido na epiderme e na derme utilizando HPLC. Todas as expericias foram realizadas em quadruplicado utilizando a emuls base como controlo em branco.
Atividade antioxidante in vitro do licopeno incorporado ao fitocosmético
Diferentes concentrações da amostra foram colocadas em tubos de ensaio, seguidas da adição de solução de 1,1-difenil-2-picrilhidrazil (DPPH) (concentração: 0,004%). O ensaio foi realizado com o fitocosmético (0,5 g) dissolvido em 5 mL de solução solvente composta de clorofórmio e isopropanol (1: 1) (Isaac, 1998). A absorbância foi medida usando uma solução de metanol e DPPH como controle negativo e metanol e emulsão sem licopeno como controles vazios a 531 nm usando espectrofotometria UV / VIS. Na presença de licopeno, a intensidade de absorvência a 531 nm diminuiu e a percentagem de inibição (% de inibição) foi calculada usando a Equação I (adaptada de Cuendet, Hostettmann, Potterat, 1997 ). O experimento foi realizado em triplicata.
Equação I:% de inibição = ((A Max - A Test) / Amax). 100
A Max é a absorbância do radical livre na ausência da amostra e o teste A é a absorbância do radical na presença da amostra.
Análise estatística
A análise estatística foi realizada pelo teste t de Student ( P <0,05) para variáveis ​​independentes e o programa utilizado foi o programa Microsoft Excel versão 2000.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Desenvolvimento de fitocosméticos
Como os agentes espessantes proporcionam um alto grau de estabilidade às emulsões O / A, as concentrações de emolientes e emulsificantes à base de carité usados ​​foram baixas, resultando em uma emulsão menos oleosa e uma sensação não oleosa após a aplicação.
A emulsão base obtida tinha uma aparência uniforme, branca, brilhante e inodora e foi escolhida para os testes subsequentes. Após ter sido submetida a três ciclos de centrifugação, a emulsão base apresentou estabilidade, determinada pela falta de separação das fases até 24 horas após a preparação, sendo, portanto, escolhida para o desenvolvimento do estudo.
O processo para a elaboração do fitocosmético foi realizado de forma lenta, com cuidado para evitar a perda do extrato. A fórmula final tinha uma aparência uniforme, inodora e brilhante e coloração amarelada devido à presença do extrato.
Teste de estabilidade
Durante os testes preliminares de estabilidade não foram detectadas alterações na aparência no fitocosmético. A coloração, no entanto, mudou quando a emulsão foi submetida ao forno, à luz e ao ciclo de congelamento / descongelamento. Essa mudança de cor pode ter ocorrido na faixa de temperatura de -5 ºC a 45 ºC.
O fitocosmético apresentou pH estável com valor médio de 5,85 ± 0,21, compatível com o da pele. Sob todas as condições, as medidas diárias de pH do fitocosmético tiveram um desvio padrão inferior a 0,21, o que representa uma variação muito pequena (menor que 0,02) ( P < 0,05) e demonstra estabilidade da fórmula. A manutenção da densidade é um parâmetro importante que influencia a estabilidade de uma fórmula. O fitocosmético demonstrou estabilidade com um valor de densidade medido de 1,0037 ± 0,14 g / cm 3 e, sob todas as condições, as medidas diárias de densidade apresentaram um desvio padrão inferior a 0,01% ( P < 0,05).
A viscosidade é um dos parâmetros físico-químicos avaliados durante o teste de estabilidade de produtos cosméticos e envolve o estudo das propriedades de fluxo de um líquido ( Braseq, 2014 ; Brasil, 2004). No presente estudo, os valores de viscosidade aumentaram significativamente quando o fitocosmético foi exposto a uma temperatura de 45 ± 2 ° C. A viscosidade variou de 5394,3 ± 0,22 Pa.s à temperatura ambiente até 6647,6 ± 0,36 Pa.s (desvio padrão igual a 20,44%) ( P > 0,05) e a 6382,0 ± 0,31 Pa.s (desvio padrão igual a 15,47%) ( P> 0,05) durante o ciclo de congelamento / descongelamento. O aumento da temperatura levou à evaporação da água, aumentando assim a viscosidade. Assim, o fitocosmético não deve ser armazenado em alta temperatura.Os valores de viscosidade apresentados foram obtidos quando o fitocosmético foi submetido à menor taxa de cisalhamento (0,005 ± 5 s -1) e a menor tensão de cisalhamento (23 ± 5 Pa) para determinar a viscosidade da emulsão em condições de repouso próximo. Semelhante a um material com comportamento não newtoniano, a viscosidade da amostra diminuiu com o aumento da tensão aplicada.
Os valores de consistência (K H ) e comportamento do escoamento (n H ) foram obtidos pelo modelo reológico de Herschel-Bulkley, que foi o modelo mais adequado para curvas de viscosidade de terços, com coeficiente de variação de 0,99. A consistência da emulsão aumentou quando foi submetida a condições de estresse e ao longo do período de avaliação, levando a um aumento da viscosidade, que foi pronunciada a 45 ºC. Os resultados do comportamento do fluxo revelaram valores menores que 1, classificando a amostra como tendo comportamento não newtoniano e pseudoplástico, e as condições de estresse não alteraram esse comportamento.
Os resultados do teste preliminar de estabilidade revelaram que a incorporação do extrato de licopeno alterou a cor da emulsão e sua viscosidade foi afetada pela exposição a altas temperaturas. A amostra também sofreu uma mudança de cor quando exposta à luz indireta. Portanto, é importante que o fitocosmético seja armazenado longe da luz e do calor.
Durante o teste de estabilidade acelerada, nem a aparência nem o aroma do fitocosmético se alteraram. No entanto, no teste preliminar, o produto teve uma coloração amarela intensa. O pH do fitocosmético permaneceu estável (5,90 ± 0,32), com desvio padrão <0,10 ( P < 0,05). Com base nos resultados apresentadosaté o momento, o fitocosmético apresentou considerável estabilidade, e a presença do extrato não alterou significativamente o pH da fórmula.
O fitocosmético apresentou estabilidade em relação à densidade (1,0035 ± 0,16 g / cm 3), com pouca variação observada entre os dias de avaliação e com valores de desvio padrão menores que 0,10% ( P <0,05).
Como no teste preliminar, a viscosidade do fitocosmético durante o teste de estabilidade acelerada aumentou significativamente quando exposta a 45 ± 2 ° C, de 5477,0 ± 0,35 Pa.s para 7396,3 ± 0,22 Pa.s (desvio padrão igual a 28,64%) ( P > 0,05), como o aumento da temperatura levou à evaporação da água, aumentando assim a viscosidade. Os valores de viscosidade apresentados durante o teste de estabilidade acelerada foram obtidos quando o fitocosmético foi submetido à menor taxa de cisalhamento (0,0052 ± 5 s -1) e menor tensão de cisalhamento (22 ± 5 Pa) para determinar a viscosidade da emulsão próxima condições de repouso. Como material com comportamento não newtoniano, a viscosidade diminuiu com o aumento da tensão aplicada. Os valores de consistência (K H ) e comportamento do escoamento (n H ) alcançaram um coeficiente de variação de 0,99, conforme observado no teste preliminar.
Os resultados do teste de estabilidade acelerada revelaram que a incorporação do extrato de licopeno alterou a cor da emulsão e sua viscosidade foi afetada pela exposição a altas temperaturas, como observado no teste preliminar. A amostra também sofreu uma mudança de cor quando exposta à luz indireta. Portanto, é importante que o fitocosmético seja armazenado longe da luz e do calor.
Determinação do teor de licopeno na emulsão
A concentração de licopeno na emulsão foi de 0,59 ± 0,22 µg / mL, mas quando exposta à luz indireta e a 45 ± 2 ºC, a concentração de licopeno diminuiu significativamente para 0,43 ± 0,14 µg / mL e 0,39 ± 0,18 µg / mL, respectivamente, com variação de> 10% ( P > 0,05) após o dia 90 ( Figura 1 ). O conteúdo de licopeno foi encontrado para ser semelhante ( P <0,05) nas outras condições. O licopeno pode sofrer oxidação devido à exposição à luz e ao calor, e o fitocosmético deve ser armazenado longe da luz e do calor para evitar a degradação.
FIGURA 1 - Determinação do teor de licopeno em emulsões submetidas a condições de estresse em 90 dias.
Determinação do spreadability
A capacidade de espalhamento foi avaliada submetendo o fitocosmético a incrementos sucessivos de peso e a distensão foi determinada medindo o diâmetro resultante da amostra. A área da amostra foi de 2521,94 ± 0,33 mm 2 quando foi submetida aos primeiros 200 g de peso, e esse valor aumentou com o aumento do peso, atingindo uma área máxima de 4819,17 ± 0,28 mm 2 . Os valores de espalhamento (r = 0,99935) mostraram linearidade, pois o aumento de peso ou tensão aplicado na amostra foi diretamente proporcional à sua espalhabilidade. A curva analítica obtida apresentada na Equação II, com um valor de R 2 de 0,9987.
Equação II: y = 757,31x + 1788,5
Este estudo também foi realizado com a emulsão base, que apresentou área de 2642,01 ± 0,32 mm 2 quando submetida a 200 g, com aumento da área acompanhando o aumento de peso, atingindo uma área máxima de 4860,27 ± 0,45 mm 2 (Cefali et al. al ., 2009a). Estes valores são semelhantes aos obtidos com o fitocosmético, sem diferenças significativas ( P <0,05), indicando que o extrato não afetou a espalhabilidade da emulsão.
Determinação do comportamento reológico
A análise do comportamento reológico determina se uma amostra exibe comportamento newtoniano ou não-newtoniano, se o fluido é plástico, pseudoplástico ou dilatante, se exibe tixotropia e se tem comportamento viscoelástico.
A curva de fluxo revelou que o fitocosmético apresentou características não newtonianas, uma vez que a amostra sofreu deformação quando submetida ao teste de tensão de cisalhamento e não apresentou viscosidade constante. A emulsão também foi caracterizada como tixotrópica, pois a amostra sofreu redução na viscosidade com cisalhamento e área de histerese de 658,7 ± 0,11 Pa / s ( Figura 2 ). A tixotropia está relacionada à deformação de uma amostra quando submetida à tensão, com maior tixotropia, indicando maior deformação da amostra e maior espalhabilidade do produto quando aplicado na pele. Após a aplicação, uma emulsão tixotrópica recupera sua viscosidade, evitando o gotejamento. Além disso, um produto tixotrópico tende a ter uma vida útil mais longa, pois exibe viscosidade constante durante o armazenamento, o que dificulta a separação dos componentes da fórmula ( Martin, 1993 ).
FIGURA 2 - Curva de fluxo da emulsão com extrato de licopeno.
O ensaio de limite de fluxo é um teste que determina a tensão necessária para uma amostra começar a fluir. O fitocosmético exibiu deformação quando a tensão de cisalhamento foi de 0,04919 ± 0,52 Pa após 5,91 ± 0,11 segundos do início do teste, demonstrando assim que o produto deforma rapidamente após ser submetido à tensão ( Figura 3 ) (Isaac et al., 2013a).
FIGURA 3 - Curva de tensão de rendimento da emulsão com extrato de licopeno.
O comportamento elástico e viscoso da amostra também foi avaliado para determinar se a amostra era mais viscosa ou elástica e até que ponto recupera sua elasticidade após a cessação da tensão de cisalhamento (Ribeiro, Morais, Eccleston , 2004). O teste de varredura de tensão foi realizado antes dos testes de viscoelasticidade para determinar os valores de tensão de cisalhamento nos quais a amostra não sofreu deformação dentro de uma faixa de linearidade. Na faixa de 0 a 5 Pa, a amostra não sofreu deformações, pois os valores de G ', G "e viscosidade (η) mantiveram-se lineares nesta faixa de tensão de cisalhamento ( Figura 4 ). Essa faixa de valores foi então utilizada na amostra. varredura de frequência e testes de fluência / relaxamento.
FIGURA 4 - Teste de tensão de varredura da emulsão com extrato de licopeno. Gráficos de G '(◊), G "(■) e viscosidade (▲) com estresse.
Estudos realizados por Chiari et al. (2009) e Zambon et al. (2009) demonstraram que as emulsões com o espessante carbomer (2% de dispersão) em concentrações superiores a 20% apresentaram linearidade em G ', G "e viscosidade com valores de cerca de 1Pa, similares aos observados para os fitocosméticos analisados No presente estudo.
A varredura de frequência determina o G '(módulo de armazenamento) e G "(módulo de perda) de uma fórmula. O fitocosmético apresentou um valor G' maior que G 'e a viscosidade diminuiu com o aumento da tensão de cisalhamento ( Figura 5 ). Comportamento típico de amostras viscoelásticas Quando um material viscoelástico exibe um módulo de armazenamento ou elasticidade maior do que o módulo viscoso ou de perda, a energia de tensão é armazenada temporariamente durante o teste e pode ser recuperada posteriormente, geralmente em sistemas de emulsão O / A. O teste também revelou que a faixa de freqüência em que a cruz G 'e G ", mostrada na Figura 5 , que é conhecida como faixa de crossover, tinha dois pontos, demonstrando que não houve mudança no comportamento da fórmula durante o teste de cisalhamento .
FIGURA 5 - O teste de varredura de frequência da emulsão com extrato de licopeno. Gráficos de G '(◊), G "(■) e viscosidade (▲) com frequência.
O último teste realizado foi o texto de fluência / relaxamento, que determina a viscoelasticidade de uma amostra.O comportamento viscoelástico é caracterizado por deformação quando uma amostra é submetida a uma dada tensão e pela recuperação de sua estrutura elástica quando a tensão cessa, facilitando a disseminação durante a aplicação tópica. Esse comportamento foi observado no fitocosmético analisado, pois a amostra resistiu à tensão necessária para o escoamento e recuperou sua elasticidade quando cessou a tensão cisalhante ( Figura 6 ).
FIGURA 6 - Teste de fluência / relaxamento da emulsão com licopeno.
O comportamento reológico completo da emulsão base foi avaliado da mesma forma que o dos fitocosméticos (Cefali, et al., 2009b) e resultados semelhantes foramalcançados. Assim, a presença do extrato de licopeno não alterou o comportamento reológico da fórmula.
Análise térmica
Ensaios de análise térmica foram realizados, como métodos calorimétricos, permitindo a medição de alterações nas propriedades químicas e / ou físicas de uma amostra em função da temperatura. DSC e TG foram realizados.O primeiro é um método de análise térmica que registra o fluxo de energia térmica associado a transições em materiais em função da temperatura e o último mede a variação em massa durante o aquecimento de uma amostra ( Casimiro, et al., 2005 ).
O DSC revelou um pico endotérmico a 109 ± 0,25 ºC, que é atribuído à fusão e evaporação dos componentes da fórmula ( Figura 7 ). Quando submetido a TG, o fitocosmético sofreu decomposição térmica em três etapas - a primeira a 95,5 ± 0,15 ºC, a segunda a 536 ± 0,12 ºC e a terceira a 804 ± 0,09 ºC, com perdas amostrais de 85,55%, 97,78% e 98,16%. respectivamente ( Figura 8 ).
FIGURA 7 - Calorimetria exploratória diferencial (DSC) da emulsão com licopeno.
FIGURA 8 - Análise termogravimétrica (TG) da emulsão com licopeno.
Assim, a análise térmica revelou que tanto o licopeno quanto os demais componentes da emulsão eram estáveis ​​até a temperatura de 109 ºC. A preparação deste produto e outras emulsões devem ser realizadas a temperaturas inferiores a 100 ºC, a fim de evitar a evaporação e a consequente degradação dos compostos.
Segundo Almeida, et al. (2010) , as análises TG / DTG e DSC são importantes ferramentas utilizadas para caracterizar o perfil térmico de materiais, como vitaminas e cremes, e podem ser utilizadas para análises de rotina em laboratórios de controle de qualidade em indústrias cosméticas.
Controle microbiológico
O controle microbiológico é de extrema importância no desenvolvimento de cosméticos. No fitocosmético, não houve crescimento de microrganismos patogênicos específicos, como Salmonella sp , Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus aureus (Farmacopeia, 2010; Pinto, Kaneko, Ohara, 2003; USP 36, 2013). A contagem total desses microrganismos foi inferior a 10 UFC de bactérias, fungos e leveduras em cada grama da amostra ( Tabela I ), demonstrando a ausência de microrganismos patogênicos (Farmacopeia, 2010; Usp 36, 2013).
TABELA I - Controle microbiológico de fitocosméticos
	Microorganismos
	Recomendação (Farmacopéia, 2010)
	Resultados*
	Bactérias aeróbicas
	10 3 a 5x10 3 CFU / g
	Não exceder a 10 CFU / g
	Fungos e leveduras
	10 3 a 5x10 3 CFU / g
	Não exceder a 10 CFU / g
	Pseudomonas aeruginosa
	Ausência
	Ausência
	Salmonella sp
	Ausência
	Ausência
	Staphylococcus aureus
	Ausência
	Ausência
	Escherichia coli
	Ausência
	Ausência
* Mídia entre as leituras da árvore ( P <0,05).
Avaliação da atividade citotóxica in vitro
Para a determinação da citotoxicidade do extrato de licopeno, a coloração da resazurina foi utilizada para identificar a existência de células vivas (cor rosa) e células mortas (cor azul). Todos os poços contendo o extrato exibiram uma cor rosa, demonstrando a presença de células vivas. Assim, o extrato não apresentou citotoxicidade para as linhagens de macrófagos e fibroblastos analisados, e a maior concentração testada (200 µg / mL) não atingiu 50% no índice de citotoxicidade.
Teste de permeação
Após o teste de liberação, o líquido receptor foi coletado e analisado por HPLC para a determinação e quantificação do licopeno liberado da fórmula. A presença de licopeno não foi identificada em nenhum dos momentos em que foram coletadas alíquotas (2, 4 e 8 h). Algumas substâncias podem ser impedidas de serem liberadas de uma fórmula devido à incompatibilidade ou baixa solubilidade do líquido receptor (tampão, pH 7,2).Entretanto, foram obtidos resultados positivos em relação aos testes de retenção de pele que demonstram que o licopeno foi liberado, pois a solução tampão solubilizava o princípio ativo quando em contato com a pele do porco.As membranas sintéticas são usadas no teste de liberação porque é possível detectar somente a liberação do ingrediente ativo ao invés de sua retenção, o que ocorreria usando qualquer tipo de pele, humana ou animal (Alencastre et al., 2006; Sato, Sugibayashi, Morimoto , 1991 ). Assim, embora o teste de liberação tenha dado resultados negativos, foram realizados testes de permeação e retenção da pele no estrato córneo e epiderme / derme.
A pele da orelha de porco é largamente usada em testes de permeação e retenção porque simula a pele humana (Sato, Sugibayashi, Morimoto, 1991) e Klang, et al. (2012) confirmaram que a orelha porcina é um excelente modelo in vitro para experimentos de fita adesiva em comparação com testes in vivo em pele humana, usando diferentes formulações tópicas.
Segundo Schueller, Romanowski (2000) , a emulsão é o sistema de liberação tópica farmacêutica mais utilizado, pois permite o transporte rápido e conveniente de diversas substâncias. O tipo de emulsão [óleo-em-água (O / W) ou água-em-óleo (A / O)] deve ser considerado, pois pode influenciar a liberação, permeação e retenção de substâncias ativas na pele. Alencastre et al. (2006) descobriram que a emulsão A / O proporcionava maior penetração de vitamina E nas formas livre e encapsulada na pele de porco. Paleco et al . (2014) investigaram o uso potencial de microagulhas e sua combinação com micropartículas lipídicas (LMs) carregadas de quercetina, como um sistema para melhorar a permeabilidade dos flavonóides através da pele, usando testes de liberação e permeação in vitro com orelhas de suínos e concluiu que a combinação proposta de microagulhas com LMs poderia ser uma estratégia de entrega eficaz para administração tópica de quercetina.
No presente estudo, alíquotas da solução receptora e sobrenadante dos testes de retenção no estrato córneo e epiderme / derme foram coletadas automaticamente após 2, 4 e 8h e analisadas por HPLC. O licopeno incorporado na emulsão O / A não permeou a pele de porco, mas foi retido na epiderme / derme após 4 (0,0131 ± 0,32μg / ml) e 8h (0,0373 ± 0,41μg / ml). Este resultado é desejável, uma vez que um grande número de reações oxidativas causadas pela radiação UV ocorrem na epiderme e na derme viáveis, e é nesta região que o licopeno pode remover os radicais livres e reduzir a formação de rugas.
O presente estudo demonstra que a aplicação freqüente deste fitocosmético pode aumentar a concentração de licopeno na pele e proporcionar o efeito antienvelhecimento desejado. A contribuição deste estudo de permeação in vitro para a avaliação das propriedades farmacocinéticas da fórmula e do desenvolvimento farmacotécnico é clara, uma vez que é prática, rápida e barata. No entanto, deve-se ter cautela ao extrapolar os resultados para situações in vivo , uma vez que a metodologia in vitro constitui uma seleção preliminar de fórmulas antes da realização de testes clínicos (Sato, Sugibayashi, Morimoto, 1991).
Atividade antioxidante in vitro do licopeno em cosméticos
No teste de atividade antioxidante, o fitocosmético apresentou remoção de radicais livres, pois a absorbância foi de 0,755 ± 0,005 para o DPPH em contato com a emulsão sozinha (sem licopeno) e 0,607 ± 0,02 para o DPPH em contato com o fitocosmético, correspondendo a 19,51% de inibição.
A inibição de radicais livres induzida por fitocosméticos não foi significativa, mas demonstra a ação in vitro do licopeno incorporado na fórmula cosmética. Com o uso diário do fitocosmético, o conteúdo de licopeno pode aumentar se for retido na pele e pode atingir uma concentração suficiente para inibir ou evitar a ação de radicais livres. Assim, o fitocosmético desenvolvido é uma fórmula promissora para combater o envelhecimento da pele.Não foram encontrados dados na literatura sobre a atividade antioxidante in vitro de substâncias incorporadas em emulsões que pudessem ser comparadas com os resultados do presente estudo.
CONCLUSÃO
O presente estudo demonstra que o fitocosmético é estável, exibe comportamento reológico satisfatório para uma fórmulatópica, e que o extrato de licopeno não é citotóxico. O fitocosmético tem atividade antioxidante e permite a retenção do ingrediente ativo na pele. Assim, o fitocosmético é um produto promissor para combater o envelhecimento da pele.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem à agência brasileira de fomento CNPq pelo apoio financeiro e à Ionquímica pela doação dos agentes emolientes e de consistência à base de carité e Richard Boike, de língua inglesa, e à editage enterprise para verificação do manuscrito.
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Recebido em 25 de junho de 2014; Aceito: 10 de março de 2015
* Correspondência: Vera Lucia Borges Isaac. Laboratório de Cosmetologia - LaCos. Departamento de Fármacos e Medicamentos. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Universidade do Estado de São Paulo - UNESP. Av.Jabaquara-Jaú, Km 1, s / n - 14801-902 - Araraquara - SP, Brasil. E-mail: letisc82@yahoo.com.br;veraisaac@fcfar.com.br
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