Aula 04 meios de cultura

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FACULDADE PITÁGORAS DE IMPERATRIZ
Métodos de identificação e cultivo de micro-organismos.
CURSO DE ODONTOLOGIA
Prof. Esp. Marcelo Henderson
Introdução
A compreensão do papel de microrganismos no meio ambiente fornece subsídios para o desenvolvimento de aplicações biotecnológicas, além de ser fundamental no estabelecimento de políticas de biossegurança, visto o caráter patogênico de muitos agentes.
A importância da manutenção e principalmente preservação de microrganismos caracteriza-se como reflexo da necessidade de utilização de organismos ou espécimes a qualquer momento, quer para fins experimentais, didáticos, industriais ou estudos comparativos. Desta forma, conhecer a melhor maneira de preservar culturas bacterianas e dispor de técnicas simples e eficientes, reveste-se de grande valia aos laboratórios de microbiologia.
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Introdução
Os microrganismos tal como outros organismos vivos necessitam de obter os nutrientes apropriados do seu meio ambiente. Assim se queremos cultivar e manter microrganismos vivos em laboratório, necessitamos de os colocar em meios de cultura, contendo os nutrientes apropriados para o seu crescimento.
Para além de nutrientes é igualmente necessário que as condições de oxigénio (presença ou ausência), pH e pressão osmótica sejam adequadas ao crescimento desses microrganismos.
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Para que isolar micro-organismos? 
Conhecer os diferentes tipos microbianos 
Informação microbiológica completa e rápida 
Identificação dos organismos
Susceptibilidade a antimicrobianos 
Melhor opção terapêutica e tratamento
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Cultura pura
Os micro-organismos existem em culturas mistas no meio ambiente. Para se identificar espécies individuais de uma população microbiana mista presente na natureza, é necessário isolar os diferentes micro-organismos em cultura pura. A obtenção de uma cultura pura (ou clones de bactérias) de determinado micro-organismo possibilita o estudo de características microscópicas, coloniais, bioquímicas e sorológicas do referido micro-organismo. 
Cultura pura é conceituada como a obtenção in vitro de uma população contendo 106 a 109 bactérias idênticas.
Na natureza encontramos várias espécies de microrganismos (bactérias, fungos, algas e protozoários) convivendo no mesmo ambiente. Para estudar as propriedades de um determinado microrganismo em particular, deve-se primeiramente isolá-lo em cultura pura, ou seja, uma cultura isenta de todos os demais tipos de organismos, onde todas as células na população sejam idênticas (originárias de uma mesma célula parental).
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Meios de Cultura
Meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial das bactérias. Esses meios fornecem os princípios nutritivos, assim como outras condições necessárias ao crescimento bacteriano (pH, pressão osmótica e grau de umidade, entre outras).
Estes meios podem ser preparados no próprio laboratório com pós desidratados, ou adquiridos prontos no comércio em placas de Petri ou tubos de ensaio.
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Meios de Cultura
Quais critérios o meio de cultura deve preencher? Primeiro, ele deve conter os nutrientes adequados para o microrganismo específico que queremos cultivar. Deve conter também uma quantidade de água suficiente, pH apropriado e um nível conveniente de oxigênio, ou talvez nenhum. O meio deve ser estéril – isto é, inicialmente não deve conter microrganismos vivos – dessa forma, a cultura conterá apenas os microrganismos (e sua descendência) que foram introduzidos. Por fim, a cultura em crescimento deve ser incubada em temperatura apropriada.
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Meios de Cultura
Procedimentos gerais para preparo de meio de cultura
Hoje o mais comum é a utilização de meios comerciais prontos e/ou semiprontos. A preparação desses meios é bastante simples consistindo basicamente em dissolvê-lo como uma gelatina e distribuir nos tubos ou placas de petri que serão usados. Porém, alguns cuidados gerais devem ser usados para o preparo e validação dos meios de cultura.
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Meios de Cultura
Preparação e distribuição
A seguir segue uma descrição simplificada do procedimento de preparo de um meio de cultura geral.
1. Pesar o ágar (pó) e colocar em um béquer ou erlenmeyer com capacidade maior do que o volume que será usado – por exemplo, se for preparar um meio de 100 ml usar um erlenmeyer de 250 ml.
2. Medir o volume de água destilada necessário em uma proveta. A adição da água no meio deve ser realizada colocando-se primeiro uma pequena quantidade de água até que o meio fique úmido e depois acrescentar o restante devagar.
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Meios de Cultura
3. Homogeneizar o meio agitando o frasco devagar, com movimentos circulares.
4. Aquecer o frasco em micro-ondas ou em bico de bunsen, sobre uma tela de amianto. Como é preciso agitar constantemente é recomendado uso de luvas térmicas. No caso de uso do micro-ondas deve-se parar pelo menos na metade do tempo para homogeneizar o frasco.
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Meios de Cultura
5. O meio não deve chegar à fervura. Deve apenas ser aquecido até se fundir completamente.
6. Os meios para diagnóstico microbiológico passam por algum processo de esterilização antes do uso. Pode ser em autoclave, por 15 minutos a 121ºC, ou por filtração, com filtro de porosidade de 0,22 micra.
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Meios de Cultura
7. A distribuição dos meios em tubos ou placas pode ser feita antes ou depois da esterilização. Se for feita antes, as placas podem ser não estéreis, se for depois é preciso usar placas já esterilizadas.
8. Se for feita a autoclavação do meio, tanto distribuído em placas, tubos ou em maior quantidade, deve ser feita com o recipiente semiaberto para a esterilização completa e por igual.
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Meios de Cultura
Controle de qualidade
Para a validação de um lote de meio de cultura preparado é preciso retirar uma parcela de tubos ou placas prontas, em geral 10% do lote, e submetê-los a uma incubação a 35ºC durante 24 horas. Depois deste período não deve haver nenhuma alteração do meio: nem de cor ou presença de colônias. Se houver alguma modificação no meio o lote deverá ser esterilizado novamente e se persistir a contaminação, deverá ser descartado. Outro controle de qualidade que deve ser realizado é o Controle de Crescimento. Para esse controle são utilizadas cepas de referência ou com origem definida e viabilidade comprovada. A cepa deve ser inoculada no meio e após o período de incubação, específico para a cepa usada, a leitura deve ser obrigatoriamente positiva.
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Meios de Cultura
Os meios de cultura são classificados, de acordo com sua constituição 
sua consistência 
sua função
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Meios de Cultura
Os meios de cultura são classificados, de acordo com sua constituição em: 
caldo simples: constituído basicamente de extrato de carne e peptona; 
b) ágar simples: adiciona-se ágar à formula do caldo simples. 
Ágar nutriente
Caldo nutriente
Ágar inclinado
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Meios de Cultura
O ágar é um polissacarídeo extraído de algas marinhas, que não é utilizado pelas bactérias, possuindo a finalidade de endurecer o meio de cultura.
O ágar tem algumas propriedades muito importantes que o tornam valioso em microbiologia, nunca tendo sido encontrado um substituto satisfatório. Poucos microrganismos podem degradar o ágar, o que permite que ele permaneça sólido. Além disso, o ágar se liquefaz a cerca de 100°C (o ponto de ebulição da água) e ao nível do mar ele permanece líquido até a temperatura diminuir até cerca de 40°C. Para utilização no laboratório, o ágar é mantido em banho-maria a 50°C. Nessa temperatura, ele não destrói a maioria das bactérias quando adicionado sobre elas
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Meios de Cultura
De acordo com a consistência, os meios de cultura podem ser: 
a) líquidos: utilizados para crescimento de micro-organismos, em culturas puras, para realização de futuros testes para identificação ou outras finalidades;
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Meios de Cultura
Os meios líquidos são úteis para a obtenção de relativa grande biomassa de microrganismos e revelação de provas bioquímicas, mas não permitem a separação dedois ou mais microrganismos de espécies diferentes em uma população mista, não possibilitando a observação de algumas características específicas dos microrganismos, como a morfologia de suas colônias.
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Meios de Cultura
De acordo com a consistência, os meios de cultura podem ser: 
b) sólidos em tubo: quando na forma de ágar inclinado, geralmente objetiva o crescimento maciço de micro-organismos e a sua conservação. Em coluna alta geralmente é utilizado em pour plate ou semeadura em picada;
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Meios de Cultura
De acordo com a consistência, os meios de cultura podem ser: 
c) sólidos em placas de Petri: o objetivo geralmente é a obtenção de colônias isoladas, o que possibilita o isolamento dos possíveis micro-organismos existentes em microbiotas mistas. Alguns testes de laboratório, como antibiograma, assimilação de açúcares e sensibilidade aos antimicrobianos, também são realizados em meios sólidos em placa;
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Meios de Cultura
De acordo com a consistência, os meios de cultura podem ser: 
d) meios semisólidos em tubo: são utilizados geralmente para verificar a mobilidade e observar a fermentação de carboidratos por determinados micro-organismos.
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Meios de Cultura
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua função em: 
meios simples: possuem os componentes essenciais para o crescimento de micro-organismos pouco exigentes. Exemplo: caldo simples;
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Meios de Cultura
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua função em: 
b) meios enriquecidos:
adicionam-se aos meios simples substâncias de enriquecimento, como sangue total de animais, soro, ovo, extrato de fígado, extrato de cérebro, açúcares, extrato de leveduras, extrato de soja etc. Exemplo: ágar sangue;
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Meios de Cultura
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua função em: 
b) meios enriquecidos:
Um meio enriquecido corresponde ao caldo ou meio sólido contendo um grande suprimento de nutrientes que promove o crescimento dos microrganismos fastidiosos. É geralmente preparado pela adição de nutrientes extras a um meio denominado ágar nutriente. O ágar-sangue (ágar nutriente mais 5% de eritrócitos de carneiro) e o ágar-chocolate (ágar nutriente adicionado de hemoglobina em pó) são exemplos de meios sólidos enriquecidos utilizados rotineiramente nos laboratórios de bacteriologia clínica.
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Meios de Cultura
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua função em: 
c) meios seletivos: meios que favorecem o desenvolvimento de determinados micro-organismos, mas inibem a proliferação de outros, devido à adição de substâncias inibidoras, variação de nutrientes, pH, temperatura, tensão superficial, pressão osmótica, entre outros.
Como exemplos de substancias seletivas utilizadas em meios de cultura podemos citar a novobiocina que inibe Proteus; sais biliares: em altas concentracoes (8,5%) que inibem bacterias Gram-positivas e esporuladas; azida sodica que inibe fungos; bacitracina que inibe estreptococos com excecao de Streptococcus mutans; e cristal violeta inibe bacterias Gram-positivas.
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Meios de Cultura
Um meio seletivo contém inibidores adicionados que tornam inviável o crescimento de certos microrganismos, sem inibir o crescimento do microrganismo que está sendo pesquisado. Por exemplo, o ágar MacConkey inibe o crescimento de bactérias gram-positivas, selecionando, assim, as bactérias gram-negativas
Essas caracteristicas geralmente podem ser evidenciadas atraves de coloracao ou formas das colonias ou coloração do meio ao redor delas. Como exemplo de meio seletivo diferencial, pode-se citar o agar MacConkey. Nesse meio Escherichia coli e Enterobacter aerogenes que fermentam a lactose, produzem colonias de coloracao rosa intenso para vermelho, enquanto Proteus, Shigella e Salmonella apresentam colonias incolores ou brancas.
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Meios de Cultura
Os meios de cultura podem ser classificados de acordo com sua função em: 
d) meios seletivos diferenciais: geralmente são meios sólidos, utilizados para isolamento e identificação presuntiva de bactérias. Permitem o desenvolvimento de grupos de micro-organismos com características relativamente definidas, ou seja, cada grupo de micro-organismos desenvolve-se apresentando características relativamente bem definidas que o diferencia dos demais.
Essas caracteristicas geralmente podem ser evidenciadas atraves de coloracao ou formas das colonias ou coloração do meio ao redor delas. Como exemplo de meio seletivo diferencial, pode-se citar o agar MacConkey. Nesse meio Escherichia coli e Enterobacter aerogenes que fermentam a lactose, produzem colonias de coloracao rosa intenso para vermelho, enquanto Proteus, Shigella e Salmonella apresentam colonias incolores ou brancas.
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Técnica de semeadura
Consiste na inoculação ou plantio de um microrganismo em um meio de cultura, a partir de um material contaminado qualquer
Objetivo:
Obter o crescimento do microrganismo no meio de cultura;
Isolar o microrganismo.
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Material Utilizado
Bico de Bunsen
Agulha e alça bacteriológica
Técnica de Semeadura
Meio semi-sólido (técnica de semeadura em picada):
Observar a motilidade (movimento) das bactérias.
Bactéria móvel: crescimento por todo meio de cultura;
Bactéria imóvel: crescimento somente no local da picada
Técnica de Semeadura
Meio sólido (Ágar inclinado):
Observar uma massa bacteriana.
Técnica de Semeadura
Meio sólido (placa de Petri - técnica do esgotamento):
O objetivo dessa técnica é obter (isolar) culturas puras de amostras que contenham microbiota mista, sendo igualmente útil para o estudo da morfologia colonial.
Técnica de Semeadura
Meio sólido (placa de Petri - técnica de Pour-Plate):
O objetivo da técnica de semeadura em Pour-Plate é obter colônias isoladas (qualitativo) ou realizar contagem de colônias em placas (quantitativo).
Identificação de Microrganismos
Características:
Morfológicas
Culturais
Fisiológicas
Bioquímicas
Antigênicas
Patogênicas
Genéticas
Características Morfológicas
Através da microscopia;
Facilitar a visualização:
Forma;
Tamanho;
Presença de mobilidade;
Presença de apêndices (flagelos, cápsula, esporos).
Coloração de GRAM;
Coloração de Ziehl-Neelsen;
Coloração de esporos e flagelos.
Características Culturais
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Características Fisiológicas
Presença de oxigênio;
Temperatura;
pH;
Necessidade de fatores de crescimento
Produção de pigmentos.
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Características Fisiológicas
Temperatura;
As variações quanto ao requerimento térmico permite classificar as bactérias
segundo a temperatura ótima para o seu crescimento, em:
- psicrófilas: entre 12 e 17º C
- mesófilas: entre 28 e 37ºC
- termófilas: 57 e 87ºC
Embora grupos excêntricos, que necessitam de altas temperaturas para o seu crescimento, a maioria concentra-se no grupo de mesófilas, principalmente as de interesse médico, veterinário e agronômico.
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Características Fisiológicas
pH;
Os valores de pH em torno da neutralidade são os mais adequados para absorção de alimentos para a grande maioria das bactérias. Existem, no entanto, grupos adaptados a viver em ambientes ácidos e alcalinos.
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Características Fisiológicas
Presença de oxigênio;
O oxigênio pode ser indispensável, letal ou inócuo para as bactérias, o que permite classificá-las em:
· aeróbias estritas: exigem a presença de oxigênio, como as do gênero Acinetobacter.
 microaerófilas: necessitam de baixos teores de oxigênio, como o Campylobacter jejuni.
· facultativas: apresentam mecanismos que as capacitam a utilizar o oxigênio quando disponível, mas desenvolver-se também em sua ausência. Escherichia coli e várias bactérias entéricas têm esta característica.
· anaeróbias estritas: não toleram o oxigênio. Ex.: Clostridium tetani, bactéria produtora de potente toxina que só se desenvolve em tecidos necrosados carentes de oxigênio.
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Características Bioquímicas
Observa-se a utilização dosnutrientes e obtenção de energia pelos microrganismos e como eles utilizam a energia para sintetizar os componentes celulares.
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Características Antigênicas
 Os anticorpos produzidos em animais de laboratórios podem ser usados para detectar a presença de antígenos únicos em culturas bacterianas e são usados para caracterizar os microrganismos.
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Características Patogênicas
Importante determinar se o microrganismo causa doença (patogênico) ou não causa doença (não-patogênico)
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Características Genéticas
A maioria dos microbiologistas conta atualmente com técnicas que permitem realizar análises genéticas para classificar ou identificar os microrganismos ou compreender a sua atividade.
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Manutenção dos microrganismos
Para a manutenção dos micro-organismos vivos e com suas características, em cultura pura de laboratório, os seguintes recursos podem ser utilizados:
Repique frequente: é realizado pela transferência de um inóculo da bactéria para novo meio de cultura. Sua finalidade é renovar nutrientes e impedir acúmulo de produtos tóxicos decorrentes do metabolismo bacteriano no meio de cultura. A frequência de repique depende do micro-organismo que se deseja manter e do meio de cultura utilizado.
A técnica de repique contínuo, também chamado de subcultivo ou repicagem periódica, é um método simples e tradicional de manutenção de culturas em laboratório. Por ser uma das mais antigas técnicas de conservação, tem sido bastante utilizada para se obter a viabilidade de microrganismos, principalmente de Bactérias. O método consiste na inoculação do microrganismo em meio adequado, incubação em ambiente favorável à multiplicação e estocagem em baixas temperaturas, após sua multiplicação. Nesta situação, é aconselhável o armazenamento de culturas sob refrigeração (5 a 8°C ), em busca da redução do metabolismo dos microrganismos e o aumento entre os intervalos de repiques das culturas, proporcionando a conservação de leveduras em média de um a três meses e de bactérias em torno de cinco a doze meses
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Manutenção dos microrganismos
Manutenção em água esterilizada
A preservação em água destilada esterilizada ou também conhecida pelo método de Castellani consiste no armazenamento de microrganismos em água esterilizada ou solução salina, sendo indicada na preservação de microrganismos sensíveis a baixas pressões osmóticas de soluções hipotônicas.
Esta técnica deve ser utilizada preferencialmente com culturas jovens, com cerca de 10 a 15 dias, e busca redução do metabolismo, com consequente latência das células diante da restrição de fontes nutritivas O método se baseia na transferência de culturas para frascos contendo uma solução de água esterilizada, com posterior armazenamento sob temperatura ambiente. 
Apesar do baixo custo e reprodutibilidade, nota-se os riscos de contaminação
das culturas e um possível comprometimento na estabilidade genética de alguns
microrganismos.
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Manutenção dos microrganismos
Congelamento: uma suspensão espessa de células jovens da bactéria é misturada a um meio “protetor” (leite desnatado, sangue ou soro), e é rapidamente congelado em banho de dióxido de carbono sólido (gelo seco), nitrogênio líquido ou álcool (-78ºC), sendo mantida a mesma temperatura numa caixa de gelo seco, ou num refrigerador mecânico.
O congelamento comum se baseia na conservação de agentes em
temperaturas relativamente baixas entre -4 e -20°C. Apresenta-se como um dos
métodos de manutenção mais simples e baratos, além de oferecer boa segurança
para o armazenamento de diversos microrganismos por períodos de três meses a
dois anos, devido a uma redução significativa no metabolismo celular
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Manutenção dos microrganismos
SILVA et al. (2008) buscando avaliar a viabilidade dos microrganismos
presentes em uma coleção de cultura, semearam um total de 328 leveduras dos gêneros Candida, Cryptococcuss, Trichosporon, Rodothorulla em caldo cérebro coração contendo glicerol, mantendo-as sob refrigeração por sete dias e posterior congelamento a -20°C, sob três diferentes períodos de tempo. Após três anos de congelamento, observaram recuperação de 99,0% das leveduras (72 viáveis/73 microrganismos congelados). No segundo período (três anos e seis meses) observaram a viabilidade de 100% das cepas congeladas (96 leveduras congeladas e viáveis após o descongelamento). No último grupo, após o congelamento de 159 leveduras por quatro anos, notaram uma redução da viabilidade das culturas com 90,6% de recuperação (144 leveduras). Diante dos resultados, observaram que o emprego de baixas temperaturas foi vantajoso por seu baixo custo, fácil execução, além de ter favorecido a conservação de quase totalidade das leveduras por 48 meses.
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Manutenção dos microrganismos
Liofilização: consiste em desidratar a cultura congelada em alto vácuo para retirada de água. É realizada em equipamento especializado (liofilizador). Culturas liofilizadas podem ser armazenadas por longo tempo, à temperatura ambiente, ou preferivelmente em refrigerador comum.
A liofilização é considerada uma das técnicas mais eficientes para a
manutenção de microrganismos, justamente por garantir a viabilidade dos agentes
por 17 a 20 anos e ser aplicável para a maioria deles, com exceção de algas e
protozoários
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NARESSI, Wilson Galvão; NARESSI, Suely Carvalho Mutti; ORENHA, Eliel Soares. Ergonomia e biossegurança em Odontologia. São Paulo : Artes Médicas, 2013.
BURTON, Gwendolyn L. W., ENGELKIRK, Paul G. Microbiologia para ciências da saúde. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2005. 
LORENZO, José Luiz. Microbiologia para o Estudante de Odontologia. São Paulo: Atheneu, 2008.
SALVATIERRA, C.M. Microbiologia - Aspectos morfológicos, bioquímicos e metodológicos. São Paulo: Érica, 2014. 
JORGE, Antonio Olavo Cardoso. Microbiologia bucal. São Paulo: Santos Editora, 2007. 
Bibliografia