PCR BIOQUIMICA

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PCR
PCR (polymerase chain reaction) é uma técnica de biologia molecular, no caso do PCR é uma DNA-polimerase que sofre reação em cadeia. A reação em cadeia de polimerase é a copia do DNA in vitro mais ou menos nos mesmos moldes que acontece na replicação in vivo. Se pega uma seqüência de interesse e a copia várias vezes. O PCR tem inúmeras aplicações: laboratórios de pesquisas, laboratório diagnóstico (doenças causadas por bactérias ou vírus podem ser diagnosticadas por PCR, porque é possível verificar se o material genético da bactéria ou do vírus é encontrado na célula humana), medicina forense (casos com vítimas, de pessoas desaparecidas )ou nos casos de paternidade.
Em 1984 foi a primeira vez que foi falado sobre PCR num evento científico. Em 1976, um pesquisador descobriu uma DNA-polimerase especial, pertencente ao organismo Thermus Aquaticus (taq-polymerase), a diferença dessa DNA-polimerase era que ela permanecia estável em altas temperaturas, ao contrário das DNA-polimerases dos seres humanos e da maioria das bactérias. Quando se uniu essa DNA-polimerase termoestável à técnica de PCR, houve um grande salto biotecnológico, tornando o PCR muito eficiente. Para se fazer o PCR, é preciso alguns componentes na reação: DNA-polimerase (termoestável), par de iniciadores ou oligonucleotídeos ou primers para iniciar a síntese de DNA, nucleotídeos (no caso deoxinucleotídeos, chamados de DNTP’s), magnésio, tampão, sal (KCl, neste caso) e um molde de DNA (template) da seqüência desejada.
Deseja-se amplificar uma seqüência de DNA. Para que a DNA-polimerase possa copiar essa seqüência, é preciso, primeiramente, separar as duas fitas por aquecimento. Então, o primeiro ciclo numa etapa de PCR é chamado de desnaturação, e acontece pelo aquecimento da amostra entre 94 e 95 °C (temperatura em que ocorre a quebra das pontes de hidrogênio). Depois de as fitas terem sido separadas, começa a segunda etapa do ciclo, chamada de anelamento. No anelamento acontece o pareamento dos primers à seqüência que se deseja copiar. A terceira etapa é a síntese das novas fitas de DNA, chamada de extensão, e é feita normalmente a 72°C (temperatura ótima de polimerização, ou seja, cópia de DNA). Se for usada outra DNA-polimerase, a temperatura de extensão será diferente. A temperatura de anelamento é baseada na seqüência dos primers. Para calcular a temperatura de anelamento, é preciso saber quantos G, C, A e T tem esse primer. Com isso, se calcula a temperatura de melting (Tm) dos primers, que é a temperatura em que eles se separam. 
Mais ou menos 5°C abaixo será a temperatura de anelamento. As fitas não começam a se separar exatamente a 94°C, as pontes de hidrogênio podem começar a se separar em temperaturas mais baixas, dependendo da seqüência. Se o primer for cheio de C e G a temperatura será mais alta do que se fosse de A e T, porque C e G são ligados por 3 pontes de hidrogênio, e A e T são ligados por 2. 
O PCR é uma técnica em que há repetição de etapas. Ele faz amplificação exponencial. No início há 2 fitas, depois do primeiro ciclo, há 4 fitas, depois do segundo ciclo são 8 fitas, depois do terceiro ciclo são 16 fitas, e assim por diante. Se uma pessoa que pegou HIV há um mês fizer teste de ELISA, terá um falso-negativo, pois o HIV causa janela-imunológica. Por isso é recomendado que se faça o teste de novo três meses depois. Existe um teste muito mais sensível para detectar o vírus na célula da pessoa, que é o PCR. É necessário o uso do PCR porque o material genético do HIV é pouco, sendo difícil de encontrar o vírus. Não é possível ver o vírus do HIV porque, além do seu material genético ser RNA, ele está misturado com o DNA do humano, que seria provavelmente o que apareceria na eletroforese. Para poder detectar o vírus HIV, é usado um kit com vários reagentes no sangue coletado do paciente, que vai extrair o material genético do vírus. 
É feito um experimento com a enzima transcriptase reversa, que vai transformar o RNA viral em cDNA, que será o molde para o PCR. Depois de feito o PCR, o DNA será aplicado em um gel e será feita uma eletroforese de DNA, se houver DNA no gel significa que a pessoa tem a doença. Para poder ver o DNA no gel, é preciso fazer vários ciclos. Se fosse usada uma DNA-polimerase que é ativa a 37°C, a DNA-polimerase seria inativada a cada ciclo, porque não agüentaria a temperatura de 94°C e desnaturaria perdendo sua atividade. Quando foi descoberto o PCR, eram usados três banhos maria: um a 94°C, um a temperatura de anelamento, e um a 30°C. Quando foi descoberta a DNA-polimerase termoestável foi feito um aparelho chamado de termociclador em que se consegue alcançar temperaturas de 94°C, 50°C e 72°C automaticamente. Os ciclos podem correr livremente uma vez que as DNA-polimerases termoestáveis são resistentes a altas temperaturas.
 A desnaturação leva de 30 segundos a alguns minutos. O tempo depende do tamanho do fragmento. São amplificados por PCR até 2000 pares de base, porque chega uma hora em que a enzima não agüenta mais ser submetida a 94ºC e sua atividade começa a cair. 
Tem-se a fita que você quer, a cópia e o pedaço da fita que não quer. O PCR é sempre um par de oligonucleotídeos. Há um par verde e um par vermelho, que não estão se alinhando. Os primers não podem se alinhar, porque na hora de anelar, em vez de se anelarem nos moldes, se anelarão neles mesmos, acabando com o PCR. Se dentro da fita tiver uma parte que se anele, o rendimento pode cair bastante. O oligonucleotídeo é uma fita simples. 
Em solução, a fita pode estar na direção 5’-3’ ou 3’-5’. Verde se anela com vermelho. Pra se anelar em uma das fitas, tem que ter a mesma seqüência da outra, por isso verde se anela com vermelho. A DNA-polimerase copia até quando sua atividade deixar ou até quando o tempo de extensão deixar. No primeiro ciclo se formam 4 fitas simples diferentes: 2 são complementares e 2 são menores. Para o segundo ciclo, as fitas têm que estar separadas. Neste ciclo se obtém 2 fitas que tem somente a parte desejada. No terceiro ciclo, serão 8 fitas corretas, e assim por diante, exponencialmente. Você pode tentar entender alguma coisa do que foi descrito olhando este esquema nada acessível do Lehninger:
	O PCR é usado em exame de paternidade e em alguns casos de medicina forense. No nosso genoma, muitos genes têm a mesma seqüência, mas cada pessoa tem seqüências de nucleotídeos únicas dela ou dos pais dela. Essas seqüências são chamadas de STR’s, que são regiões curtas de repetição (de nucleotídeos). Sempre estão no meio de seqüências extremamente conservadas. A diferença se dá no número de nucleotídeos, porém os iniciadores serão os mesmos para todas as pessoas.
	O sangue da pessoa é retirado, o PCR é feito, e aplica-se uma eletroforese. Os fragmentos menores vão correr mais rápido e os fragmentos maiores vão correr mais devagar. O DNA pode ser retirado de outro lugar e é feito o mesmo procedimento, se as bandas derem iguais, há 99% de chance de ser a pessoa. No caso de testes de paternidade, uma banda da criança deve coincidir com uma da mãe e outra banda deve coincidir com uma banda do pai. Também pode ser usado em casos de estupro.
	
Há alguns casos em que se amplifica o DNA, sequencia o fragmento, o que torna a certeza muito maior, e também pode fazer restrições com enzimas de restrição do fragmento único. Faz-se eletroforese, em que o padrão de bandas é único para cada pessoa. 
Está crescendo cada vez mais a aplicação dessa técnica de biologia molecular tanto pra medicina forense quanto para medicina de diagnósticos. Por exemplo: graças ao projeto genoma humano, foram seqüenciados DNA de pessoas que tinham diversas síndromes genéticas, para localizar a mutação ou diferença de determinados genes. No mal de Huntington, há um gene que tem bases modificadas. Foi feito um par de primers que anela juntamentenessas bases que só as pessoas que podem vir a desenvolver este mal possuem. Em pessoas normais, não haverá amplificado algum; já na pessoa com chance de ter mal de Huntington, haverá anelamento. O resultado positivo não quer dizer que a pessoa com certeza terá a doença, assim como no caso do marcador de câncer de mama, apenas há uma chance de desenvolver a doença. Em um caso de câncer de intestino, uma associação de certo tipo de alimentação com a expressão diferenciada de certas proteínas pode levar ao desenvolvimento de câncer, por isso, pessoas propícias a essa doença começam a fazer dieta desde cedo.