DETERMINAÇÃO DE PROTEINA PELO MÉTODO DE KJELDAHL pronto

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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE - UNESC
CURSO DE FARMÁCIA
CLAYTON BORGES
CRISPIM INÁCIO
GISLIANI CARNIATO FELTRIN
DETERMINAÇÃO DE PROTEINA PELO MÉTODO DE KJELDAHL
CRICIÚMA, MAIO 2018
CLAYTON BORGES
CRISPIM INÁCIO
GISLIANI CARNIATO FELTRIN
DETERMINAÇÃO DE PROTEINA PELO MÉTODO DE KJELDAHL
Relatório apresentado à disciplina de Bromatologia do curso de Farmácia - Unesc
Professor: Miqueli L. Padula
CRICIUMA, MAIO 2018
SUMÁRIO
1	INTRODUÇÃO	3
2	OBJETIVO	4
3	REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS	5
4	MATERIAIS E MÉTODOS	8
4.1	MATERIAIS	8
4.2	REAGENTES	9
5	PROCEDIMENTO	10
6	RESULTADOS E DISCUSSÃO	11
REFERÊNCIAS	15
INTRODUÇÃO
 As proteínas são determinadas avaliando-se o nitrogênio total da amostra pelo Método de Kjeldahl. O termo proteína bruta (ou total) envolve um grande grupo de substâncias com estruturas semelhantes, porém, com funções fisiológicas diferentes. Baseado no fato de as proteínas terem porcentagem de nitrogênio quase constante, em torno de 16%, o que se faz é determinar o nitrogênio e por meio de um fator de conversão (fator geral = 6,25), que é calculado tomando como base o valor médio de 16% de nitrogênio contido na maioria das substâncias, transformando o resultado em proteína bruta. 
 No Método de Kjeldahl determina-se o nitrogênio contido na matéria orgânica, incluindo o nitrogênio protéico propriamente dito e outros compostos nitrogenados não-protéicos, tais como: aminas, amidas, lecitinas, nitrilas, aminoácidos. Neste caso o resultado será dado como proteína bruta (ou total). Há uma pequena inexatidão no uso do fator de 6,25 nos produtos complexos. Dependendo da proporção, o uso do fator de 6,25 poderá resultar em um teor maior ou menor de proteína, entretanto, enquanto não houver acordo entre os pesquisadores o fator 6,25 continuará a ser usado para qualquer fórmula alimentar.
OBJETIVO
 Determinar a quantidade de proteína usando o método de Kjeldahl, que consiste em três etapas, sendo elas: digestão, destilação e titulação da amostra, onde usa-se o percentual de nitrogênio que é constante para calcular a quantidade de proteína através de uma conversão de valores por meio do fator de correção .
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
 O método foi proposto por Kjeldahl na Dinamarca em 1883, quando estudava proteína em grãos. O método original sofreu algumas modificações e adaptações, porém sempre se baseia em três etapas: digestão, destilação e titulação. Apesar disso, continua sendo ainda o mais utilizado na determinação de proteína, por ser uma técnica confiável.(VOGEL,1992).
 O método é baseado na decomposição da matéria orgânica através da digestão da amostra a 400ºC com ácido sulfúrico concentrado, em presença de sulfato de cobre como catalisador que acelera a oxidação da matéria orgânica. O nitrogênio presente na solução ácida resultante é determinado por destilação por arraste de vapor, seguida de titulação com ácido diluído (NOGUEIRA e SOUZA, 2005). 
 O procedimento modificado do método baseia-se no aquecimento da amostra com ácido sulfúrico para digestão até que o carbono e o hidrogênio sejam oxidados. O nitrogênio da proteína é reduzido e transformado em sulfato de amônia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberação da amônia dentro de um volume conhecido de uma solução de ácido bórico, formando borato de amônia. O borato de amônia formado é dosado com uma solução ácida (HCl) padronizada. 
No método original, a amônia liberada da amostra é recolhida em ácido padronizado, na modificação, o recolhimento é feito em excesso de ácido bórico. O borato de amônia formado é que será titulado comum ácido padronizado. Essa modificação é vantajosa no sentido de que será necessária somente uma solução padronizada. Nem a quantidade (cerca de 50mL) nem a concentração (cerca de 4%)de ácido bórico necessitam ser precisas.(CECCHI,2003).
 O método de Kjeldahl tem várias vantagens como, ser aplicável a todos os tipos de alimentos, é relativamente simples, não é caro, é preciso e, além disso, trata-se de um método oficial para a determinação de proteínas. Porém, apresenta desvantagens, mede Nitrogênio orgânico total, não apenas nitrogênio de proteínas, levando à superestimação do conteúdo proteico; é demorado, é menos preciso que o método do biureto, e utiliza reagentes corrosivos. 
 Um dos métodos alternativos para a realização do ensaio da proteína é o método do Formol que é mais rápido e mais prático, embora menos rigoroso e não é considerado um método de referência (DIAS, A. M. C., 2010). 
 Deste modo, muitos laboratórios optaram por realizar a determinação da proteína através deste método pelas razões enumeradas anteriormente. 
O fundamento do método de formol foi determinado no inicio deste século e os mecanismos de reação foram exaustivamente estudados e elucidados desde então (BEZZERRA.etal,2008).
 O método do formol é baseado em uma titulação ácido-básica, onde é feita a medição dos prótons liberados pela reação do formaldeido com os grupos amino das cadeias laterais das proteínas, após previa neutralização com álcali (NaOH) (BEZZERRA et al, 2008). 
 Para OLIVEIRA, SEGHETO eFURTADO (2006), este método é de grande relevância por apresentar baixo custo, rápida execução e aplicabilidade à realidade das indústrias de laticínios. 
 As proteínas são compostos frágeis para serem titulados diretamente com compostos alcalinos, quando o formol é adicionado, reage com os grupos amina (NH2) para formar o metileno-amino (-N = CH2) e o grupo carboxila fica então disponível para a titulação (BELTRAN et al,1990).
Além disso, as proteínas (que têm carácter ácido) no leite reagem com o NaOH fazendo um maior volume utilizado na titulação, o que pode proporcionar um valor mais elevado do teor de proteínas consequentemente um resultado com um erro associadosuperior.(DIAS,A.M.C.,2010).
 Vários trabalhos foram realizados com a intenção de comparar os resultados obtidos simultaneamente pelos métodos de Kjeldahl e formol; uma vez que o primeiro é considerado pelo método de referência, mas apresenta alguns inconvenientes (citados anteriormente), e o segundo consiste de técnica analítica, simples e rápida, bastante fácil de executar, empregando material comum em laboratórios de controle de qualidade. (SILVA,1995).
 As proteínas alimentares são aquelas que apresentam fácil digestão, são atóxicas, adequadas no aspecto nutricional, funcionalmente utilizáveis em produtos alimentícios, disponíveis em abundância e cultiváveis por agricultura sustentável. (BELTRAN et al, 1990). 
 O procedimento mais utilizado para a análise de proteína é a determinação de um elemento ou grupo que pertence à proteína, a conversão realizada para a proteína é através de um fator. Os elementos mais comumente analisados são o carbono ou o nitrogênio, e alguns grupos são os aminoácidos e as ligações peptídicas (CECCHI, 2003).
 A determinação de proteína pelo método de Kjeldahl determina o teor de nitrogênio de origem orgânica. Isso implica que o nitrogênio proveniente de outras fontes, tais como ácidos nucléicos, alcalóides, lipídeos nitrogenados, carboidratos nitrogenados, porfirinas ou pigmentos nitrogenados, está entrando no cômputo total. Esses, no entanto, são geralmente componentes menores, e o método de Kjeldahl continua como o método químico mais útil para a determinação de proteína. Como o teor de nitrogênio dos diferentes tipos de proteína é aproximadamente o mesmo (em torno de 16%), pode-se multiplicar a porcentagem de nitrogênio total encontrado pelo fator de 6,25 para obter a porcentagem de proteína na amostra (CECCHI, 2003).
 MATERIAIS E MÉTODOS
A partir do método realizado em laboratório, utilizaram-se os seguintes materiais e o seguinte método:
MATERIAIS
 Tubos digestorespara macro Kjeldahl 
 Bureta de 50 mL com suporte 
 Erlenmeyeres de 250 mL 
 Provetas de 50 mL 
 Bastão de vidro 
 Espátula 
 Capela
 Bloco digestor 
 Destilador 
 Agitador magnético
 Balança semi-analítica 
 Amostra: Batata frita Slice (Teor de proteína teórica: 5,6 %)
 REAGENTES
Ácido sulfúrico (H2SO4) concentrado (d= 1,84 e 98%) 
 Catalisador misto (sulfato de potássio, dióxido de titânio e sulfato de cobre) 
 Ácido clorídrico (HCl) 0,1 N (d= 1,19 e 37%), padronizado 
 Hidróxido de sódio (NaOH) 40% (em escamas 76%, ou pérolas 96%, P.A.) 
 Ácido bórico (H3BO3) 4,0% (p/v) 
 Verde de bromocresol 0,1% em álcool 
 Vermelho de metila 0,1% em álcool
 Água destilada
 PROCEDIMENTO
1ª etapa: Digestão da amostra 
Pesaou-se cerca de 1 g da amostra e colocou-se dentro do tubo digestor, adicionou-se 5 g do catalisador misto e acrescentou-se 20 mL de ácido sulfúrico concentrado cuidadosamente.Tampou-se o tubo e conctou-se ao aparelho de digestão. Fechou-se a saída de gás que não foi utilizada, para isto utilizou-se a rolha de borracha número 2. Então ligou-se o aparelho digestor na temperatura inicial de 150°C e deixou-se nesta temperatura durante 1 hora. Após uma hora os técnicos elevaram a temperatura para 420°C, deixaram nesta temperatura cerca de 4-6 horas. Solicitou-se a ajuda dos técnicos, pois não tínhamos tempo suficiente em aula para realização de toda primeira parte.
2ª etapa: Destilação da amostra
Após a primeira etapa os tubos já encontravam-se resfriados então adicionou-se cuidadosamente ao tubo digestor 50 mL de água destilada, agitaou-se com o auxílio de um bastão de vidro até que ocorresse a dissolução da amostra. Em seguida, conectou-se o tubo ao destilador de proteínas e acrescentou-se 50 mL de hidróxido de sódio (40%) no copo de dosagem e abriu-se a torneira de modo que o hidróxido de sódio escorresse lentamente. Adicionou-se com auxilio de uma proveta 50 mL de ácido bórico (4%) em um erlenmeyer de 250 mL. Colocou-se o erlenmeyer na saída do condensador e ligou-se o aparelho observando sempre a quantidade de água da caldeira. Seguiu-se destilando até que alcança-se 200 mL a mais do volume inicial. Após alcançar os 200mL desligou-se o aparelho e retirou-se o erlenmeyer.
3ª etapa: Titulação da amostra
Adicionou-se na bureta 50 mL de ácido clorídrico 0,1 N e acrescentou-se ao destilado 3 gotas de vermelho de metila e 6 gotas de verde de bromocresol. Iniciou-se a titulação com o conteúdo obtido na destilação mantendo sempre o líquido em agitação. Titulou-se até mudança de cor e anotou-se o volume de ácido clorídrico gasto.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
 Para obtermos o percentual de proteína do produto analisado utilizou-se como citado anteriormente o método de Kjeldahl, que consiste em três etapas, sendo elas: digestão, destilação e titulação da amostra. Na primeira etapa, obteve-se a conversão do nitrogênio (N2) em sulfato de amônia (NH4)2SO4, que após ser aquecido e resfriado formou uma coloração levemente azulada. Já na segunda etapa, levou-se a solução para o destilador de nitrogênio, onde adicionou-se hidróxido de sódio (NaOH) até atingir o volume de 200mL. O sulfato de amônia presente na solução com a adição do hidróxido de sódio libera amônia, assim a solução ao fim dessa etapa apresentou uma coloração roseada. Por ultimo na titulação, adicionou-se ácido bórico (H3BO3) para fazer a neutralização, ocorrendo a formação do borato de amônia. Então a solução foi titulada pelo ácido clorídrico (HCl), que faz a separação da amônia da molécula de borato. Para se obter o ponto de viragem utilizou-se 8,3 mL de ácido clorídrico, voltando a solução a apresentar a coloração azul. 
	Realizada a parte experimental e encontrado os valores desejados, realizou-se os cálculos para obtenção do percentual de proteína em uma amostra de 100 g, conforme a equação abaixo:
 
 % N = mL HCl x N (HCl) x 0,014 x 100
 peso da amostra (g)
	 
 % N = 8,3 mL HCl x 0,1N (HCl) x 0,014 x 100
 1,0 peso da amostra (g)
	 % N = 1,162
Depois de encontrado o valor do % N, aplicou-se o fator de correção, para descobrir qual a porcentagem de proteína (%P), conforme a equação abaixo:
% P = % N x Fator de Conversão	 % P = 1,162 x 6,25 % P = 7,26
Feito este calculo, compararam-se os valores com os expressos no rótulo da embalagem:
 Figura 1: Rótulo Batata Slice
 Fonte: Autores 2018
	Porém foi necessário realizar mais outro calculo, pois a embalagem trás a informação para 25g do produto e nosso experimento foi realizado para amostra em 100g:
Porção
25 g – 1,5 g
 100 g – x
X= 6 g/%
Através da determinação de proteína por meio do método de Kjeldahl, obteve-se os seguintes resultados representados na tabela 1, a mesma apresenta os valores de proteína encontrados no experimento, no rótulo do produto e na tabela TACO (Tabela Brasileira de Composição de Alimentos) :
Tabela 1 – Proteína
	Batata Slice
	Experimento
	Rótulo
	Tabela TACO
	Proteina%
	7,26 %
	6 %
	5,6%
Fonte: Autores 2018
	Entretanto, a tabela TACO nos informa um percentual de 5,6 % de proteína, em uma amostra de 100g, ou seja, em nosso experimento o valor deu superior, e na embalagem o valor também é um pouco superiror. Tendo a TACO como referencia vemos que podem ter ocorrido erros enquanto realizamos o procedimento, até por ter sido realizado apenas uma única vez, sem repetições. Ou ainda, que o fabricante do produto pode não estar sendo verídico em suas informações, porém neste quesito o valor superior não tem tanto problema, visto que as proteínas são importantes para o nosso organismo.
 
6 CONCLUSÃO
	Com nosso experimento observou-se e determinou-se o percentual de proteína presente na batata frita chips, utilizando o método de Kjeldahl, o sistema montado teve como objetivo extrair por meio de três etapas, sendo elas: digestão, destilação e titulação da amostra, o percentual de nitrogênio que é constante para calcular a quantidade de proteína através de uma conversão de valores por meio do fator de correção .
	Contudo, observamos que os valores não foram exatos, mas ficaram próximos, portanto como nosso experimento não foi realizado mais de uma vez, não podemos afirmar com certeza que os valores expressos no rótulo sejam enganosos, porém sabemos que proteínas são nutrientes essenciais ao corpo humano. Além de constituírem a fundação dos tecidos do corpo, as proteínas são também fonte de energia. Por isso, seu consumo diário é muito importante, sempre cuidando com a quantidade diária, porque tudo que consumido em excesso faz mal, neste caso principalmente para os rins.
REFERÊNCIAS
BELTRAN, MARIA DE LOS ANGELES, CADAHIA, MARIA CRISTINA, GONZALEZ, JESUS MORENO. Nuevos Métodos Tecnológicos para productos Lácteos. 1ªed Consellería de Agricultura Gandería e montes, 1990.
BEZERRA, R. T. R.; FURTADO, M. A. M.; SILVA, P. H. F.; AZEVEDO, M. A. Avaliação da Influencia da Temperatura de Aquecimento sobre a Determinação do Teor de Caseína no Leite. 2008.
CECCHI, H. M. Fundamentos Teóricos e Práticos em Análise de Alimentos. 2. ed. Campinas: UNICAMP. 2003, 207 p.
DIAS, A. M. C. Análises para o controlo da qualidade ao leite. Instituto Politécnico de Coimbra Escola SupeiorAgrária. Curso de Especialização Tecnológica em Qualidade Alimentar. Coimbra, 2010. 
NOGUEIRA, A. R. A.; SOUZA, G. B. Manual de Laboratórios: Solo, Água, Nutrição Vegetal, Nutrição Animal e Alimentos. São Carlos: Embrapa Pecuária Sudeste, 2005. 313p.
OLIVEIRA, K. M. G.; SEGHETO L.; FURTADO, M. A. M. Estudo Comparativo entre Métodos do Formol e de Kjeldahl para Determinação deProteínas em Leite. Anais do XXIII Congresso Nacional de Laticínios. 06 n° 351. vol. 351 Juiz de Fora. p 196. Jul/Ag. 2006.
SILVA, P.H. F. Desenvolvimento de metodologia analítica para determinação do teor de caseína em leite e para avaliação da proteólise em queijos. Viçosa, UFV, 1995. 64p. (Tese M.S.).
VOGEL, A. I. Análise Química Quantitativa. Tradução: Horácio Macedo. 5 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S. A., 1992. 712p.
TACO. Tabela Brasileira de Composição de alimentos. 4ed. Revisada e ampliada. Campinas, SP:UNICAMP, 2011