Esquema da análise de Salmonella pelo método ISO 1

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Esquema da análise de Salmonella pelo método ISO 6579 (2007)
Método ISO 6579 (2007) (Método da International Organization for Standardization)
Pré enriquecimento 
 BPW (água peptonada tamponada) a 37±1ºC/ 18±2h.
Enriquecimento seletivo 
RVS (caldo Rappaport-Vassiliandis Soja) a 41,5±1ºC/24±3h
MKTTn (caldo tetrationado Muller-Kauffmann Novobiocina) a 37±1ºC/24±3h
Plaqueamento diferencial
XLD (Ágar Xilose Lisina Desoxicolato) a 37±1ºC/24±3h
2 opcional. Selecionar um meio adequado para o isolamento de cepas lactose positivas e dos sorotipos Typhi e Paratyphi. O Ágar Verde Brilhante (BG) e o Ágar Bismuto Sulfito (BS) podem ser utilizados 
25g/25mL de amostra + 225mL de BPW
Homogeneização 
Pré-enriquecimento
Incubação 37ºC±1ºC/18±2h
1mL                                                                  0,1mL
               MKTTn  10mL                                                         RVS 10mL
         37±1ºC/24±3h                                                       41,5±1ºC/24±3h
     XLD               meio opcional                       meio opcional           XLD   
37±1ºC/24±3h       incubação *                           incubação*        37±1ºC/24±3h
Colônias tipicas 
*Seguir orientaçoes do fabricante
Purificação em Ágar Nutriente (NA) (estria de esgotamento)
37±1ºC/24±3h 
1 colônia isolada 
Ágar Nutriente(NA) 
37±1ºC/24±3h
API 20E ou Série Bioquímica
Teste de crescimento em TSI 
Ágar Triplice Açúcar Ferro (TSI) 37±1ºC/24±3h
Teste de Voges-Proskauer (-)
Caldo VM-VP 
37±1ºC/24±3h
Teste Urease(-)
Ágar Uréia de Christensen 37±1ºC/24±3h
 
Teste de Lisina Descarboxilase(+)
Caldo Descarboxilase Lisina 37±1ºC/24±3h 
Teste de Indol (-)
Caldo Triptona 1%
37±1ºC/24±3h
Teste de β-galactosidade Usualmente (-)
0,25mL de sol. Salina
0,85% de esteril+ 1 gota de Tolueno
37±1ºC/5min em banho
0,25mL de reagente ONPG
37±1ºC/24±3h
Sorologia
Teste Sorológico Somático 
Detecção do antígeno Vi
Teste Sorológico Flagelar 
Solução Salina 0,85% + cultura
Anti-soro Poli + cultura
Solução Salina 0,85% + cultura
Anti-soro Vi + cultura
Agar Nutriente semi-sólido
(0,4% de agar) não inclinado
37±1ºC/24±3h
Solução Salina + cultura
Anti-soro Poli H + cultura
Teste de urease: inocular cada cultura em um tube de Agar Ureia de Christensen inclinado (estrias na rampa). Incubar a 37±1ºC/24±3h e observar a ocorrência de viragem alcalina do indicador, com alteração da cor meio pêssego para cor de rosa escuro (teste positivo), ou permanecia da cor original (teste negativo).
Teste de lisina descarboxilase: inocular cada cultura em um tubo de Caldo Descarboxilase 0,5% L-Lisina, logo abaixo da superfície do liquido. Incubar a 37±1ºC/24±3h e observar se ocorre turvação com a viragem alcalina do indicador, alterando a cor do meio para roxo azulado (teste positivo) ou viragem acida para amarelo (teste negativo).
Teste de Voges-Proskauer: inocular cada cultura em um tubo de 3mL de caldo VM-VP e incubar a 37±1ºC/24±3h. Após a incubação, adicionar ao tubo duas gotas de solução aquosa 0,5% de creatina monohidrato, três gotas de solução α-naftol 5% e duas de solução KOH 40%, nesta sequência e agitando o tubo entre um reagente e outro. Cor rosa escuro ou vermelha no meio de cultura, no intervalo de 15 min, indica teste positivo. O não desenvolvimento indica teste negativo.
Teste de Indol: inocular cada cultura em um tubo com 5 ml de Caldo Triptona 1% suplementado com 1g/1 de DL-Triptofano e incubar a 37±1ºC/24±3h. Após a incubação adicionar, para cada 5 ml de cultura, 1 ml do reagente Kovacs para teste de indol e observar se há desenvolvimento de um anel vermelho-violeta na superfície do meio de cultura (teste positivo), ou se o anel permanece amarelado, cor do reagente de Kovacs (teste negativo). Desenvolvimento de vários tons entre vermelho e rosa indica teste indeterminado.
Teste β-galactosidase: suspender uma alçada de cada cultura em um tubo com 0,25mL de solução salina 0,85% estéril. Adicionar ao tubo uma gota de tolueno, agitar bem e incubar em banho a 37±1ºC/5min, adicionar ao tubo 0,25mL do reagente ONPG de β-galactosidase, agitar bem e incubar em banho a 37±1ºC/24±3h, examinando periodicamente. O desenvolvimento de uma cor amarela no liquido, geralmente no intervalo de 20 min, é indicativo de teste positivo. A maioria das cepas de Salmonella entérica subsp. entérica são negativas.