Biologia Molecular

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BIOTECNOLOGIABIOTECNOLOGIA
ÁCIDOS NUCLÉICOSÁCIDOS NUCLÉICOS
FARMÁCIA FARMÁCIA –– 2º ano2º ano
Bioquímica Farmacêutica Prof. Evandro S. Bioquímica Farmacêutica Prof. Evandro S. RicardiRicardi
 ÁCIDOS NUCLÉICOS
Todas as células dos seres vivos possuem DNA e RNA, com exceção 
dos vírus que não são organismos celulares e possuem DNA 
(desoxiribonucleic acid) ou RNA (ribonucleic acid )em sua composição, 
nunca os dois ao mesmo tempo.
Os ácidos nucléicos são polinucleotídeos, ou seja, moléculas
orgânicas formadas pela união de uma molécula de ácido fosfórico,
um monossacarídeo de pentose e uma base nirogenada (Purinas e
Pirimidinas).
Existem dois tipos de ácidos nucléicos: ácido desoxirribonucléico
(DNA) e ácido ribonucléico (RNA)
NUCLEOTÍDEOS
Os nucleotídeos são substratos que apresentam diversas funções no organismo humano.
Dentre elas destacam-se:
1) é carregador de energia química na forma de ATP (adenosina trifosfato);
2) atua na constituição de enzimas, como a coenzima A;
3) age como molécula sinalizadora celular, por exemplo, o AMP (adenosina monofosfato)
cíclico e
4) participa da construção dos ácidos desoxirribonucléico (DNA) e ribonucléico (RNA).
Nucleotídeo
PENTOSES
BASES NITROGENADAS
 COMPOSIÇÃO DIFERENTE
DNADNA RNARNA
Bases Púricas Adenina (A)
Guanina (G)
Adenina (A)
Guanina (G)
Bases 
Pirimídicas
Citosina (C)
Timina (T)
Citosina (C)
Uracila (U)
Pentoses Desoxirribose Ribose
FORMAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
A ligação entre os nucleotídeos ocorre, portanto, através de ligações
covalentes extremamente fortes tendo um grupamento fosfato como ligante, as ligações
fosfo-di-éster. Essas ligações garantem um "esqueleto" covalente rígido para a molécula
de ácido nucléico e que só é clivado sob ação de enzimas hidrolíticas digestivas
denominadas de nucleases (DNase e RNase).
A ligação entre as moléculas de nucleotídeos que permite a polimerização e a
estrutura final do DNA e RNA ocorre entre a hidroxila do C3' de um nucleotídeo com o
fosfato hidroxila do C5' do outro nucleotídeo, de forma que sempre o C5' do primeiro
nucleotídeo terá um fosfato livre, enquanto que o último nucleotídeo adicionado terá
sempre -OH livre no C3'.
Esta uniformidade na configuração da cadeia polimérica de nucleotídeos, tanto
de DNA quanto de RNA, confere uma direção à molécula onde é convencionado que o
primeiro nucleotídeo de uma determinada sequência é o que tem a extremidade 5' livre,
enquanto que o último terá a extremidade 3' livre.
FORMAÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLÉICOS
ESTRUTURA DO DNA
Os nucleotídeos de um mesmo filamento
estão ligados entre si, através de uma
ligação que ocorre entre a pentose de
um nucleotídeo e o fosfato do
nucleotídeo seguinte.
Os dois filamentos da molécula de DNA,
permanecem ligados, por pontes de
hidrogênio, entre bases nitrogenadas
correspondentes.
Observe que a base Timina (T) liga-se
sempre a base Adenina (A); e a base
Guanina (G), liga-se sempre a Citosina
(C). Logo em uma molécula de DNA a
quantidade de T=A e G=C !!
Em 1953, James Watson e Francis Crick propuseram
um modelo para o DNA. Segundo este modelo a
molécula de DNA, é formada por dois filamentos
(cadeias) de nucleotídeos, enrolados ente si, formando
uma dupla-hélice.
ESTRUTURA DO DNA
Os pares de bases são mantidos juntos por pontes de hidrogênio: duas entre A e T , e
três entre G e C. Estas pontes de hidrogênio, mais as interações hidrofóbicas entre as
bases fixas, estabilizam a estrutura da dupla hélice.
GUANINA
ESTRUTURA DO DNA
Estrutura do DNA possui uma volta completa possui cerca de 3,4nm e 10 pares de bases
(resíduos); à distância entre as fitas é de cerca de 2,0nm. A cavidade maior e menor são
sítios de ligação a proteínas estabilizadoras e da replicação.
ESTRUTURA DO DNA
 Formas Estruturais da Dupla Hélice:
1. Forma A : também é uma hélice voltada para a direita com 11 resíduos por volta de 360° de
hélice.
2. Forma B : é uma hélice voltada para a direita com 10 resíduos por volta de 360° de hélice.
(DNA cromossômico).
3. Foram Z: é uma hélice voltada para a esquerda com 12 resíduos por volta de 360° de hélice.
 ESTRUTURA DO RNA
Diferentemente do DNA a molécula de RNA é constituída por apenas um filamento de
nucleotídeo. Já sabemos que estes nucleotídeos apresentam a ribose como pentose e
como bases, a Adenina (A), Citosina (C), Guanina (G) e Uracila (U). Note que a uracila
é exclusiva do RNA e que a timina não aparece em sua constituição.
 Existem três tipos básicos de RNA: mensageiro (RNAm), transportador (RNAt) e
ribossômico (RNAr).
 RNAm: fita simples em forma linear, para que possa ser “lida” pelos ribossomos durante
a síntese protéica.
 RNAt e RNAr: também fita simples, que se arranja, na maioria das vezes, formando
pregas entre si, em virtude de pontes de hidrogênio ocorridas entre as bases nitrogenadas
dos nucleotídeos da própria cadeia. Estas pregas dão a conformação e um grampo de
cabelo (hairpins) às regiões onde elas ocorrem.
ESTRUTURA DO RNA
Duplicação do DNA
 Replicação: é o processo de auto-duplicação do material genético
mantendo assim o padrão de herança ao longo das gerações.
 Controlador da expressão gênica : divisão celular.
 Ocorre na Fase S da Intérfase.
 Semiconservativa: metade da molécula original se conserva íntegra
em cada uma das duas moléculas-filhas.
 DNA polimerase e DNA ligase.
Duplicação do DNA
DNADNA polimerasepolimerase : rompe as ligações de ponte de hidrogênio
DNADNA ligaseligase :: emparelhamento das bases nitrogenadas
Início da replicação: tripleto de iniciação
Duplicação do DNA
Helicase: abre a cadeia, quebrando as PH.
RNA primase: primer de RNA.
DNA polimerase III: continuar o processo que
ocorre no sentido da extremidade 5' para a
extremidade 3' da nova cadeia.
Topoisomerase e Proteínas SSB: inibem o
enovelamento da cadeia
DNA Recombinante
 Produção de fragmentos de DNA de fontes diferentes que contenham as
sequências gênicas de interesse;
 Reunião desses segmentos em uma molécula de DNA capaz de se
replicar, normalmente um plasmídeo bacteriano chamado vetor;
 Transformação de células bacterianas com a molécula recombinante de
modo que elas se repliquem e então se expressem.
 endonucleasesendonucleases dede restriçãorestrição (( “tesouras“tesouras biológicas”)biológicas”)-- enzimasenzimas queque clivamclivam
oo DNADNA dede dupladupla fitafita emem fragmentosfragmentos menores,menores, denominadosdenominados dede fragmentosfragmentos
dede restriçãorestrição..
DNA Recombinante
Palíndromos: exibem simetria rotacional, assim se a seqüência em um
filamento é GAATTC lida no sentido 5'3', a seqüência no sentido oposto é
CTTAAG lida no sentido 3' 5', mas quando ambos os filamentos são lidos no
sentido 5' 3' a seqüência é a mesma.
5' G A A T T C 3'
3' C T T A A G 5'
 
a) Clivagem no eixo de simetria
Moléculas com extremidades abruptas Moléculas com extremidades coesivas
b) Clivagem simétricamente situada ao
redor do eixo de simetria
...TC GA...
...AG CT...
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
+
...GAA TTC...
...CTT AAG...
+
3 ’
5 ’ 3 ’
5 ’
DNA Recombinante
Microrganismo Enzima Sequência Alvo
EcoRIEscherichia coli
Bacillus amyloliquefaciens H
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Haemophilus aegyptius
Providencia stuartii
Streptococcus albus G
Thermus aquaticus
Serratia marcescens
Brevibacterium albidium
Bacillus globigii
BamHI
BglII
PstI
BalI
SmaI
HaeIII
TaqI
SalI
HindIII
HaeII
G A A T T C
C T T A A G
G G A T C C
C C T A G G
A G A T C T
T C T A G A
P G C G C P i
P i C G C G P
u
y u 
A A G C T T
T T C G A A
C T G C A G
G A C G T C
G T C G A C
C A G C T G
T G G C C A
A C C G G T
 A G G C C T 
 T C C G G A
C C C G G G
G G G C C C
T C G A
A G C T
Criação do DNA Recombinante
Envolve a união de um fragmento de DNA a uma molécula maior, utilizando-
se uma endonuclease de restrição e a DNA ligase.
 Amplificação: introdução de uma molécula de DNA em uma célula em
replicação, permitindo várias cópias.
Vetores de Clonagem Molecular
vetor : uma molécula de DNA à qual o fragmento de DNA a ser clonado está 
ligado.
 Replicação autônoma
 Sequência reconhecida pela endonuclease de restrição
 Plasmídeos e Vírus
Criação do DNA Recombinante
Plasmídeos: pequenas moléculas
de DNA circular, extracromossômico,
Criação do DNA Recombinante
Criação do DNA Recombinante
Bibliotecas de DNA
Uma biblioteca de DNA é uma coleção de fragmentos de DNA obtidos a partir
da ação das endonucleases de restrição, ligados aos vetores apropriados e
clonados.
Bibliotecas Genômicas: é a coleção de fragmentos de DNA de dupla fita
obtida por digestão do DNA total do organismo.
Bibliotecas de DNA complementar (DNAc): é uma cópia da fita do RNAm.
Criação do DNA Recombinante
Sondas
As sondas de DNA são sequências de fita única de DNA que hibridizam -
pareiam - com a sequência de interesse, destacando-as do restante da
biblioteca. Estas sondas podem ser marcadas com um isótopo radioativo
(32P), um anticorpo, uma substância fluorescente ou outro método de
detecção.
Southern Blot
Técnica que utiliza conjuntos de enzimas de restrição e sondas de DNA.
Detecta mutações no DNA.
Criação do DNA Recombinante
1. Desnaturação com solução alcalina.
2. Transferência do DNA para a membrana de
nitrocelulose.
3. Tratamento com a Sonda.
Criação do DNA Recombinante
Criação do DNA Recombinante
PCR – Reação em Cadeia da Polimerase
A reação em cadeia da polimerase (PCR, do inglês Polymerase Chain
Reaction) e´um método de tubo de ensaio para amplificar uma sequência de
DNA, que não se baseia no método de clonagem biológica. O método pode
ser usado para amplificar sequências de DNA de qualquer fonte –
bacteriana, viral, vegetal ou animal.
Criação do DNA Recombinante
Etapas da PCR:
1. Construção de um primer: construção por síntese química de dois
oligonucleotídeos de DNA (iniciadores) complementares as extremidades de
cada fita de DNA. Estes oligonucleotídeos servem como iniciadores da síntese
de DNA in vitro, que é catalisada pela DNA polimerase, a qual amplificará
repetitivamente porções alvo do DNA.
2. Desnaturar o DNA : Um ciclo de PCR começa com a desnaturação por calor
(95°C), que promove a separação da fita dupla de DNA em fitas simples.
3. União dos primers ao DNA de fita simples: A reação é resfriada na
presença de um excesso dos dois oligonucleotídeos (um primer para cada fita),
possibilitando a hibridização dos dois iniciadores com a seqüência
complementar presente no DNA alvo.
4. Extensão da cadeia: Em seguida, a reação é incubada para atividade da
DNA polimerase, produzindo novas fitas de DNAs a partir dos iniciadores e
utilizando o quatro desoxirribonucleotídios (dATP, dCTP, dGTP e dTTP).
Criação do DNA Recombinante
Criação do DNA Recombinante
Resultado de uma investigação de um crime
(estupro). O DNA da vítima, dos suspeitos, do
namorado e do material colhido na vagina
(evidência ou corpo de delito) foi obtido. Um
DNA controle também é empregado no ensaio.
As bandas obtidas do suspeito 1 coincidem
com as obtidas do esperma do corpo de
delito. As bandas obtidas do DNA das células
da mulher, obtidas em mistura com o esperma,
coincidem com as bandas da vítima (de fato, o
DNA é da vítima).
Mitomicina C: antibiótico que promove ligações covalentes entres as duas fitas,
impedindo a separação delas e a sua replicação.
6-Mercaptopurina: inibe a síntese de ácido adenílico, precursor na produção de ácidos
nucléicos.
Metrotexato: inibe a enzima que forma o ácido tetraidrofólico, importante na síntese dos
ácidos nucléicos.
Actonomicina: antibiótico que se liga aos resíduos de guanina do DNA, impedindo que a
RNA polimerase se transloque na fita, do modo que o RNA não seja sintetizado.
Rifamicina: antibiótico que se liga a RNA polimerase, impedindo sua atividade na
transcrição.
Ácido Nalidíxico: potente inibidor da replicação em procariotos, agem sobre as “Girase A”.
Inibidores da Biossíntese de Ácidos Nucléicos
Cloranfenicol: antibiótico que inibe a peptidil-transferase, impedindo a ligação peptídica,
desse modo não sintetiza proteína.
Estreptomicina: inibe a ligação dos aminoácidos do RNAt no sítio A do ribossomo.
Tetraciclinas: bloqueia o sítio A, também inibindo a ligação dos aminoácidos do RNAt no
sítio A do ribossomo.
Inibidores da Biossíntese de Proteínas:
 Inibidores da transcriptase reversa: fármacos anti-HIV: zidovudina (AZT),
abacavir, lamivudina, didanosina, zalcitabina e estavudina.
 Inibidores da Protease: fármacos anti-HIV: saquinavir, nelfinavir, indinavir,
amprenavir. RNAm transcrito do pró vírus “origina” proteínas virais através de
protease específica do vírus HIV, esse retrovirais inibem essas proteases.
 Inibidores da DNA polimerase: aciclovir (Herpes), ganciclovir (citomegalovírus
Antivirais