Escurecimento Enzimático

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ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO
Este tipo de escurecimento ocorre em muitas frutas e vegetais, como batatas, maçãs e bananas quando o tecido é machucado, cortado, descascado, infectado, ou exposto a quaisquer condições anormais. O tecido machucado rapidamente escurece quando exposto ao ar, devido a conversão de compostos fenólicos a melaninas escuras.
	A enzimas responsável pelo inicio desta reação de escurecimento é conhecida por vários nomes tais como polifenol-oxidase ou fenolse (o-defenol:oxigênio oxidoresutase). Para que a reação catalisada por esta enzima proceda, o grupo prostético cúprico e oxigênio devem estar presentes. Acredita-se que o cobre seja monovalente no caso da enzima da batata. Fenolase é classificada como uma oxidoredutase, e a função do oxigênio é atuar como um aceptor de hidrogênio. Esta enzima também ocorre em fungos além de cogumelos e alguns tecidos animais, mas isto não é importante em temos alimentares.
	
MECANISMO DA REAÇÃO
	O complexo fenolase pode ser divido em dóis tipos de reação: a fenol hidoxilase ou atividade cresolásica e a polifenol oxidase ou atividade catecolásica. Isto é ilustrado pela oxidação da L-tirosina (reação 1 e 2) que é o composto fenólico mais abundante nos tubérculos de batata e pela concentração enzimática que parece ser o fator limitante na velocidade de escurecimento. Assim para a reação 1 o substrato é um monofenol, e para a reação 2 o substrato é um difenol. Reação 2 é seguida pela remoção de hidrogênio e formação de composto vermelho chamado de dopacromo (5,6-quinona-indol-2ácido carboxílico), que contem um anel heterocíclico derivado do fechamento da cadeia lateral do amino ácido carboxílico. Dopacromo subseqüentemente sofre plimerização para formar melaninas escuras.
	
3,4-Dihidroxifenilalanina			O-quinona fenilalanina
Catecol sendo um o-difenol, é rapidamente atacado por fenolase, e somente exibe reação de tipo da catecolase.
A formação da quinona é dependente de enzima e de oxigênio. Uma vez que isto tenha ocorrido, as reações subseqüentes são espontâneas e não dependem mais da presença da fenolase ou de oxigênio.
	Pensa-se que a primeira reação seja uma hidroxilação secudaria da o-quinona ou do excesso de o-difenol:
O composto trihidroxibenzeno resultante interage com a o-quinona formando hidroxiquinona.
As hidroxiquinonas polimeram-se e são progressivamente convertidas a polímeros de cor vermelha e vermelho-amarronzada e finalmente em melaninas escuras que aparecem, por exemplo, no local da danificação mecânica de um tubérculo de batata, ou na superfície cortada de uma maça.
ESTUDOS INICIAIS SOBRE FENOLASE
	O primeiro estudo sobre este assunto é atribuído a Lindet, que em 1895 trabalhando com cidra reconheceu a natureza enzimática do escurecimento observado. Onalow em 1920 demonstrou que o escurecimento enzimático do tecido vegetal no ar era devido a presença de o-difenois, tais como, catecol, ácido protocatechuico (ácido 3,4-dihidroxibenzoico), e ácido cafeico (acido 3,4-dihidroxicinâmico), mais as enzimas apropriadas (oxidases). Acreditava-se que o produto da reação enzimática era um peróxido que podia reagir com um “cromógeno” formando, um pigmento escuro. Muitas frutas e vegetais, por exemplo, maçâs, pêras, apricots, e batatas, contem substâncias fenólicas e suas oxidases.De outro modo, frutas tais como as cítricas, abacaxis e groselhas não tem estas substâncias e foram denominadas, “plantas peroxidases.
	A terminologia foi revista e ampliada quando mostrou-se que peroxidase e catalase estavam presentes em ambos grupos de plantas e tem sido encotrandas em quase todos os tecidos vegetais até agora investigados. O nome “polifenol oxidase” Kubowitz em 1937 mostrou que as fenolases são enzimas contendo cobre.
	
SUBSTRATOS DE FENOLASE
	Os substratos mais abundantes desta enzima são classificados como o-difenois e monofenois. Flavonoides e taninos (catequinas e leucoantocianina) também são substratos da fenolase, sendo tais reações especialmente importantes na fermentação do chá, na maturação de tamaras, na etapa de secagem e cura de sementes recém colhidas de cacau, uma importante etapa no desenvolvimento da cor final, sabor o aroma do cacau e do chocolate. Flavonoides como quercetina o rutina são encontrados na casca da maça, enquanto que taninos ocorrem em pêras, cada so contribui para o escurecimento enzimático. Fenolase tem um papel benéfico no caso do chá e na fermentação do cacau, em contraste com o seu papel talvez mais familiar no escurecimento de frutas e vegetais.
	Geralmente parece que a configuração química mais apropriada para a atividade fenolásica, resultando na reação mais rápida, é a estrutura o-dihidroxi mostrada nos seguintes exemplos.
	Derivados metil-substituidos, tais como os seguintes, não funcionaram como substratos de fenolases
	A oxidação de o-difenois às correspondentes o-quinonas pode ser realizada por todas as fenolases conhecidas, por exemplo, a do cogumelo, batata, batata doce, folha de fumo, maçã, tomate, banana, feijão, e folha de chá.
	Ácido clorogênico, que é o substrato clave para o escurecimento enzimático, particularmente em maçãs e pêras tem a seguinte estrutura.
	
	O ácido clorogênico tem um papel importante no escurecimento observado algumas veces após cozimento de batatas, quando parte da massa cozida dos tubérculos apresenta uma cor cinza-escura se deixada em repouso. Acredita-se que isto é devido a oxidação do complexos formados entre ferro e os ácidos cafeico e clorogênico.
FENOLASE EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
	A reação inicial, envolvendo a converção de composto fenólico a correspondente quinona, depende da presença da fenolase, seu grupo prostético cúprico e oxigênio. Precauções devem ser tomadas para controlar ou prevenir o escurecimento enzimático dos alimentos. Este tipo de escurecimento é um sério problema no processamento dos alimentos, particularmente com frutas, vegetais, alimentos congelados (apodrecimento de material não branqueado) e durante o processo de desidratação onde qualquer danificação do tecido vegetal por técnicas envolvendo calor ou manuseio inconveniente pode resultar na ativação da fenolase. Isto é também um problema com sucos de frutas, exceto para suco de maçã onde um ligeiro escurecimento é comercialmente aceitável. Medidas adequadas devem também ser tomadas contra o desenvolvimento do escurecimento enzimático durante o processamento de batatas pré-descascadas, batatas francesas e batatas fritas , onde existe uma demora entre a etapa de cortar e a do processamento.
MÉTODO PARA O CONTROLE DE ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO
	Os métodos empregados são poucos devido ao desenvolvimento de sabor e odores desagradáveis, toxidez e possibilidade econômica. Por exemplo não se poderia usar para consumo humano inibidores como cianeto, acido sulfídrico ou 3- hidroxiquinoleina. 
	Sabor desagradável e o problema que surge de uso de sustâncias tais como dietil-ditiocarbamato, mesmo a 1ppm, o que está muito abaixo da quantidade necessárias para inativar a enzima. Substâncias que ocorrem naturalmente como adenosina trifosfato ou cisteina podem ser eliminas devido ao alto custo.
	
APLICAÇÃO DE CALOR
	A aplicação de calor no alimento à uma alta temperatura por um espaço de tempo adequado inativará fenolase e todas as outras enzimas presentes. O calor é aplicado em processos tais como branqueamento e pasteurização do tipo alta temperatura-curta período no pré-tratamento de vegetais para enlatamento, preservação por congelamento ou desidratação, no preparo de sucos de frutas ou purées.
	Diversos problemas podem surgir devido ao uso do calor. A fruta ou vegetal torna-se cozida e isto por sua vez produz mudanças texturais e sabores desagradáveis. Tais problemas podem ocorrer por exemplo no processamento de batatas pré-descascadas, maçãs, pêras e pêssegos. 
APLICAÇÃO DE DIÓXIDO DE ENXOFRE E SULFITOS
	Geralmente sulfitode sódio, bisulfito de sódio e metabisulfito de sódio são inibidores poderosos da fenolase. São amplamente usados na industria de alimentos, por exemplo, no preparo de batatas pré-descascadas e no processamento de maçãs e pêras. Pode-se empregar dióxido de enxofre gasoso ou soluções aquosas diluídas de sulfitos. O gás penetrará mais rapidamente dentro da fruta ou de vegetal, mas as soluções de sulfito são mais fáceis de manusear na forma de um gotejamento no processo industrial ou como aspersão sobre batatas colhidas recentemente.
	Vantagens e Desvantagens: Podem ser usados nos casos onde aplicação de calor resultaria em mudanças texturais desfavoráveis e no desenvolvimento de sabores desagradáveis no produto. Tem propriedades anti sépticas e também ajudam na preservação da vitamina C. Entre tanto, o uso em alimentos pode provocar sabores e aromas desagradáveis, podem branquear a cor natural do alimento ou pode ativar a corrosão das latas. É tóxico em alto nível, e concentrações de sulfitos acima de 0,01% pode ser sentida organolepticamente em fatias de batatas cozidas. Talvez a desvantagem mais séria para o uso de dióxido de enxofre ou sulfitos em alimentos seja a destruição de vitamina B1 ou tiamina. Apesar destas desvantagens, estes inibidores da fenolase são amplamente usados no processamento dos alimentos devido principalmente à sua eficiência e ao baixo custo. Algumas pesquisas apontas que a fenolase é inibida em concentrações tão baixas quanto 1 ppm de dióxido de enxofre, esta quantidade inibe serca de 20% da enzima e 10 ppm toda a enzima.
EXCLUSÃO DE OXIGÊNIO
	A aplicação mais simples deste medo na inibição da fenolase é freqüentemente encontrada nos momentos quando é conveniente descascar e cortar as batatas algum tempo antes de cozimento. Durante o intervalo de tempo entre as operações elas são submergidas na água limitando-se deste modo o oxigênio que pode alcançar o tecido cortado. Em larga escala este método é usado no processamento de batatas fritas e à francesa.
	No caso de fatias de pêras congeladas, as superfícies das fatias são tratadas com excesso de ácido ascórbico antes de congelamento. O ácido ascórbico consumirá o oxigênio superficial numa reação de autooxidação. Uma barreira de difusão é portanto estabelecida entre a fruta e o espaço livre da embalagem. Com este método é essencial adicional uma quantidade adequada de ácido ascórbico e manter baixas temperaturas. Alternativamente, a fruta pode ser empacotada sob vácuo em uma lata hermeticamente fechada.	
	Maças e pêras apresentam um problema pois seus tecidos contem comparativamente grandes quantidades de oxigênio, de modo que elas não são simplesmente enlatadas ou superficialmente tratadas. Um método para a remoção do oxigênio do tecido é submete à vácuo fatias de maçãs submergidas em água ou banho de xarope permitindo então ao líquido substituir o ar quando o vácuo é liberado.
INIBIÇÃO PELO CLORETO DE SÓDIO
	Este método de inibição da fenolase tem sido comparativamente pouco usado, sendo principalmente empregado no processamento de frutas descascadas. Demonstrou-se que 0,1% de cloreto de sódio inibe significativamente o escurecimento enzimático no alimentos. A misturas de reação continham 0,4% de ácido clorogênico tamponado à pH 5,0, água ou solução de cloreto de sódio e uma preparação de fenolase de maçãs. Contudo, observaou-se com frutas, que uma lata concentração de cloreto de sódio é necessária para inativar completamente a fenolase. 
APLICAÇÕES DE ÁCIDOS
	Os ácidos usados são aqueles que ocorrem naturalmente nos tecidos, particularmente cítrico, málico, fosfórico e ascórbico. Em geral, sua ação é a de abaixar o pH do tecido e assim diminuir a velocidade do escurecimento enzimático. A relação entre a atividade fenolásica com o pH do meio está na faixa de 6-7 e abaixo de pH 3,0 não há nenhuma atividade enzimática.
	O ácido cítrico, freqüentemente em combinação com o ácido ascórbico ou sulfito de sódio tem sido usado há muito tempo como um inibidor químico do escurecimento enzimático. Fruta cortada tal como pêra, é freqüentemente imersa em soluções diluídas destes ácidos antes do processamento. Este tratamento ácido é particularmente útil no caso de pêssego tipo caroço preso descascado com lixívia, onde a imerção no ácido neutralizará o efeito da alcalinidade residual sobre o escurecimento enzimático. O ácido cítrico possui um efeito inibitório duplo sobre fenolase, não só por abaixar o pH no meio, mas também por seqüestrar o cobre prostético da enzima. Contudo parece que o ácido cítrico por si só não é muito efetivo como um inibidor da fenolase. O ácido málico, o principal ácido do suco de maçã é visto como um inibidor muito mais efetivo do que o ácido cítrico neste suco.
	Um inibidor muito mais significante da fenolase é o ácido ascórbico. Esta substância não tem sabor detectável as concentrações usadas, não interfere com o produto processado, nem possui uma ação corrosiva sobre metais, em adição seu valor vitamínico é bem conhecido.
ÁCIDO BÓRICO E BORATOS
	Estudos em tecidos de maçã encontrou-se que tal escurecimento era completamente inibido pelo tratamento com o tetraborato e com o metaborato de sódio ambos a 1,5%. Nenhuma inibição foi demonstrada com correspodentes concentrações de perborato de sódio, ou com ácido bórico. Uma possível ação sinergêtica de tetraborato de sódio em associação com aditivos comuns dos alimentos tais como o ácido cítrico, sacarose e bisulfito de sódio foi estudada. O controle mais efetivo do escurecimento, com as propriedades organolépticas mantidas não afetadas, foi conseguida com 0,5% de tetraborato de sódio mais 0,5% de ácido ascórbico ou 100ppm de dióxido de enxofre. O modo de ação destes inibidores é pela formação de um complexo químico com o grupo 0-dihidroxi de substrato dando origem a uma substancia que não pode ser atacada pela enzima.
	A principal desvantagem quanto ao uso dos boratos é que ainda não receberam aprovação oficial pela fiscalização de alimentos e medicamentos dos Estados Unidos.