Bioquimica-Enzimas

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Claudia Didonet
Enzimas
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• com exceção de alguns RNAs que catalisam seu próprio processamento (Ribozimas), todas as enzimas são Proteínas;
• enzimas podem aumentar a velocidade de uma reação por um fator mais 1020 sobre uma reação não catalisada;
• algumas enzimas são tão específicas que catalisam somente um estereoisômero, outras catalisam uma família de reações similares;
Enzima: um catalisador biológico:
Catalisador : São substâncias que aceleram a velocidade de uma reação sem alterar a proporção entre os reagentes e produtos encontrada no final da reação e sem serem efetivamente consumidas durante o processo.
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RNA
Estrutura 
Enzimática
Ribozimas
Se covalente:
é chamado 
Apoenzima 
ou
Apoproteína
Grupo Prostético
Holoenzima
Cofator
Coenzima
Proteína
Pode ser:
 íon inorgânico
 mol. orgânica
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“Holoenzima” proteínas complexas (heteroproteínas)
• Parte não protéica : não desnaturada pelo calor “Coenzimas e Cofatores”
• Enzimas: parte protéica desnaturada pelo calor “Apoenzima”
Enzima apresenta:
- Sítio ativo (região responsável pela ligação ao substrato) 
 Grupo prostético (Cofatores e Coenzimas)
Variantes enzimáticas:
• Isoenzimas: enzimas com funções idênticas (mesma espécie)
• Heteroenzimas: enzimas com funções idênticas (diferentes espécies)
• Aloenzimas: variantes de enzimas e isoenzimas
Enzimas + cofatores e ou coenzimas
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•Enzima é uma propriedade (Função) das proteínas
•Enzimas são formadas apenas de a.as., exceto ribozimas
•Enzimas podem necessitar de componentes químicos adicionais com os cofatores.
Enzimas X Proteínas
• Os cofatores podem ajudar na função catalítica de uma enzima, como fazem os cofatores metálicos e os grupos prostéticos, ou tomam parte na reação enzimática, como fazem as coenzimas solúveis.
• Cofator inorgânico : Fe+2, Mn+2 (cofatores metálicos)
• Molécula orgânica: “grupo prostético” ligada firmemente ao corpo da enzima
• Molécula orgânica: “coenzima” não ligada firmemente ao corpo da enzima
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Cofatores metálicos
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 Século XIX - poucas enzimas identificadas
 - Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato: 
	* gorduras (lipo - grego) – LIPASE
	* amido (amylon - grego) – AMILASE
 - Nomes arbitrários:
	* Tripsina e pepsina – proteases
 1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União Internacional de Bioquímica (IUB)  nomear e classificar
 Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada:
1° dígito - classe
2° dígito - subclasse
3° dígito - sub-subclasse
4° dígito - indica o substrato 
Classificação enzimática
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Classificação enzimática
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1.Oxido-redutases(reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)
1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em C=O-
1.4.atuando em CH-NH2
1.5.atuando em CH-NH-
1.6.atuando em NADH, NADPH
2.Transferases(transferem grupos funcionais entre moléculas)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldeído ou cetona
2.3.gruposacil
2.4.gruposglicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxofre
3.Hidrolases(reações de hidrólise)
3.1.ésteres
3.2.ligações glicosídicas
3.4.ligações peptídicas
3.5.outras ligações C-N
3.6.anidridos ácidos
4.Liases(catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água, amônia e gás carbônico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5.Isomerases(transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros)
5.1.racemases
6.Ligases(catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre duas pré-existentes, sempre às custas de energia)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C
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ADP + D-Glicose-6-fosfato
ATP + D-Glicose
IUB - ATP:glicose fosfotransferase
E.C. 2.7.1.1
2 - classe - Transferase
7 - subclasse - Fosfotransferases 
1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila como receptor
1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato
Nome trivial: Hexoquinase
Classificação enzimática
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Mecanismos principais através dos quais as enzimas aceleram uma reação:
1.Catálise Ácido-Base: Aminoácidos do centro ativo, com cadeias laterais ionizáveis, são capazes de liberar prótons durante a catálise. A histidina, a cisteína, a tirosina e os aminoácidos ácidos (glutamato, aspartato) são importantes nestes processos.
2. Torção de Substrato: Pode ocorrer torção do substrato pela ligação do mesmo com o sítio de ligação da enzima, alcançando o estado de transição e estimulando sua conversão em produto.
3. Catálise Covalente: Ataques nucleofílicos ou eletrofílicos de um radical do sítio catalítico sobre o substrato, pode ligá-lo covalentemente à enzima e induzir a sua transformação em produto. Envolve com freqüência a participação de coenzimas.
4. Diminuição da Entropia: As enzimas posicionam o substrato no local correto da reação, facilitando os mecanismos anteriores.
Enzimas: Mecanismo de ação enzimática
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Não são consumidos na reação
H2O2
H2O
O2
+
Catalase
E + S
E + P
Catalisador
Não alteram o estado de equilíbrio
Abaixam a energia de ativação;
Keq não é afetado pela enzima.
Não apresenta efeito termodinâmico global 
G não é afetada pela enzima.
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E + S E S P + E
Substrato se liga ao 
SÍTIO ATIVO da enzima
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Emil Fischer (1894): alto grau de especificidade das enzimas originou  Chave-Fechadura , que considera que a enzima possui sitio ativo complementar ao substrato. 
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Koshland (1958): Encaixe Induzido , enzima e o substrato sofrem conformação para o encaixe. O substrato é distorcido para conformação exata do estado de transição.
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O efeito do pH sobre a enzima deve-se às variações no estado de ionização dos componentes do sistema à medida que o pH varia. 
Enzimas  grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.
pH òtimo = onde a atividade catalítica é máxima
A estrutura e a forma do centro ativo são uma decorrência da estrutura tridimensional da enzima e podem ser afetadas por quaisquer agentes capazes de promover mudanças conformacionais.
 pH
 Temperatura
 pH
Quais os fatores que podem afetar a atividade das enzimas?
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A estabilidade de uma enzima ao pH depende: 
 - temperatura;
 - força iônica;
 - natureza química do tampão;
 - concentração de íons metálicos contaminantes;
 - concentração de substratos ou cofatores da enzima;
 - concentração da enzima.
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 temperatura dois efeitos ocorrem:
 a taxa de reação aumenta, como se observa na maioria das reações químicas;
 a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.
 Temperatura ótima = T ideal para sua atividade máxima, é a temperatura máxima na qual a enzima possui atividade catalítica por um período de tempo.
A temperatura limite é aquela em que a enzima consegue manter a estrutura nativa.
Em geral acima de 50 -55C a maioria das proteínas globulares são desnaturadas.
Temperatura
Desnaturação = drástica alteração conformacional na molécula que acarreta
 perda do poder catalítico.
O efeito da temperatura depende: 
	- pH e a força iônica do meio;
	- a presença ou ausência de ligantes
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Outros fatores que afetam a atividade enzimática 
 Concentração da enzima 
 Concentração do substrato 
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 Velocidade de transformação do S em P depende da quantidade de E
 Desvios da linearidade ocorrem:
 Presença de inibidores na solução de enzima;
 Presença de substâncias tóxicas;
 Presença de um ativador que dissocia a enzima;
 Limitações impostas pelo método de análise.
Recomenda-se:
 Enzimas com alto grau de pureza;
 Substratos puros;
 Métodos de análise confiável.
Efeito da concentração da Enzima
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 [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P.
 Medir Vo = velocidade inicial da reação.
 [E] = constante.
 [S] pequenas  Vo linearmente.
 [S] maiores  Vo por incrementos cada vez menores.
 Vmax  [S]  Vo insignificantes.
 Vmax é atingida  E estiver na forma ES e a [E] livre é insignificante, então, E saturada com o S e V não  com 
de [S].
		vo
[S]
Vmax
Efeito da concentração do Substrato
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Diferença entre
a energia livre 
de S e P
Caminho da Reação
Energia de ativação com enzima
Energia
Energia de ativação sem enzima
S
P
Energia de ativação é a energia necessária para que a reação inicie ou ocorra.
As enzimas aumentam a velocidade da reação pela diminuição da energia de ativação da reação e não alteram seu ponto de equilíbrio
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Eficiência da Catálise
Vai depender da enzima e do substrato estarem com a conformação e as cargas adequadas para a interação
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1913 
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maud Menten - Pediatra
E + S
K1
K-1
ES
Kp
E + P
Etapa rápida
Etapa lenta
Cinética Enzimática
K1 – constante de velocidade de segunda ordem
Kp- constante de velocidade de primeira ordem 
K-1 –constante de velocidade de primeira ordem da conversão de ES para E+S
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Determinar as constantes de afinidade do S e dos inibidores;
Conhecer as condições ótimas da catálise;
Ajuda a elucidar os mecanismos de reação;
Determinar a função de uma determinada enzima em uma rota metabólica.
Cinética Enzimática
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A
B
v= k [A]
k = constante de velocidade da reação
2 A
B
C
+
v= k [A]2
 A + B
C + D
v= k [A] [B]
A velocidade das reações é explicada pela TEORIA DAS COLISÕES
Para reagir as moléculas presentes em uma solução devem colidir com orientação apropriada e que a colisão deve levá-las a adquirir uma quantidade mínima de energia que lhes permita atingir o estado reativo
Reação
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V =
Vmax [S]
Km + [S]
[S]
v
Vmax
2
v = Vmax
v = Vmax [S]
Km
Km
1
2
3
1- [S]  Km>>[S] 
2- [S]  [S]>>Km
3- v = Vmax
2
Equação de Michaelis-Menten
Km e igual a concentração do substrato quando a reação atinge a metade da velocidade máxima .
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Duplo Recíproco Linewear-Burk
Inclinação = Km
Vm
Inverso
Transformação algébrica
Hipérbole retangular
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Km = medida da “afinidade” da enzima pelo substrato (nas considerações da cinética enzimática de velocidade de ligação)
Km
Afinidade
Km
Afinidade
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Kcat= constante catalítica número de moléculas de substrato convertida em produto por unidade de tempo (renovações da enzima) 
Equivale ao número máximo de mol de substrato que um centro ativo converte em produto por segundo.
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Enzyme Commission: “uma unidade (U) de atividade é a quantidade de enzima que catalisa a transformação de 1 micro mol de substrato ou a formação de 1 micro mol de produto por minuto”.
 Expressa: U = micro moles de produto/minuto 
Atividade específica = U/mg de proteína
Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima  o substrato [S] de modo a permitir que toda a enzima [E]  [ES].
V = K[E] = K[ES] 
Medidas de atividade enzimática
Inibidores Enzimáticos
Substâncias que atuam diminuindo a atividade enzimática.
Atuam na regulação enzimática das enzimas intracelulares podendo controlar efetivamente o metabolismo.
Podem ser :
 Irreversíveis Ex: organofosforados, aspirina 
- Reversíveis
Competitivos
Não-competitivos
Misto
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Competem com o substrato pelo sítio ativo da enzima
Competitivos
Certas moléculas por apresentarem configuração espacial semelhante, são capazes de ligarem-se no centro ativo da enzima produzindo um complexo enzima inibidor.
E + Ic
E Ic
Ic= inibidor competitivo
Produto
A concentração do inibidor vai afetar a ação enzimática
Vo = Vmax [S]
Km (1+ [IC]) + [S]
KIC
KIc = constante do inibidor mede a afinidade da enzima pelo inibidor
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Não-Competitivos
Não tem nenhuma semelhança estrutural com o substrato da reação que inibem.
Seu efeito ocorre pela ligação à um sítio que não o sítio ativo o INC ocorre no resíduo da cadeia lateral de um aminoácido –OH da serina ou cisteína sendo bastante inespecífico podendo afetar a ação de grande número de enzimas.
O fato de sua ligação à molécula de enzima ser reversível não diminui seu poder de ação.
E + INC
E INC
Produto
O inibidor pode ainda se ligar no complexo ES gerando um complexo ternário
ESINC
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43
Misto
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a) Enzima sem substrato
b) Enzima com substrato
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 Não obedecem a cinética de Michaelis-Menten.
 Controlam a etapa limitante em uma cadeia de reações enzimáticas.
 Tem sua atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a determinados sinais, moléculas sinalizadoras (pequenos metabólicos ou cofatores).
 Classes de enzimas reguladoras:
 Enzimas alostéricas;
 Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível.
Enzimas Regulatórias 
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 Enzimas alostéricas
Funcionam através da ligação não-covalente e reversível de um metabólito regulador chamado modulador;
Moduladores podem ser inibidores ou ativadores;
São maiores e mais complexas, possuem duas ou mais cadeias polipeptídicas.
Enzimas reguladas pela modificação covalente reversível
Grupos químicos são ligados covalentemente e removidos da enzima reguladora por enzimas ≠, podem ser: fosfato, adenosina monofosfato, grupos metil, etc.
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1- Comportamento tipo Michaelis-Menten.
2- Comportamento Alostérico.
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Isoenzimas 
	são enzimas com múltiplas formas que catalisam essencialmente a mesma reação. 
O termo isoenzima ou isozima deve ser aplicado somente àquelas múltiplas formas de enzimas derivadas de diferenças determinadas geneticamente na estrutura primária. 
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Inibição pelo produto final 
 produto final de uma sequencia de reações inibe a primeira reação da série.
É uma forma eficiente de mecanismos de controle
Retrocontrole ou “feedback”
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Análogos de Substratos
 Possuem estrutural semelhante ao de substratos naturais;
 Ligam-se ao centro ativo
 Formam produto diferente do normal
 Interrompem a sequencia metabólica da via 
Ex: Fluroacetato – análogo do acetato –
Este vai ser convertido à fluoracetil-CoA e origina fluorcitrato que não é reconhecida pela enzima aconitase e vai parar o ciclo de krebs.
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Imobilizadas
Reutilização 
Maior estabilidade (faixas mais amplas de pH e temperatura)
Menor interferência de inibidores e/ou ativadores
Livres 
Instabilidade
Rápida perda da atividade catalítica
Não podem ser recuperadas
 Enzimas Livres versus Enzimas Imobilizadas
Imobilização 
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A enzima livre é imobilizada em um suporte inerte como vidro poroso, bentonite, etc.
O principal interesse em imobilizar uma enzima é obter um biocatalisador com atividade e estabilidade que não sejam afetadas durante o processo, em comparação à sua forma livre. 
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Vantagens da utilização de enzimas imobilizadas
- As enzimas podem ser reutilizadas
- Os processos químicos podem ser continuamente operados e prontamente controlados
- Os produtos podem ser facilmente separados
- Os problemas com efluentes e manipulações de materiais são minimizados
- A reprodutibilidade do procedimento analítico pode ser aumentada
- Em alguns casos, as propriedades enzimáticas (atividade e estabilidade operacionais) podem ser alteradas
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