IDENTIFICA E QUANTIFICAÇAO DE CARBOIDRATOS

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CURSO TECNICO EM BIOTECNOLOGIA
DISCIPLINA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
PROF.ª BIANCA PFAFFENSELLER
Prática IX e X:
Identificação e Quantificação de Carboidratos
ALUNAS: JESSIKA LARA, PAULA SOARES E THAYANA DA SILVA
Porto Alegre, 15 de julho de 2014
Objetivo: Identificar a presença de pentoses e açúcares redutores através de testes qualitativos; Utilizar um método espectrofotométrico de quantificação de carboidratos. Determinar a concentração de açúcares redutores em uma amostra biológica pelo método do ácido 3,5-dinitrosalicílico (ADNS). 
Material por grupo: 
Prática 1
- 4 estantes para tubos de ensaio. 
- 2 mL de cada solução dos açúcares a 1% (glicose, sacarose, frutose, lactose e amido). 
- 8 mL de cada solução dos açúcares a 2% (glicose, sacarose, xilose, frutose, lactose e amido). 
- Reativo de Bial (7 mL), Reativo de Molisch (5 mL), reativo de Benedict (15 mL) e ácido dinitrosalicílico (7 
mL). 
- 21 tubos de ensaio grandes. 
- 5 mL de Ácido Sulfúrico concentrado. 
- Banho Maria. 
- 7 Pipetas de vidro de 1 mL (1 para cada açúcar). 
- 2 Pipetas de vidro de 5 mL/ 2 Pipetas de vidro de 10 mL
Prática 2
- 300 uL Leite (diluído 40 X). 
- 5 mL Solução padrão de glicose 5 mg/mL. 
- 15 mL de reagente ADNS (75 g de tartarato duplo de sódio e potássio, 0,25 g de ácido dinitrosalicílico 
e 50 mL de NaOH 2 M). 
- 06 tubos de ensaio grandes. 
- Estantes ara tubos de ensaio. 
- 13 tubos eppendorf. 
- Micropipeta de 100-1.000 uL e de 20-200 uL. 
- Ponteiras grandes e pequenas. 
- 1 pipeta de vidro de 5 mL para o ADNS. 
- Banho Maria. 
- Espectrofotômetro. 
Introdução:
Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na face da terra. Apresentam estruturas muito parecidas entre si, o que os torna quase impossíveis de serem identificados. Assim, o que se pode fazer é caracterizar grupos de carboidratos utilizando suas propriedades químicas comuns.
Monossacarídeos
Na natureza, os monossacarídeos mais abundantes são as hexoses (6 carbonos), embora também estejam muito presentes nas plantas aqueles constituídos por outros números de carbonos (3 carbonos, trioses; 4 carbonos, tetroses; 5 carbonos, pentoses), assim como compostos derivados. Os representantes típicos são a glicose, a frutose e a galactose.
Oligossacarídeos
São polímeros constituídos por número variável de monossacarídeos (de 2 a 20). Portanto, o número dos possíveis oligossacarídeos é muito grande, e sua natureza, diversa; porém, são poucos os que se encontram em grandes quantidades nos alimentos, sendo que vários deles são o resultado da hidrólise dos polissacarídeos; são compostos normalmente por glicose, galactose e frutose. Os mais comuns são: sacarose, galactose, maltose, trealose (dissacarídeo), rafinose (trissacarídeo) e estaquiose (tetressacarídeo)
Polissacarídeos
São polímeros formados por mais de 20 monossacarídeos dispostos de forma linear ou ramificada. Se todos os monômeros constituintes são do mesmo açúcar, os polissacarídeos denominam-se homoglicanas (celulose, amilose, amilopectina). Quando são de diferentes açúcares, denominam-se heteroglicanas. A consequente diversidade de polissacarídeos quanto à sua composição faz com que as propriedades dessas moléculas de alto peso molecular sejam muito distintas daquelas dos monossacarídeos que as constituem; assim, dissolvendo-se com mais dificuldade.
Polímeros insolúveis de carboidratos funcionam tanto como elementos estruturais quanto de proteção nas paredes celulares bacterianas e vegetais e nos tecidos conjuntivos de animais. Outros polímeros de carboidratos agem como lubrificantes das articulações esqueléticas e participam do reconhecimento e coesão entre as células. Polímeros mais complexos de carboidratos, ligados covalentemente a proteínas ou lipídios, agem como sinais que determinam a localização intracelular ou o destino metabólico destas moléculas híbridas. 
Identificação qualitativa de carboidratos
Reação de Bial - O teste de Bial é uma reação colorida especifica para as pentoses. Em condições controladas as pentoses desidratam rapidamente transformando em furfural. Na presença do ion férrico, o orcinol e o furfural condensam-se rapidamente dando produto azul.
Reação de Molisch - Quando aldeídos desidratam em furfurais ou hidroximetilfurfurais, ao se complexarem com fenóis e seus derivados, produzem substâncias coradas em violeta. Assim, a reação de Molisch é utilizada para a detecção qualitativa de glicídios em geral que formam furfurais (pentoses) ou hidroximetilfurfurais (hexoses) pela ação desidratante de ácidos concentrados na presença de alfa-naftol. 
Reativo de Benedict - O teste de Benedict é baseado na redução do Cu2+ a Cu+ devido ao poder redutor das carbonilas em solução alcalina. O íon cuproso (Cu+) produz o Cu2O, composto de cor vermelho-tijolo. Todos os monossacarídeos reagem positivamente, logo, frutose e glicose reação. Os dissacarídeos dependem da presença de uma extremidade redutora, fato que não ocorre no caso da sacarose.
Identificação de açúcares redutores com o ácido dinitrossalicílico - (ADNS) O método do DNS é um método onde ocorre a oxidação do grupo carbonila. O oxidante, chamado DNS utiliza o ácido dinitro-salicílico; sal de Rochelle, (solução de tártaro de sódio de potássio) que serve para prevenir o reagente da ação do oxigênio dissolvido; fenol, que é utilizado para aumentar a quantidade de cor produzida; bissulfito, que é um estabilizante da cor obtida na presença do fenol; hidróxido de sódio, que é o redutor da ação da glicose sobre o ácido dinitro-
salicílico. No método do ácido 3,5-dinitrossalicílico (ADNS), usado para quantificar açúcares redutores, ocorre uma reação, em meio alcalino, com o referido ácido convertendo-se em ácido 3-amino-5-nitrossalicílico por ação dos açúcares redutores, dando origem a um complexo tijolo, que por sua vez é quantificado espectrofotometricamente.
Procedimentos:
Prática 1
Experimento 1 
1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. 
	
	TUBO 1
	TUBO 2
	TUBO 3
	TUBO 4
	TUB0 5
	1mL de:
	Glicose 2%
	Sacarose 2%
	Xilose 2%
	Amido 2%
	Água
	Reativo de Bial (mL).
Este procedimento deve ser realizado em capela de exaustão
	1 mL
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
2. Aquecemos em banho-maria fervente por 5 minutos. 
Experimento 2
1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. 
2. Após adicionamos 1 mL do reativo e agitar os tubos. 
	
	TUBO 1
	TUBO 2
	TUBO 3
	TUBO 4
	TUBO 
	1mL de:
	Glicose 1%
	Frutose 1%
	Sacarose 1%
	Amido 1%
	Água
	Reativo de Molisch
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
	Ácido sulfúrico conc.
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
*Observação: Na capela: O ácido sulfúrico concentrado deve ser o último: Adicionar cuidadosamente em cada tubo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado (não agitar), inclinando-o e deixando o ácido escorrer lentamente pelas paredes do tubo. Deixar os tubos em repouso e observar a formação de um anel de cor violeta.
Experimento 3
1. Pipetamos conforme a tabela abaixo. 
	
	TUBO 1
	TUBO 2
	TUBO 3
	TUBO 4
	1mL de:
	Glicose 2%
	Sacarose 2%
	Lactose 2%
	Água
	Reativo de Benedict
	2mL
	2mL
	2mL
	2mL
2. Aquecemos em banho-maria fervente por 3 minutos. 
Experimento 4
1.Pipetamos conforme a tabela abaixo. 
	
	TUBO 1
	TUBO 2
	TUBO 3
	TUBO 4
	1mL de:
	Glicose 2%
	Sacarose 2%
	Lactose 2%
	Água
	ADNS
	1mL
	1mL
	1mL
	1mL
2. Aquecemos em banho-maria fervente por 5 minutos. 
Prática 2
- Diluimos a amostra (leite) 40X. 
- Pipetamos a curva padrão em uniplicata conforme tabela abaixo: 
	Concentração final de glicose (mg/mL)
	Volume glicose a 5 mg/mL (mL)
	Água (mL)
	1,0
	1000uL
	0,0
	0,8
	800uL
	0,2
	0,6
	600uL
	0,4
	0,4
	400uL
	0,6
	0,2
	200uL
	0,8
	0
	0
	1,0
- Identificamos 13 tubos de ensaio pequenos com a respectiva concentração da curva padrão + 2 tubos identificados como “amostra”. 
- Pipetamos 1000 µL (1 mL) da solução de ADNS para tubos previamente identificados. 
- Transferimos 100 µL decada ponto da curva para os tubos contendo o ADNS (11 tubos). 
- Pipetamos 100 µL da amostra (leite diluído 40 X) em 2 dos tubos (identificados como “amostra”) contendo o ADNS. 
- Aquecemos a mistura em banho-maria, com água fervente, por 10 minutos. 
- Resfriamos as soluções até temperatura ambiente. 
- Zeramos o espectrofotômetro com o branco. Determinamos as absorbâncias a 570 nm (A570). 
- Anotamos as absorbâncias na tabela abaixo. 
- Calculamos o FCM (Fc= Q / A) a partir dos dados da curva padrão. 
- Calculamos a concentração de açúcares redutores do leite (C = A X FCM)
Resultados:
Prática 1:
1º Reativo de Bial
2º Reativo de Molisch
3º Reativo de Benedict
4º ADNS
Prática 2: 
	Curva Padrão
glicose (mg/mL)
	ABS
	1,0
	0,402
	0,8
	0,354
	0,6
	0,235
	0,4
	0,151
	0,2
	0,077
	0
	Branco
	Amostra 1
	0,520
	Amostra 2 
	0,533
Cálculo FC:
1,0/0,402 = 2,48
0,8/0,354 = 2,25
0,6/0,235 = 2,55	
0,4/0,151 = 2,64
0,2/0,077 = 2,77
Cálculo FCM:
2,48 + 2,25 + 2,55 + 2,64 + 2,77 = 12,69/5 = 2,538
Amostra 1 – 0,520 x 2,538 = 1,319
Amostra 2 – 0,533 x 2,538 = 1,352
Concentração média = 1,319 + 1,352 = 2,671/2 = 1,3355 x 40 (diluição feita do leite) = 53,42mg/mL. 	
Discussão: Na prática 1, obervamos 4 métodos de identificação de pentoses, hexoses e açucares redutores.
O primeiro teste realizado foi reação de Bial, esse teste é para identificar pentoses. Usamos glicose (C6H12O6), sacarose (C12H22O11), xilose (C5H10O5), amido (C6H10O5) e água. O único que reagiu foi a xilose. 
O segundo procedimento foi a reação de Molish. Serve para identificação de pentoses ou hexoses. Usamos glicose (C6H12O6), frutose (C6H12O6), sacarose (C12H22O11), amido (C6H10O5) e água. Reagiu frutose, sacarose e o amido. Mas, não entendemos porque a glicose não reagiu e a sacarose sim, acho que trocamos os tubos glicose-sacarose! 
O terceiro e o quarto experimento foi com o reativo de Benedict e ADNS, ambos para identificação de açucares redutores. Usamos glicose, sacarose, lactose e água. Pudemos confirmar que glicose e lactose são açucares redutores e sacarose não é. 
Prática 2
235 mL de leite _ 12g de carboidratos
1 mL de leite _ Xg de carboidratos
= 0,051g ou 51mg/mL
Nosso grupo chegou num resultado muito próximo do esperado, já que uma porção de leite (235 mL) tem aproximadamente 12g de carboidratos, isto é 1mL teria em média 51mg/mL, e nos encontramos o valor de 53,42mg/mL. 
Referências
Protocolo da aula prática – Identificação de carboidratos
Protocolo da aula prática – Quantificação de carboidratos 
http://www.ehow.com.br/leite-aumentar-niveis-glicemicos-sobre_8141/
http://www.ebah.com.br/content/ABAAABt54AF/bioquimica-relatorio-carboidratos
http://adamogama.blogspot.com.br/2012/07/teste-de-bial.html