Preparo de Meios de Cultura

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Preparo de Meios de Cultura: 
Preparo de meio sólido 
 
•Os meios de cultura são usados para o cultivo artificial dos microrganismos; 
•Eles fornecem os nutrientes necessários para o crescimento dos microrganismos; 
•Os nutrientes indispensáveis para os microrganismos são: 
‣ Fonte de Carbono (energia); 
‣Fonte de Nitrogênio; 
‣Sais Minerais. 

•Alguns microrganismos também precisam de fatores de crescimento, que são substâncias que eles não 
podem sintetizar, tais como vitaminas, aminoácidos, etc. 
•O desenvolvimento dos microrganismos nos meios de cultura estão relacionados com fatores extrínsecos e 
intrínsecos: 
‣ Disponibilidade de nutrientes; 
‣Aeração; 
‣ Umidade; 
‣ pH; 
‣Temperatura; 
‣Umidade; 
‣ Esterilidade (o meio de cultura deve estar isento de qualquer tipo de contaminação); 
‣Assepsia; 
‣Pressão osmótica. 
• Quando uma população de microrganismos está em crescimento ativo em um meio nutritivo , ocorre a 
formação de uma cultura; 

• Em meios naturais os microrganismos raramente se encontram isolados, pois as espécies estão em 
geral misturadas e se desenvolvem conjuntamente se as condições são favoráveis; 
• Quando uma única espécie de microrganismo se desenvolve em um meio de cultura esta cultura é 
chamada de cultura pura. 

Classificação dos Meios de Cultura: 
1. Classificação quanto à natureza: 
• Animado: Constituído por células vivas. Ex. Animais de laboratório, tecidos vivos, etc. 
• Naturais, inanimados e semi-sintéticos: Não possuem células vivas, mais possuem componentes da 
natureza, e são preparados por diversas misturas de nutrientes. Exemplos de substâncias naturais: 
Extratos de carne (proteínas solúveis, carboidratos, sais), Peptonas, Extratos de levedura, sangue, 
soro, leite, extrato de solo, fluido de rumem bovino, etc. 
• Sintético ou Artificiais: também são meios inanimados que são formados por substâncias químicas 
preparadas em laboratório. 

• Ex. MAS (ágar Mac conkey sorbitol 5-bromo 4-cloro 3indoxil β-D-glucoronídio) é um meio de 
cultura seletivo diferencial para plaqueamento diferencial de E. coli O157:H7. 

Algumas Definições: 
Extratos: 
• São concentrados aquosos desidratados, obtidos a partir de carnes (sem tendões e graxas), de 
leveduras ou de malte. 
• Os extratos de carne e levedura geralmente são isentos de carboidratos fermentáveis, ao contrário do 
extrato de malte, o qual possui um elevado teor, principalmente de maltose, indicado particularmente 
para o cultivo de leveduras e bolores. 
• O valor nutritivo dos extratos é devido à substâncias solúveis obtidas a partir da matéria prima tais 
como: carboidratos, compostos orgânicos, vitaminas hidrossolúveis e sais. 

Peptonas: 
• São substâncias de origem protéica; 

• Obtidas a partir de proteínas nativas que foram transformadas em fragmentos hidrossolúveis. 
O termo “peptonas” é usado quando são obtidos por via enzimática, e o termo “hidrolisado” 
quando obtida por via inorgânica. 
• As peptonas constituem uma mistura de peptídeos, e os hidrolisados uma mistura mais ou 
menos 

irregular de diversos peptídeos e aminoácidos livres. 
• As peptonas e os hidrolisados representam as substâncias basais mais importantes para a 
preparação dos meios de cultura para os microrganismos. 
• As peptonas e os hidrolisados disponibilizam nitrogênio para o meio de cultura. 2. 
Classificação quanto à consistência: 

A presença ou ausência de consistência no meio de cultura ocorre pela presença ou ausência do ágar-ágar (ou 
simplesmente ágar) 
A consistência do meio de cultura está relacionada com o estado físico, considerando-se o teor de ágar-ágar 
adicionado ao meio de cultura. 

Ágar-ágar: 
• É um polissacarídeo ácido obtido a partir de algas marinhas (Rhodophyceae), que pro hidrólise 
fornece D-galactose e pequena quantidade de D-galactose e ácido sulfúrico. 
• É utilizado como agente solidificante de meios de cultura 
• Não são considerados como fonte nutritiva para os microrganismos (pois não são hidrofilizados pelos 
microrganismos) 

Propriedades do ágar-ágar: 

• Em soluções aquosa na concentração de 1,2% se dissolve e se liquefaz somente a temperatura de 95oC e 
permanece líquido até 45-48 oC. 

• Nesta temperatura de o meio de cultura pode ser semeado sem risco de inativar os microrganismos, ou 
ainda poderá ser enriquecido pela adição de proteínas coaguláveis (sangue, soro), vitaminas ou atores 
termolábeis. 

• Depois de solidificado, adquire consistência firme e pode ser incubado a 35-37 oC sem perder a 
consistência. 

• Resistem a autoclavação (121 oC, exceto em pH menor que 4,0 e maior que 9,0); 

• É destituído de toxicidade para os microrganismos; 

• Praticamente não é atacado (hidrolisado) pelos microrganismos; 

• Na concentração de 1,5% - 2% confere um certo grau de umidade à superfície do meio de cultivo, 
permitindo no entanto, a obtenção de colônias isoladas. 

• A estrutura do gel quando na concentração de 1,2% impede a mobilidade bacteriana, porém favorece a 
difusão dos nutrientes. 
3. Classificação dos meios quanto a Composição: 
• Meios Simples: são destinados ao cultivo de microrganismos pouco exigentes ou servem de base 
para outros meios de cultura. Ex. água peptonada, ágar simples. 

• Meios de Enriquecimento: Meios de composição simples adicionados de substâncias que 
melhoram eu valor nutritivo. Ex.caldo BHI (infusão de cérebro e coração), ágar chocolate, etc. 

• Meios Complexos: São aqueles que não se conhece a composição exata dos seus ingredientes. 
Ex. ágar sangue, ágar extrato de levedura, etc 

4. Classificação dos meios quanto às finalidades: 
• Conservadores e/ou de transporte: São meios utilizados no caso de não ser possível 
realizar a cultura logo após a coleta de um determinado material biológico. Possui a 
finalidade de manter estável a população microbiana presente no material. Ex. solução salina 
glicerinada. 

• Enriquecimento: è aquele que permite o crescimento de microrganismos exigentes que 
necessitam, de fatores de crescimento, mais não inibem o crescimento de outros. Ex. caldo 
selenito, caldo tetrationato 

• Seletivos: São aqueles que contém substâncias que inibem o crescimento de certos 
microrganismos, porém permitem o crescimento de outros. 

• A intensidade desta seletividade pode ser variável, como ocorre com alguns meios 
empregados para o isolamento de enterobactérias. 

Podem ser de: 
• Baixa impediência, Ex. ágar EMB (eosina azul de metileno); 
• Média impediência, Ex. ágar Salmonella-Shigella; 
• Alta impediência, Ex. ágar Sulfito de Bismuto 

• Diferenciais: Possuem substancias que evidenciam uma característica que permite 
separar ou diferenciar um grupo ou uma espécie de microrganismo. Ex ágar EMB., 
ágar baird parker, etc. 
• Seletivo-diferenciais: São aqueles que combinam seletividade e diferenciação. Ex. 
ágar Manitol Salgado, seletivo para estafilococos devido ao alto teor de sal, 
diferenciando o S. aureus (colônia amarela) do S. epidermidis (colônia branca) 
através da fermentação do manitol. 
• Dosagem: Meios de composição definida (sintéticos) empregados para a dosagem 
de vitaminas, aminoácidos e antibióticos. Há também meios especiais para a 
avaliação de desinfetantes. Ex. Antibiotic Agar. 
• Contagem: são aqueles meios específicos apara a contagem de colônias, cuja 
composição deve obedecer a recomendações padronizadas. Ex. Plate Count Agar 
(ágar padrão para contagem). 
• Identificação: Existe uma grande variedade de meios rotineiramente utilizado em 
microbiologia para a identificação bioquímica de microorganismos. Ex. prova da 
Urease, Citrato, Indol, Fermentação da Glicose, etc. 

• Estoque: A manutenção adequada da viabilidade e das características fisiológicas 
de uma cultura pode exigir um meio diferente daquele que é recomendado para o 
seucrescimento ótimo, pois o crescimento rápido pode estar associado a uma 
rápida morte celular devido à eliminação de substâncias tóxicas como produto do 
metabolismo dos microrganismos. Ex. caldo nutriente, agar Nutriente semi-sólido, 
etc. 

Observações:

• Ao se preparar meios de cultura deve-se ter em mente alguns fatores que podem 
interferir com um 
resultado satisfatório do crescimento bacteriana. Como exemplo o pH que geralmente é 
do meio final, pronto para a inoculação e determinado a temperatura ambiente. 
– Se o meio contiver fosfatos ou outros tampões ativos, devemos ajustar as quantidades 
dos sais do tampão para obter o pH apropriado. 
• Outro fator de influencia é a temperatura, pois ao preparar um meio de cultura não 
podemos deixá- lo por mais de uma hora á temperatura ambiente, pois pode ocorrer 
uma evaporação de água, alterando sua composição final. Além disso o risco de 
contaminação do meio é maior. 
• Após seu preparo, os meios devem ser esfriados a temperatura ambiente. 

• Podem ser armazenados e conservados em geladeira. 

• Dependendo da composição do meio, pode ser armazenados por uma semana ou mais. 

Recomendações: 
• Manter registro escrito onde conste data de recepção, prazo de validade e outras 
anotações que considere necessárias, como, por exemplo, controle de estoque. 

• Meios de cultura desidratados devem permanecer bem fechados em recipientes âmbar 
e ao abrigo da luz, e em alguns casos, sob refrigeração. 

• Meios em forma de pós se conservam durante um ano; 

• Meios granulados se conservam por três anos. 

Teste de esterilidade: 

• Após a autoclavação (esterilização do meio a 121oC por 15 minutos) os meios devem ser deixados 
na estufa até o dia seguinte para controle de sua esterilidade. 
Meios de cultura desidratados: 
• Apresentam-se no mercado sob a forma de pós ou granulados; 

• São higroscópicos, por isso os frascos são hermeticamente fechados com tampas de rosca e 
somente 

devem ser abertos em ambientes secos. 

• Devem ser armazenados em ambientes isentos de luz, pois muitas vezes a luz altera as 
substâncias 

componentes dos meios de cultura. 

• Prazo de validade: geralmente de 2 a três anos (antes do preparo). 

• Vantagens dos meios desidratados: 
• Estabilidade elevada; 

• Utilização simples; 

• Rápido preparo; 

• Podem ser preparados pouco tempo antes de sua utilização; 

• Exigem pouco espaço para armazenagem. 

• Certos meios podem ser utilizados sem que seja necessário sua esterilização na autoclave, 
mesmo porque alguns não suportam a autoclavagem (perde alguns nutrientes, como por 
exemplo a desnaturação de proteínas, perda de vitaminas, hidrólise de carboidratos, etc) 

Controle de Qualidade: 
• Embora muitos meios tenham sido submetidos a controle de qualidade pelo 
fabricante, em muitos casos deve-se repetir a avaliação no laboratório antes de sua 
utilização. 

• Deve-se em cada novo lote de meios, inocular microrganismos reservas, isto é, 
microrganismo que pertencem a coleção do laboratório (bacterioteca), pois as reações 
destes nos meios já são conhecidas. 

• Por exemplo: Estreptococos grupo A em agar sangue devem apresentar bom 
crescimento e beta hemólise. 

Técnica básica de Preparo e Cuidados Necessários: 
• Para análise de rotina de alimentos devem ser utilizados meios formulados na 
forma desidratada adquiridos comercialmente. 

• Os frascos contendo estes meios trazem rótulos que descrevem a composição, 
a indicação de uso, condições de estocagem, o preparo e esterilização do meio. 

• Seguir sempre as recomendações do rótulo. 

A validade e estocagem dos meios também contribuem significativamente na 
qualidade da análise, portanto deve-se respeitar os seguintes princípios: 
• O primeiro que entra é o primeiro que sai; 
• Monitorar a chegada do produto e a primeira vez que o meio foi aberto; 
• Observar as datas de validade; 

• Uma vez aberta a embalagem, fechar hermeticamente; 

– Estocar a temperaturas inferiores a 25oC, para evitar estragos. 
• Como os meios são higroscópicos, a pesagem deve ser feita rapidamente e em local de pouca 
umidade. 

• Durante a pesagem e rehidratação, evitar contaminação com substâncias químicas, utilizando-se 
vidrarias e espátulas adequadamente lavadas e enxaguadas, bem como água destilada ou deionizada 
de alta qualidade. 

• Ler atentamente os rótulos dos meios. 

• Pesar cuidadosamente a quantidade exata do meio desidratado ou as proporções corretas dos 
ingredientes, em balança cuja exatidão seja verificada freqüentemente. 

• Adicionar ao meio de cultura a metade da água necessária e homogeneizar bem, até obter uma 
suspensão homogênea. 

• Adicionar o restante da água e homogeneizar, lavando várias vezes o recipiente aonde se pesou o 
meio. 

• Meios contendo agar devem ser deixados em repouso por 10 a 15 minutos antes do aquecimento, para 
que o agar seja “embebido” com água assegurando total dissolução; 

• Determine o pH do meio em potenciômetro previamente ajustado com tampões. 

• Um meio preparado adequadamente manterá o pH indicado no rótulo de sua embalagem. 
• Esterilização: 
• Distribuir em recipiente adequado, quantidade correspondente a 2/3 da capacidade do 
frasco; 

• Esterilizar a 121oC por 15 minutos (o aumento da temperatura ou do tempo poderá 
causar alterações 

no meio). 

• Obs. Alguns meios, principalmente os enriquecidos com proteínas, aminoácidos, 
vitaminas ou outros 

nutrientes podem apresentar sensibilidades a altas temperaturas, podendo ocorrer 
perdas de alguns destes componentes. A indicação sempre constará no rótulo do 
produto, devendo apenas ser aquecidos em temperaturas de aproximadamente 60 oC 
(banho-maria), até 100 oC (vapor fluente). 

• Desvio de cor: alteração de pH, superaquecimento, resíduos nas vidrarias; 
• Crescimento pobre: presença de resíduos como detergentes nas vidrarias, 
resíduos tóxicos na água, pH alterado, superaquecimento, uso do meio 
quente; 
• Colônias alteradas: umidade excessiva na superfície do meio, distribuição de 
substancias inibidoras 

no preparo; 

• Crescimento atípico: meio vencido, armazenamento inadequado, resíduos de substancias nas 
vidrarias ou na água, superpopulação. 
• Defeitos e causas de erro no preparo e manipulação de meios de cultura: 
• Solidificação do meio em pó: conservação sob umidade, frascos abertos por muito 
tempo ou 

fechamento errado; 

• pH alterado: má qualidade da água, erro na vedação do frasco, superaquecimento no 
preparo, meio de cultura vencido; 

• Turbidez e/ou precipitação: uso de água não destilada, presença de resíduos nas 
vidrarias, superaquecimento e evaporação do meio; 

• Solidificação insuficiente: erros de pesagens e/ou de diluição, superaquecimento, 
problemas nos componentes, má distribuição nas placas, meio vencido;