AULA 3 08%2F09%2F2016

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Curso BQM101 
Bioquímica - Farmácia 
Aula	
  3:	
  
Tecnologias	
  de	
  Análise	
  do	
  DNA	
  
Adriana S. Hemerly-IBqM - UFRJ 
hemerly@bioqmed.ufrj.br 
 
Letícia Perdigão 
lele2405@hotmail.com 
 
Vamos voltar no 
tempo.... 
63 anos atrás, Watson e 
Crick divulgaram a 
estrutura do DNA 
(1953). 
RUA PRIMEIRO DE MARÇO, ESQUINA DA 
OUVIDOR, RIO DE JANEIRO,1952 
1990-­‐2003	
  
3,2	
  bilhões	
  de	
  bases	
  
The	
  Human	
  Genome	
  Project	
  
"Science	
  is	
  essen)ally	
  a	
  cultural	
  
ac)vity.	
  It	
  generates	
  pure	
  knowledge	
  
about	
  ourselves	
  and	
  about	
  the	
  universe	
  
we	
  live	
  in,	
  knowledge	
  that	
  con)nually	
  
reshapes	
  our	
  thinking"	
  [1]	
  [John	
  Sulston]	
  
In	
  1953	
  James	
  Watson	
  and	
  Francis	
  Crick	
  
discovered	
  the	
  structure	
  of	
  DNA	
  -­‐	
  the	
  
code	
  of	
  instrucMons	
  for	
  all	
  life	
  on	
  
earth...	
  
...in	
  2003	
  -­‐	
  just	
  50	
  years	
  later	
  -­‐	
  
humankind	
  had	
  developed	
  and	
  
exploited	
  the	
  technology,	
  the	
  
compuMng	
  capability	
  and	
  the	
  financial	
  
and	
  social	
  impetus	
  to	
  record	
  one	
  whole	
  
human	
  DNA	
  sequence:	
  some	
  3	
  billion	
  
leUers	
  of	
  geneMc	
  code.	
  
hUp://www.sanger.ac.uk/about/
history/hgp/	
  
	
  
O	
  que	
  é	
  GENÔMICA?	
  
	
  
Genoma:	
  conjunto	
  de	
  genes	
  de	
  uma	
  espécie	
  
	
  
InvesMgar	
  o	
  genoma	
  como	
  um	
  todo,	
  com	
  a	
  intenção	
  de	
  
catalogar	
  todos	
  os	
  seus	
  genes	
  e	
  a	
  função	
  de	
  cada	
  um	
  
deles.	
  
	
  
TECNOLOGIAS GENÔMICAS 
Genômica/	
  
Sequenciamento	
  de	
  genomas	
  
Transcriptômica	
  
Proteômica	
  
Procurar	
  um	
  gene	
  dentro	
  de	
  um	
  genoma	
  humano	
  
é	
   comparável	
   a	
   procurar	
   uma	
   pessoa	
   sem	
  
sobrenome	
   em	
   uma	
   casa	
   sem	
   endereço	
   em	
   uma	
  
rua	
  desconhecida	
  em	
  uma	
  cidade	
  não	
  idenMficada	
  
de	
  um	
  país	
  estrangeiro.	
  
Depois	
  disso	
  fica	
  até	
  fácil	
  achar	
  Wally!!	
  
Tecnologia	
  de	
  Amplificação	
  de	
  um	
  Segmento	
  de	
  DNA:	
  	
  	
  
	
  	
  
	
  O	
  enorme	
  tamanho	
  e	
  a	
  imensa	
  variabilidade	
  da	
  molécula	
  do	
  
DNA	
  são	
  os	
  principais	
  obstáculos	
  ao	
  isolamento	
  e	
  
sequenciamento	
  de	
  DNA.	
  	
  Assim,	
  técnicas	
  especiais	
  são	
  
necessárias	
  para	
  a	
  seleção	
  e	
  amplificação	
  de	
  partes	
  da	
  
molécula	
  do	
  DNA,	
  gerando	
  fragmentos	
  menores	
  e	
  mais	
  
facilmente	
  analisáveis.	
  	
  
Reação	
  em	
  Cadeia	
  da	
  Polimerase	
  	
  	
  
"Polimerase	
  Chain	
  ReacMon",	
  ou	
  PCR.	
  
.	
   
Genômica: Determinação	
  da	
  sequência	
  de	
  nucleofdeos	
  -­‐	
  tecnologias 
Kary	
  B.	
  Mullis	
  	
  
Prêmio	
  Nobel	
  de	
  Química	
  1993	
  
-­‐  Método	
  de	
  isolamento	
  e	
  amplificação	
  de	
  um	
  segmento	
  de	
  
DNA	
  -­‐	
  envolve	
  a	
  produção	
  "in	
  vitro"	
  de	
  milhões	
  de	
  cópias	
  do	
  
segmento	
  em	
  estudo	
  .	
  
-­‐	
  	
  	
  	
  Foi	
  desenvolvido	
  por	
  Kary	
  Mullis	
  (Cetus	
  CorporaMon,	
  
Emeryville).	
  Ele	
  recebeu	
  $20,000	
  	
  de	
  bonus	
  e	
  depois	
  o	
  
Prêmio	
  Nobel.	
  Mais	
  tarde,	
  a	
  patente	
  foi	
  vendida	
  para	
  
Hoffman-­‐LaRoche	
  por	
  $300,000,000. 
Reação	
  em	
  Cadeia	
  da	
  Polimerase	
  	
  	
  
"Polimerase	
  Chain	
  ReacMon",	
  ou	
  PCR.	
  
Ocorre	
  em	
  3	
  etapas:	
  
1.  A	
  desnaturação	
  da	
  dupla	
  fita	
  do	
  DNA,	
  em	
  alta	
  temperatura:	
  (90°C	
  )	
  
2.	
  O	
  pareamento	
  dos	
  "primers",	
  a	
  baixa	
  temperatura	
  :	
  50-­‐65°C	
  	
  
3.	
  A	
  duplicação	
  do	
  segmento	
  isolado	
  através	
  da	
  reação	
  da	
  DNA	
  polimerase	
  	
  
	
  
O	
  processo	
  é	
  cíclico	
  e	
  pode	
  ser	
  repe)do	
  "n"	
  vezes,	
  	
  dependendo	
  do	
  grau	
  de	
  
amplificação	
  que	
  se	
  deseja	
  	
  
Reação	
  em	
  Cadeia	
  da	
  Polimerase	
  	
  	
  
"Polimerase	
  Chain	
  ReacMon",	
  ou	
  PCR.	
  
Reação	
  de	
  PCR:	
  
1.  DNA	
  molde	
  
2.	
  Pequenos	
  "primers"	
  	
  de	
  DNA	
  que	
  se	
  ligam	
  às	
  extremidades	
  3'	
  ends	
  do	
  DNA	
  	
  
3.	
  Os	
  4	
  nucleofdeos:	
  A,	
  C,	
  G,	
  T	
  	
  
4.	
  DNA	
  polimerase	
  	
  especial	
  (Taq	
  polimerase):	
  funciona	
  em	
  altas	
  temperaturas;	
  
isolada	
  de	
  micoorganismos	
  que	
  vivem	
  em	
  fontes	
  termais	
  (Termus	
  aqua/cus	
  )	
  
	
  
Taq	
  é	
  uma	
  enzima,	
  que	
  foi	
  isolada	
  pela	
  primeira	
  vez	
  em	
  1971	
  de	
  uma	
  
bactéria	
  termófila	
  (Thermus	
  aqua/cus)	
  que	
  vive	
  nos	
  geisers	
  do	
  Parque	
  
Nacional	
  de	
  Yellowstone!!!	
  
Perfeita	
  para	
  resisMr	
  as	
  variações	
  de	
  temperatura	
  nas	
  reações	
  de	
  
PCR!!!	
  
	
  
Máquina de PCR 
Reação	
  em	
  Cadeia	
  da	
  Polimerase	
  	
  	
  
"Polimerase	
  Chain	
  ReacMon",	
  ou	
  PCR.	
  
Reação	
  em	
  Cadeia	
  da	
  Polimerase	
  	
  	
  
"Polimerase	
  Chain	
  ReacMon",	
  ou	
  PCR.	
  
 
 Qualquer tipo de ácido nucléico pode ser 
seqüenciado, amostras de RNA, DNA genômico, 
plasmídeos, cromossomas artificiais e produtos de 
PCR. 
 
 O primeiro método de seqüenciamento de 
DNA foi desenvolvido em meados dos anos 70 e ficou 
conhecido como Seqüenciamento Químico ou Maxam-
Gilbert Sequencing. 
 
 O segundo método de seqüenciamento de 
DNA ficou conhecido como Seqüenciamento 
Enzimático, Dideoxi ou Sanger-Coulson Sequencing. 
 
 
Era uma vez o Sequenciamento... 
Como determinar a sequencia de nucleotídeos? 
U N K N O W N S E Q U E N C E
Método Sanger de sequenciamento de DNA 
•  O que usar: 
- DNA molde 
- Primer com marcação radioativa 
- DNA polimerase 
- dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) 
- ddNTPs (ddATP, ddCTP, ddTTP, ddGTP) 
Método Sanger de sequenciamento de DNA 
Deoxiribonucleofdeo	
  Trifosfato	
  
dNTP	
  
Dideoxiribonucleofdeo	
  Trifosfato	
  
ddNTP	
  
P P P P P P 
Base Base 
OH H H H 
3’ 3’ 2’ 2’ 
Seqüenciamento de Sanger 
Visualização do DNA sintetisado 
Lendo as variações de fragmentos sintetizados.... 
(-) 
(+) 
maiores 
menores 
Add TP Tdd TP Gdd TP Cdd TP 
A T G Cdd dd dd dd TP TP TP TP 
Método	
  Dideoxi	
  ou	
  Sanger	
  
Exemplo de fragmentos resultantes: 
Genômica: 
 Determinação	
  da	
  sequência	
  de	
  nucleofdeos	
  -­‐	
  tecnologias 
5’ 
3’ 
Foto do Sequenciador 
Sequenciamento automático 
UMliza	
  os	
  mesmos	
  
dideoxinucleoIdeos	
  uJlizados	
  em	
  
Sanger,	
  marcados	
  com	
  
fluorescência.	
  	
  
	
  
Maior	
  avanço	
  :	
  uMlização	
  de	
  laser	
  
e	
  programas	
  de	
  computador	
  
específicos	
  para	
  detectar	
  o	
  sinal	
  
dos	
  ddNTPs.	
  
Sequenciamento Automático do 
DNA: com Leitor eletrônico de 
sequência 
Exemplo de Eletroferograma 
Sequenciamento automático