HAI Chagas

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS
COLÉGIO TÉCNICO
SETOR DE ANÁLISES CLÍNICAS
CURSO DE IMUNOLOGIA
PROF.: JENNER K. REIS
P3A - 301
TESTE DE HEMAGLUTINAÇÃO INDIRETA 
PARA DOENÇA DE CHAGAS 
(HAI)
ALICE DE FREITAS
CRISTINA SANTOS
ESTHER FROIS
ISABELA CONCEIÇÃO
BELO HORIZONTE, MINAS GERAIS, BRASIL
OUTUBRO, 2014
OBJETIVO
Pesquisar a presença de anticorpos anti-Trypanossoma cruzi em amostras de soro pelo método de hemaglutinação passiva.
METODOLOGIA
	Foram realizadas as provas qualitativa e semi-quantitativa da Hemaglutinação Indireta para Chagas, denominada também como HAI ou IHA. Como forma de triagem, nos laboratórios e centros de saúde, a prova qualitativa é feita antes da semi-quantitativa, porém, nesta aula ambas foram feitas simultaneamente, devido ao limite de tempo. Foi utilizado o kit Chagatest HAI screening A-V.
	Para realização das provas, foram selecionadas duas amostras, chamadas de 155 e 12, que foram então identificadas respectivamente como Soro 1 e Soro 2. 
Primeiramente, em um tubo de hemólise, foram pipetados 5 mL de solução diluente e 200 uL de solução protéica, formando uma solução diluente. Em seguida foram separados outros 4 tubos de hemólise para realizar a diluição do soro 1, soro 2, controle positivo e controle negativo. Em cada tubo foram pipetados 10 uL da amostra correspondente (soro/controle) e 400 uL da solução diluente preparado anteriormente. 
Em uma microplaca de 96 orifícios de fundo concavo, foram utilizadas as cavidades A1, B1, C1, D1, E1, F1, A2, B2, C2, D2, E2, F2, A3 e A4.
Imagem 1: Mapa de uma microplaca de 96 cavidades.
 
A placa foi organizada na seguinte forma:
Coluna 1: Soro 1
A1: 100 uL do soro 1 diluído 1/40
B1: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/40 = soro 1/80
C1: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/80 = soro 1/160
D1: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/160 = soro 1/320
E1: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/320 = soro 1/640
F1: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/1280 = soro 1/1280
Coluna 2: Soro 2
A2: soro diluído 1/40
B2: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/40 = 1/80
C2: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/80 = soro 1/160
D2: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/160 = soro 1/320
E2: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/320 = soro 1/640
F2: 50uL de diluente + 50uL do soro 1/1280 = soro 1/1280
Coluna 3: Controle positivo
A3: 50uL de diluente + 50 uL do controle positivo
Coluna 4: Controle negativo 
A4: 50uL de diluente + 50 uL do controle negativo
	 Após realizar as diluições, foram pipetados 25uL da suspensão de hemáceas sensibilizadas com o antígeno T. cruzi em cada um dos poços ocupados. A placa foi então homogeneizada durante 30 segundos. Aguardou-se 1 hora para ler-se os resultados. 
Para a prova qualitativa observou-se se houve aglutinação visível nos poços que apresentavam a menor diluição do soro, que é a dos poços A1 e B1. 
Para a prova semi-quantitativa observou-se o inverso da maior diluição que apresentou reatividade para determinar o título dos soros. 
 
RESULTADOS
Após repouso por 1 hora, a placa foi lida. A cavidade do soro que apresentar um sedimento de hemáceas em forma de botão, nitido e de contorno uniforme em torno da cavidade é considerada não-reagente. A cavidade que apresentar um manto pequeno no fundo da cavidade com botão bastante definido no centro indica soro reagente-fraco. A cavidade que apresentar a formação de um manto vermelho indica soro reagente. 
Imagem 2: Resultado da hemaglutinação indireta.
Soro 1 (amostra 155): Título 640. 
Soro 2 (amostra 12): Em todas as diluições do soro 2 não houve a formação do botão de hemácias. Por não ter tido a continuação da diluição do soro 2, o titulo é igual ou maior que 1280.
Imagem 3: Microplaca de teste de Hemaglutinação Indireta para Chagas, após 1 hora de repouso. 
Coluna 1: soro 1 (amostra 155), coluna 2: soro 2 (amostra 12), +: controle positivo, =: controle negativo.
DISCUSSÃO
 
O teste de Hemaglutinação Indireta ou Passiva, é um exame bastante recorrido para diagnóstico sorológico da Doença de Chagas, em associação a outros exames laboratoriais, histórico e exames clínicos do paciente. Consiste em um método indireto, por utilizar um antígeno solúvel e uma substância carreadora deste antígeno, que no caso de uma hemaglutinação, é hemácia. 
Geralmente, utiliza-se hemácias de carneiro ou de ave, sensibilizadas (ligadas) com antígenos do Trypanosoma cruzi. As hemácias da ave são as melhores de serem usadas porque há um menor número de reações inespecíficas por não terem tantas semelhanças com as hemacias humanas, devido à distancia que se encontram dos seres humanos na escala evolutiva das espécies. Além disso, de acordo com a bula do teste, as hemácias da ave são maiores, facilitando a visualização. 
A solução diluente, usada para a preparação das amostras, garante estabilidade às hemácias na reação, inibe anticorpos que podem interferir os resultados e é uma alternativa à solução salina, que por ser uma solução hipertônica, pode lisar as hemácias. 
Quando há formação de botão hemático no fundo da cavidade significa que os antígenos dessas hemácias recobertas não obtiveram reação, ou seja, não haviam anticorpos para ligarem-se aos antígenos. Logo, as hemácias se depositaram no fundo da placa, já que se encontram livres para sedimentarem no fundo.
Quando a amostra possui os anticorpos pesquisados, no caso os anti-Trypanosoma cruzi, a solução final fica homogênea e não há formação do botão, pois as hemácias estão ligadas aos anticorpos em suspensão, formando uma rede que não permite a sedimentação hemática, o que foi observado em todas as diluições da amostra 12 (soro 2) e até a diluição de 1/640 da amostra 155 (soro 1).
A diluição inicial do teste é de 1/40 e indivíduos com resultados positivos para essa diluição ou maiores são presumivelmente parasitados, mas é necessária utilizar de outra técnica para confirmar o resultado, podendo ser a imunofluorescência, que é um exame solicitado em muitos casos para confirmação dos resultados, além do ELISA, entre outras técnicas. O resultado laboratorial deve ser combinado com a anamnese feita pelo médico, levando diversos fatores na avaliação do estado clínico do paciente.
A determinação do título se baseia na visualização de até quais cavidades foram observadas reações de aglutinação, e assim, o título constitui-se como o inverso da diluição da cavidade anterior àquela em que observou-se um botão. O título superior a 40 indica a sensibilidade do teste, visto que é o valor da diluição utilizado na hemaglutinação. Abaixo deste valor, a amostra é não reativa, sendo visível a formação do botão hemático nítido na menor diluição. Quando o botão é pequeno e pouco nítido, considera-se uma reação parcial. Mas pode indicar um reativo fraco, quando o botão pequeno estiver centralizado no fundo da cavidade. No caso de uma amostra reativa, deve haver uma posterior confirmação dos outros exames laboratoriais. É indicado realizar-se no mínimo 2 exames laboratoriais, que inclui a imunofluorescência indireta (IFI), ensaio imunoensaio enzimático (ELISA), aglutinação por látex; apesar do teste de HAI apresentar uma alta sensibilidade e alta especificidade.
Os controles são importantíssimos para serem avaliados todas as outras cavidades, e a confiabilidade dos reagentes utilizados, pois controles inadequados invalidam o teste, é solicitado a repetição do exame, e podem indicar alguma falha técnica. No controle negativo, deve-se observar a formação do botão de hemácias, indicando que não houve reação, logo os reagentes não estão contaminados. No controle positivo, deve-se observar a uma solução homogênea, que serve de referência para as cavidades com os soros testes. Através do controle destes reagentes, é verificado se não há antígenos na superfície das hemácias que favorecerão a falsos resultados. É requerido também o controle do diluente, para a viabilidade das hemácias no teste.
Dentre algumas falhas técnicas queinterferem nos resultados, estão a preparação adequada da microplaca (higienização na base da microplaca com pano úmido), pois o excesso de carga dificulta a sedimentação das hemácias, favorecendo a falsos reativos. A falta de homogeneização interfere também, já que se trata de suspensão de hemácias e antígenos, principalmente no que se refere a um efeito pró-zona, que pode vir a acontecer na observação das diluições. Uma certa delicadeza com as hemácias fenotipadas após a observação da formação do botão na microplaca, induz aos cuidados para não agitação neste momento. A amostra também deve estar em boas condições, para não inativar os anticorpos na reação, e deve-se evitar o máximo de contaminações. Por último, as diluições, quanto na fase semi-quantitativa, quanto do diluente deve ser recente, pois em períodos prolongados, apresentará discrepância de um resultado confiável. No caso do teste realizado em sala, evitou-se essas limitações, permitindo a validação do controle e, posteriormente, do teste. Isto configura uma sensibilidade à detecção de valores detectáveis dos anticorpos, e uma especificidade com as hemácias fenotipadas pelo antígeno, que irá pesquisar no soro do paciente anticorpos específicos. 
Quando altos títulos são obtidos no teste, pode-se indicar a fase da doença em que o paciente se encontra (aguda ou crônica) e o prognóstico, ou seja, como o tratamento tem evoluído durante o tratamento, sendo que altos títulos, indicam fase aguda ou pouca resposta do corpo ao tratamento e títulos mais baixos indicam boa resposta ao tratamento ou fase crônica, ou então, quando o paciente se encontra no início da infecção. Na fase aguda da doença, uns dos exames realizados são pesquisa do antígeno em esfregaço sanguíneo, e pesquisa de anticorpos IgG e IgM, pois nesta fase o paciente apresenta alterações cardíacas, manifestações digestivas e inflamações, no qual o corpo do paciente está em estado imunológico, com uma presença de anticorpos combatentes, dentre os quais podem incluir o IgM. Por ser de caráter pentámero, pode favorecer a excesso de reação, e formação de rede com as hemácias, formando uma solução homogênea (falso positivo). 
Já na fase crônica, caso o tratamento não for realizado devidamente, pode atingir quadros graves em alterações cardíacas e digestivas, e pode até atingir o feto de uma mãe chagásica. Na maioria dos casos, a doença pode estabelecer-se como indeterminada, ou seja, há uma estabilização do estado clínico e sorologia positiva, ressaltando a necessidade de acompanhamento do título do paciente com constante atenção, para evitar a evolução de piora aos quadros clínicos. A fase crônica pode ser indicada pela maior quantidade de IgG no soro do paciente. No caso de mais IgM, pode apresentar-se como um interferente no HAI, e geralmente recorre-se ao tratamento do soro com uma substância, o 2-mercaptoetanol, para transformar o pentâmeros em monômeros, evitando assim, ligações inespecíficas no exame. No caso da amostra analisada, o alto título encontrado em ambas as amostras, pode indicar um agravamento do parasita no quadro clínico e uma resposta imunológica correspondente.
CONCLUSÃO
O teste de Hemaglutinação Indireta para Chagas é de fácil execução, de leitura visual rápida e facilmente adequado à rotina laboratorial, com alta sensibilidade e especificidade, que demanda um controle de qualidade frequente.
A amostra 155 (soro 1) apresentou titulo 640 e a amostra 12 (soro 2) apresentou título igual ou maior que 1280. 
O paciente chagasico necessita de mais de um tipo teste com resultado positivo para confirmar o diagnóstico e iniciar o tratamento o mais rápido possível. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGŔAFICAS
Medicina NET. Doença de Chagas. 
Disponível em: <http://www.medicinanet.com.br/conteudos/revisoes/1744/doenca_de_chagas.htm>. Acesso em: 15 Out. 2014. 
REIS, Jenner K. Hemaglutinação indireta para Chagas - HAI. 09 Out. 2014. 1 f. Notas de aula. Material impresso.
WIENER LAB. Chagatest HAI screening A-V: Prova de hemaglutinação indireta para a detecção de anticorpos contra o Trypanossoma cruzi. Disponível em: <http://www.wiener-lab.com.ar/VademecumDocumentos/Vademecum%20portugues/chagatest_hai_screening_av_po.pdf> . Acesso em: 15 Out. 2014.