Contagem e isolamento de microrganismos a partir de Kefir

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Universidade Federal de Viçosa
Centro de Ciências Exatas e Tecnológicas
Departamento de Tecnologia de Alimentos 
TAL 453 – TECNOLOGIA DE PRODUTOS LÁCTEOS FERMENTADOS
Contagem e isolamento de microrganismos a partir de Kefir
Discentes e Matrículas
Jonas Campos - 89408
José Osvaldo Ramos - 89418
Rodrigo Antônio Vieira- 65698
Viçosa, março de 2018.
Contagem e isolamento de microrganismos a partir de Kefir 
Kefir de leite é um leite fermentado produzido a partir dos grãos (sementes, mudas, starters) de kefir. O leite fermentado produzido pelos grãos de kefir de leite é uma bebida muito agradável e rica em propriedades probióticas, subtâncias essas que colonizam a microbiota intestinal com bactérias benéficas (pró-biota), além de favorecer a eliminação de  bactérias nocivas e promotoras de doenças (patogênicas).
Estudos mostram que o componente β-glycerophosphato dissódico presente no meio M17 é capaz de suprimir o crescimento Lactobacillus sp., sendo assim seletivo para o crescimento de Lactococcus sp.
O meio M17 possui em sua composição acetato de sódio e ele atua como agente inibidor dos demais grupos bacterianos, permitindo o crescimento dos Lactobacilos sp. e o acetato de sódio pode ainda agir como componente tamponante.
Outros meios setivos para BAL:
Canamicina Esculina Azida Agar: Verificamos que o meio KA3 foi, de todos os meios utilizados, o que permitiu o crescimento quase exclusivo de bactérias lácticas (96,2% e 95,8% em aerobiose e em anaerobiose, respectivamente). Este meio de cultura contém, como principais agentes selectivos, o antibiótico canamicina associado a azida de sódio. Quase todas as bactérias lácticas são resistentes à canamicina (Mathur e Singh, 2005), nomeadamente Enterococcus spp (Franz et al., 1999) e Lactobacillus spp (Danielsen e Wind, 2003) e, portanto, conseguem sobreviver em meios onde está presente este antibiótico. Por outro lado, a principal acção da azida de sódio consiste na inibição de alguns sistemas enzimáticos de transporte de electrões como a catalase e a citocromo c oxidase (Domig et al., 2003). Sendo característica das bactérias lácticas a ausência destes sistemas (Axelsson, 1993), o seu crescimento não é afectado pela presença, nos meios de cultura, destes compostos que conseguem ser eficazes na eliminação de muitas bactérias aeróbias.
MRSA: O meio MRSA inibi outros tipos de microrganismos, que não sejam bactérias lácticas. O citrato de amónio e o acetato de sódio presentes neste meio de cultura inibem o desenvolvimento da maior parte dos contaminantes. Estes dois sais de ácidos orgânicos têm atividades antibacterianas diferentes, verificando-se que o citrato, afeta predominantemente os microrganismos Gram positivos enquanto que o acetato atinge principalmente os Gram negativos.
APT Agar: A Digestão Enzimática da Caseína e o Extrato de Levedura fornecem carbono, nitrogênio e vitaminas necessárias para o crescimento do organismo no Ágar APT. O Cloreto de Sódio mantém o equilíbrio osmótico do meio. O Fosfato de Potássio é o agente tamponante. A Dextrose é o carboidrato fermentável. O Cloreto de Manganês, Sulfato de Magnésio e Sulfato Ferroso, fornecem os íons utilizados por lactobacilos para replicação. Polisorbato 80 é um surfactante e uma fonte de ácidos graxos requeridos por lactobacilos. O Carbonato de Sódio é o agente neutralizante. O ágar é o agente solidificante.
Para distinguir os diferentes microrganismos presentes em populações mistas, são usados meios de cultura seletivos que promovem o crescimento de determinados microrganismos, inibindo o de outros, e que são incubados sob as condições de temperatura e disponibilidade de oxigénio mais vantajosas para os microrganismos em causa. A flora láctica é constituída por um grupo heterogé- neo de bactérias, com diferentes necessidades fisiológicas, que inclui espécies pertencentes a vários géneros, entre os quais, Enterococcus, Lactococcus, Pediococcus, Leuconostoc, Weissella e Lactobacillus. Têm em comum serem Gram positivas, catalase negativas, não esporuladas, anaeróbias facultativas, adaptadas a ambientes ricos em nutrientes e produzirem ácido láctico como principal produto da fermentação dos glúcidos (Axelsson, 1993). Devido às suas diversas exigências nutricionais, para detectar, isolar e identificar os diferentes géneros que constituem este grupo microbiano, tem sido usados variados meios de cultura que, geralmente, são ricos em nutrientes, possibilitando o crescimento de uma grande variedade de microrganismos. Em contra partida, há uma vantagem muito grande quando se isola um grupo de microrganismo, o qual pode ter um grande interesse industrial sobre o mesmo quando falamos de produção de compostos que contribuem para o processo fermentativo de queijos, iogurtes, bebidas lácteas entre diversos produtos. Como também ao se isolar um microrganismo pode se descobrir sua atividade inibitória, produção de enzimas e atuação sobre o substrato de interesse.
Leite
	Diluições
	10^5
	10^6
	10^7
	PCA espalhamento
	-
	5,75x10^8 ufc/mL
	-
	PCA acidificado
	-
	1,6x10^7 ufc/mL
	1,6x10^8 ufc/mL
	MRS espalhamento
	-
	3,66x10^8 ufc/mL
	-
	MRS sobrecamada
	-
	-
	-
Tabela 1. Contagem UFC/mL em amostras de leite.
Grãos
	Diluições
	10^3
		10^5
	10^7
	PCA espalhamento
	5,92x10^6 ufc/mL est.
	1,37x10^8 ufc/mL
	9,2x10^9 ufc/mL
	PCA acidificado
	-
	 -
	-
	MRS espalhamento
	1,98x10^6 ufc/mL
	 -
	-
	MRS sobrecamada
	4,80x10^5 ufc/mL est.
	-
	-
Tabela 2. Contagem UFC/mL em amostras de grãos.
*O meio M17 não apresentou crescimento suficiente para contagem em nenhuma amostra.
A partir dos resultados apresetados pelas tabelas podemos influir que o meio mais adequado para o crescimento dos microrganismos de interesse é o meio PCA através do plaqueamento por espalhamento, porém a sua contagem estava um ciclo log maior que a contagem indicada em estudos similares a esse tipo de experimento (em torno de 10⁷), o meio PCA acidificado através do plaqueamento por espalhamento teve o pior índice de crescimento tanto para as mostras contendo o filtrado (leite), quanto nas amostras contendo somente o grão, isso mostra que a acidificação do meio teve influenciou de forma direta no desenvolvimento no crescimento das bactérias láticas, uma vez que o mesmo meio apresentou o melhor crescimento em condições sem acidificação. De forma geral a maioria das amostras apresentou grande desenvolvimento de bactérias láticas, fato esse que mostra que as técnicas empregadas são eficientes para detecção e isolamento de BAL.
Referências Bibliográficas
Evans, J. B., and C. F. Niven, Jr. 1951. Nutrition of the heterofermentative lactobacilli that cause greening of cured meat products. J. Bact. 62:599-603. 
Deibel, R. H., J. B. Evans, and C. F. Niven, Jr. 1957. Microbiological assay for thiamine using Lactobacillus viridescens. J. Bact. 74:818-821. 
 Vedamuthu, E. R., M. Raccach, B. A. Glatz, E. W. Seitz, and M. S. Reddy. 1992. Acid-producing microorganisms, p. 225-238. In C. Vanderzant, and D. F. Splittstoesser (eds.). Compendium of methods for the microbiological examination of foods, 3rd ed. American Public Health Association, Washington, D.C.
https://dspace.uevora.pt/rdpc/bitstream/10174/5984/1/Utiliza%C3%A7%C3%A3o%20de%20diferentes%20meios%20de%20cultura%20na%20identifica%C3%A7%C3%A3o%20e%20recupera%C3%A7%C3%A3o%20de.pdf
https://probioticosbrasil.wixsite.com/probioticosbrasil/o-que-e-kefir-de-leite
http://foodsafety.neogen.com/pdf/acumedia_pi/7543_pt_pi.pdf