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FACULDADE DE TECNOLOGIA OSWALDO CRUZ CURSO DE TECNOLOGIA APOSTILA DE LABORATÓRIO DE BIOQUÍMICA Profa.: MSc. Maria Cristina Ricci Queiroz 2019 2 SUMÁRIO 1 NORMAS ELEMENTARES DE SEGURANÇA EM LAB. DE QUÍMICA.......... 3 1.1 NORMAS DE SEGURANÇA E ACIDENTES MAIS COMUNS........................................................................................................................... 3 1.2 ACIDENTES MAIS COMUNS EM LABORATÓRIO E PRIMEIROS SOCORROS...................................................................................................................... 4 2 AMINOÁCIDOS.......................................................................................................... 3 PROTEINAS................................................................................................................. 4 REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO DOS CARBOIDRATOS.................................. 5 9 10 5 HIDRÓLISE DE CARBOIDRATOS......................................................................... 12 6 LIPIDEOS..................................................................................................................... 15 7 ENZIMAS ..................................................................................................................... 18 REFERÊNCIAS............................................................................................................. 20 3 1 NORMAS ELEMENTARES DE SEGURANÇA EM LABORATÓRIO DE QUÍMICA 1.1 NORMAS DE SEGURANÇA A ocorrência de acidentes em laboratório, infelizmente, não é tão rara como possa aparecer. Com a finalidade de diminuir a frequência e a gravidade desses eventos, torna-se absolutamente imprescindível que, durante os trabalhos realizados em laboratório, se observa uma série de normas de segurança: 1. Siga, rigorosamente, as instruções específicas do professor. 2. Localize os extintores de incêndio e familiarize-se com o seu uso. 3. Não fume no laboratório. 4. Não coma no laboratório. 5. Use avental apropriado. 6. Use óculos de segurança. 7. Nunca deixe frascos contendo líquidos inflamáveis próximos à chama. 8. Evite contato de qualquer substância com a pele, particularmente ácida e bases concentradas. 9. Sempre que proceder a diluição de um ácido concentrado, adicione-o, lentamente e sob agitação, sobre a água, e não o contrário. 10. Ao aquecer um tubo de ensaio contendo qualquer substância, não volte a extremidade aberta do mesmo para si ou para uma pessoa próxima. 11. Não jogue qualquer material sólido dentro das pias ou dos ralos. 12. Ao introduzir tubos em rolhas, umedeça-os convenientemente e enrole a peça de vidro numa toalha para proteger as mãos. 13. Quando for testar um produto químico pelo odor, não coloque o frasco sob o nariz, desloque com a mão, para sua direção, os vapores. 14. Dedique especial atenção a qualquer operação que necessite aquecimento prolongado ou que desenvolva grande quantidade de energia. 15. Ao se retirar do laboratório, verifique se não há torneiras abertas (água ou gás). Desligue todos os aparelhos, deixe o equipamento limpo e lave as mãos. 4 1.2 ACIDENTES MAIS COMUNS EM LABORATÓRIO E PRIMEIROS SOCORROS Queimaduras a) Queimaduras causadas por calor seco (chama e objetos aquecidos): No caso de queimaduras leves, aplicar pomadas apropriadas. No caso de queimaduras mais graves, elas devem ser cobertas com gaze esterilizada, umedecida com solução aquosa de bicarbonato de sódio a 5%. b) Queimaduras por ácidos: Lavar imediatamente o local com água em abundância, durante cinco minutos. Em seguida, lavar com solução saturada de bicarbonato de sódio e, novamente, com água. Secar, aplicando mertiolate. c) Queimaduras por álcalis: Lavar a região atingida com bastante água, durante cinco minutos. Tratar com solução de ácido acético 1% e, novamente, lavar com água. Secar a pele, aplicar mertiolate. Ácidos nos olhos Lavá-los por quinze minutos com bastante água, após, o que, se aplica solução de bicarbonato de sódio 1%. Álcalis nos olhos Proceder como no item anterior, apenas, substituindo a solução básica de bicarbonato de sódio por uma solução de ácido bórico 1%. Intoxicação por gases Remover a vítima para um ambiente arejado e deixá-la descansar. Ingestão de substâncias tóxicas Administrar uma colher de sopa de antídoto universal, que é constituído de: duas partes de carvão ativo, uma parte de óxido de magnésio e uma parte de ácido tânico. 5 1 a AULA: AMINOÁCIDOS São compostos que apresentam as funções amino (-NH2) e ácido (-COOH) Podendo ou não apresentar outras funções. Exemplo: Nos aminoácidos sempre existe um grupo amino (-NH2) ligado ao carbono vizinho da carboxila. O carbono a é assimétrico, razão pela qual todos os aminoácidos possuem isomeria ótica. Os aminoácidos possuem nomes particulares e a sua grande importância se deve ao fato de ser constituinte das proteínas. 1. REAÇÕES COM NINIDRINA Esta reação é dada pelo amino grupo livre e possibilita inclusive a determinação quantitativa do aminoácido. A ninidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) é um agente oxidante muito poderoso utilizado para a detecção de aminas primárias, particularmente de aminoácidos. Ao reagir com essas aminas livres, uma cor azul escura ou roxa, conhecida como púrpura de Ruhemann é produzida. A ninidrina é comumente usada para detectar impressões digitais, já que, graças a sua reação com os aminogrupos terminais das moléculas de lisina incorporadas nas proteínas ou peptídeos, são suficientemente sensíveis para revelar resíduos de pele. O pH da reação ninidrina com o aminoácido esta entre intervalo de 4 a 8. 6 O derivado corado dos aminoácidos tem cor violácea ou purpura, exceto o derivado da prolina que é amarelado. A cor tende a desaparecer, por oxidação do ar. A reação de ninidrina pode ser feita com aminoácidos em solução, ou sobre superfícies como papel ou sílica gel. A ninidrina reage igualmente com peptídeos, desde que a cadeia seja relativamente curta, e o principio da reação é o mesmo da reação com aminoácidos. Polipeptídios extensos e proteínas não dispõem de números suficientes de amino grupo para reagirem com ninidrina e por esse motivo não podem ser identificados por essa reação. Alguns aminoácidos reagem com certos reagentes especiais, originando também derivados corados, como é o caso da arginina, mas como são reações gerais para todos os aminoácidos, tais reações especiais não podem ser utilizadas com a mesma intensidade com que se usa a reação de ninidrina. Além disso, essas reações não são quantitativas, o que limita seu emprego. EM TODOS OS EXPERIMENTOS FAZER TABELAS COM OS RESULTADOS I) Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 1 mL de glicina 0,1% c) 1 mL de ácido aspártico 0,1% d) 1 mL de prolina 0,1% e) 1 mL de lisina 0,1% f) 1 mL de edulcorante 0,5% Acrescentar a cada tubo 0,5 mL de Solução de ninidrina 0,2% em acetona. Aquecer em banho-maria. Observar. Explicar. 2. IONIZAÇÃO DOS AMINOÁCIDOS a) Suspender pequena quantidade de tirosina em aproximadamente 1 mL de água e adicionar 1 gota de vermelho de cresol.Verificar a solubilidade e o pH aproximado. Acrescentar NaOH 2,5 mol/L, gota a gota. Observar a dissolução do aminoácido e a mudança de pH. Adicionar HCl 1 mol/L, gota a gota. Notar a formação do precipitado e o pH correspondente. Continuar acrescentando o ácido e observar o que ocorre com o precipitado. Explicar. 7 b) Suspender pequena quantidade de glicina em água. Observar. Seguir o mesmo protocolo do item a. c) Calcule o pI de cada aa para desenvolver o raciocínio pedido. Observações: 1- O corante vermelho de cresol é o sulfoftaleína com os seguintes pontos de viragem: a) pH = 0,2 – rosa b) pH = 1,8 – amarelo c) pH = 7,2 – amarelo d) pH = 8,8 – roxo 2- pK - COOH pK - NH3 + pK – R Glicina 2,34 9,6 - Tirosina 2,20 9,11 10,7 QUESTIONÁRIO 1. Dar as fórmulas da glicina, ácido aspártico, prolina, lisina e tirosina. 2. O que ocorreu em cada tubo no item I? 3. O que o reagente ninidrina identifica? 4. O que é ionização de aminoácidos? 5. O que ocorreu com a adição de NaOH? Houve dissolução do aminoácido? 6. Houve mudança no pH no item 2 com a adição de NaOH? 7. O que ocorreu com a adição de HCl? Houve dissolução ou precipitação do aminoácido? 8. Houve mudança no pH no item 2 com a adição de HCl? 9. O que ocorreu com a adição de excesso de HCl? 10. O que é Ponto Isoelétrico? 11. Calcule o pI da tirosina e glicina e compare com o teórico. 8 2 a AULA: PROTEINAS As proteínas são macromoléculas orgânicas formadas pela sequência de vários aminoácidos, unidos por ligações peptídicas (cadeia polipeptídica). Desempenha diversas funções no organismo, sendo: estrutural, hormonal, enzimática, imunológica, nutritiva e de transporte citoplasmático. Uma proteína pode conter milhares de aminoácidos, com sequência dessas unidades determinada pela informação genética contida no gene, um seguimento da molécula cromossômica. Portanto, todo o funcionamento de um organismo é conduzido pelo controle das moléculas de DNA. A partir do DNA ocorrem as transcrições, com a fabricação de RNAs: transportadores, ribossômicos e mensageiros. A sequência dos aminoácidos em uma proteína representa a estrutura primária, responsável pelas propriedades da molécula. Em decorrência à existência de ligações de hidrogênio entre o hidrogênio (carga positiva +) de um aminoácido com o oxigênio ou nitrogênio (carga negativa -) de outro aminoácido não adjacente, é proporcionada uma torção na cadeia filamentosa, assumindo a proteína uma forma de helicoidal. Uma proteína não apresenta necessariamente aspecto linear helicoidal. As propriedades químicas dos aminoácidos podem ter efeitos de atração ou repulsão uns para com os outros, principalmente pelo estabelecimento de pontes bissulfeto (ligação envolvendo dois átomos de enxofre de aminoácidos cisteína), causando flexões (dobras) sobre si mesma, chamada de estrutura terciária. O agrupamento de duas ou mais estruturas terciárias combinadas a outras substâncias, vitaminas ou minerais: ferro, magnésio, iodo, forma a estrutura quaternária. Configuração espacial observada na molécula de hemoglobina, proteína conjugada a íon ferro, compondo os glóbulos vermelhos (hemácias ou eritrócitos do sangue), permitindo o transporte de oxigênio. 1. PESQUISA DA LIGAÇÃO PEPTIDICA: REAÇÃO DO BIURETO O reagente de biureto é uma solução de Cu 2+ em meio alcalino. A reação de biureto é dada por substâncias que contém dois grupos ligados entre si ou através de átomos de carbono. Sendo assim essa reação é positiva a partir de tripeptídeos e para todas as proteínas, devido às ligações peptídicas. A natureza do composto formado nessa reação não foi esclarecida. 9 Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 1 mL de glicina 1% c) 1 mL de gelatina 1% d) 1 mL de caseína 1% e) 1 mL de leite f) 1 mL de soro ou plasma g) 1 mL de ovoalbumina 2% h) 1 mL de edulcorante 0,5% Acrescentar a cada tubo 1 mL de Reativo de Biureto (CuSO4 em meio alcalino). Agitar continuamente. Observar. Explicar. 2. PRECIPITAÇÃO Usando uma solução de ovoalbumina a 2% verificar os diferentes processos que podem levar à precipitação de uma proteína. A – PRECIPITAÇÃO POR FORMAÇÃO DE SAIS INSOLÚVEIS Dependendo da carga as proteínas formam sais insolúveis com cátions como prata (Ag + ) ou com ânions como tungstato (WO4 - ). Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de nitrato de prata 10% b) 1 mL de tungstato de sódio 10% c) 1 mL de tungstato de sódio 10% e ácido sulfúrico 0,7 mol/L d) 1 mL de acido tricloroacético (TCA) 20% Colocar aproximadamente 2 mL de ovoalbumina em cada tubo. Agitar. Observar e explicar. Deduzir a partir dos resultados, a carga da ovoalbumina. Conferir sua conclusão medindo o pH da solução com papel indicador e sabendo-se que o pI = 4,7. 10 B – PRECIPITAÇÃO POR OUTROS MECANISMOS Colocar aproximadamente 2 mL de ovoalbumina (pI = 4,7) em cada tubo (a, b, c, d), acrescentando a cada um deles: a) 2 mL de acetona b) Sulfato de amônio (sólido) até saturação c) 2 mL de água. Aquecer. d) 2 mL de tampão acetato pH 4,7 1 mol/L Observar e explicar. 3. DESNATURAÇÃO PELA URÉIA Soluções concentradas de ureia podem alterar a conformação das proteínas, modificando as suas propriedades, pois a ureia quebra as ligações de hidrogênio. Assim, a albumina do ovo pode ser desnaturada pela ureia, que modificando sua conformação, expõe seus grupos –SH. A reatividade dos grupos –SH é evidenciada pela reação com nitroprussiato de sódio em solução alcalina, ocorrendo o desenvolvimento de uma coloração rósea, que logo desaparece. Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 1 mL de cisteína 0,02% c) 1 mL de ovoalbumina 2% d) 1 mL de ovoalbumina 2% + ureia sólida até saturação Adicionar a cada tubo, 2 gotas de solução 5% de nitroprussiato de sódio e, rapidamente 2 gotas de hidróxido de amônio 6 mol/L. Observar. Explicar. Obs.: As soluções de nitroprussiato e de cisteína devem ser recém-preparadas QUESTIONÁRIO 1. Dar as fórmulas da cisteína, caseína, ureia e TCA. 2. O que ocorreu em cada tubo nos itens 1, 2 e 3? 3. O que o reagente biureto identifica? 4. O que é ligação peptídica? 5. Por que se utilizou nitrato de prata, tungstato de sódio e TCA no item A? 6. O que acontece quando se adiciona ureia nos itens de a) a d) no item 3? 7. O que identifica o nitroprussiato de sódio? 8. Por que se utiliza meio básico? 11 4 a AULA: REAÇÕES DE IDENTIFICAÇÃO DOS CARBOIDRATOS Os monossacarídeos mais importantes são os formados dos por cinco ou seis átomos de carbono (pentoses e hexoses, respectivamente). Por serem moléculas muito ricas em grupamentos hidroxila (-OH), os monossacarídeos podem ser facilmente desidratados por ação de ácidos fortes concentrados, como o ácido sulfúrico (H2SO4). O ácido rompe facilmente as ligações glicosídicas presentes em moléculas de polissacarídeos, quebrando-os e fornecendo seus monossacarídeos. Esses, por sua vez, são desidratados e pode-se ter como produto: o furfural, quando o monossacarídeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. Tanto o furfural quanto o HMF são substâncias incolores, impedindo que a reação seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenólico ao meio (alfa- naftol, conhecidocomo reativo de Molisch). O fenol reage como os produtos incolores, e provoca o aparecimento de um anel de coloração violeta. EM TODOS OS EXPERIMENTOS FAZER TABELAS COM OS RESULTADOS 1. REAÇÃO COM REAGENTE DE MOLISH (solução de alfa-naftol a 5% em etanol) Sob a ação desidratante do H2SO4 concentrado, os monossacarídeos dão origem ao Furfural ou seus derivados. Estas substâncias condensam-se com o alfa-naftol, produzindo um complexo de cor violeta e de composição incerta. Como a ligação glicosídica pode ser hidrolisada em meio ácido, os di e polissacarídeos também dão reação positiva. 12 Preparar a seguinte série de tubos contendo aproximadamente: a) 1 mL de H2O b) 1 mL de glicose 0,1 M c) 1 mL de sacarose 0,1 M d) 1 mL de amido 0,5% e) 1 mL de edulcorante 0,5% (aspartame) Colocar em cada tubo de ensaio (I a V) 2 (duas) gotas de Reagente de Molisch. Agitar bem. Adicionar 1 mL de H2SO4 concentrado em cada tubo, inclinando-o e deixando o ácido escorrer pela parede. Observar as alterações nas colorações e anotar os resultados. Tabela 1 Identificação dos carboidratos. Amostras Resultados Água Glicose Sacarose Amido Aspartame 2. REAÇÃO COM O REAGENTE DE LUGOL (solução de iodo-iodeto em água) O Reagente de Lugol (5g de I2 + 10g KI em 100 mL de H2O e diluido 20 vezes com H2O) dá com amido, um complexo de cor púrpura e com glicogênio, um complexo de cor vermelha. Obs: Essa reação não pode ser feita em meio alcalino devido a formação de iodeto I - : I2(s) + 2 HO - (aq) IO - (aq) + I - (aq) + H2O(l) Preparar a seguinte série de tubos contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 1 mL de glicose 0,1 M c) 1 mL de sacarose 0,1 M d) 1 mL de amido 0,5% e) pequena porção de algodão + 1 mL de H2O 13 Tabela 2 Identificação dos carboidratos. Amostras Resultados Água Glicose Sacarose Amido Algodão Acrescentar a cada tubo 5 gotas de Reagente de Lugol. Observar. Aquecer brandamente na chama o tubo d. Observar. Resfriar. Observar. Interpretar os resultados obtidos. 3. REAÇÃO DE SELIWANOFF (solução de resorcinol em HCl diluído) Essa reação permite a diferenciação entre aldoses e cetoses. O Reagente de Seliwanoff é uma solução que contém 0,05g de resorcinol em 100 mL de HCl diluído (1parte de HCl conc.: 1 parte de H2O). Este teste permite separar aldoses de cetoses que sob a ação desidratante do HCl, as cetoses são transformadas em derivados de furfural, que se condensam com o resorcinol, formando um compostos vermelhso de composição incerta. Preparar os seguintes tubos de ensaio, contendo aproximadamente: a) 3 mL Seliwanoff + 5 gotas de água b) 3 mL Seliwanoff + 5 gotas de glicose 0,1 M c) 3 mL Seliwanoff + 5 gotas de frutose 0,1 M d) 3 mL Seliwanoff + 5 gotas de sacarose 0,1 M Colocar os tubos em banho-maria e observá-los de 2 em 2 minutos, durante 10 minutos. Explicar os resultados obtidos. Tabela 3 Identificação dos carboidratos. Amostras Resultados Água Glicose Frutose Sacarose 14 4. REAÇÃO DO AÇUCAR REDUTOR – REAÇÃO DE BENEDICT Os hidratos de carbono, que possuem grupamento glicosídico livre, são capazes de reduzir íons de Cu 2+ , Ag + e Bi 3+ . A redução do Cu 2+ é conseguida em meio alcalino, à quente: Cu 2+ Cu + Cu2O óxido cuproso que corresponde a um precipitado vermelho ou amarelo. O Reativo de Benedict pode atender duas finalidades: Análise qualitativa e quantitativa. As composições dos reativos para essas análises são: Benedict qualitativo: CuSO4 2% + Citrato Na + 20% + Na2CO3 2M Benedict quantitativo: CuSO4 2% + Citrato Na + 20% + Na2CO3 2M + KSCN 30% Essas composições permitem que o cobre fique complexado ao citrato, evitando que em meio alcalino possa também ocorrer a formação de CuO óxido cúprico, que por apresentar coloração preta mascararia o resultado. O reagente de Benedict, também chamado de Gayder, é usado geralmente no lugar da solução de Fehling. Identifica açúcares redutores, nos quais se incluem glicose, galactose, lactose, maltose e manose. A coloração inicial do reagente de Benedict é azul. Em presença de um agente redutor, após o aquecimento tem-se o aparecimento de coloração castanha opaca e/ou precipitado da mesma coloração. Esse fenômeno é justificado pela seguinte reação: Cu 2+ (aq) +4OH – (aq) + RCHO(aq) RCOOH(aq) + Cu2O(s) + 2H2O(l) Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 1 mL de glicose 0,1M c) 1 mL de frutose 0,1M d) 1 mL de sacarose 0,1M e) 1 mL de amido 0,5% f) 1 mL de lactose 0,1M g) 1 mL de açucar comum 1% h) 1 mL de edulcorante (aspartame) 15 Acrescentar a cada tubo 1 mL de Reativo de Benedict. Aquecer aproximadamente por 5 minutos em banho-maria fervente. Observar. Explicar. Amostras Resultados Água Glicose Frutose Sacarose Amido Lactose Açúcar comum Aspartame 16 5 a AULA: HIDRÓLISE DE CARBOIDRATOS 1. HIDRÓLISE DE DISSACARÍDEO Colocar em tubo de ensaio (A) 1 mL de sacarose 0,1M + 4 mL H2SO4 0,1M. Misturar e retirar imediatamente uma alíquota de 1 mL e colocá-la em um tubo de ensaio rotulado como T0 (indicando zero minutos de incubação). Neutralizar imediatamente a solução, adicionando NaOH gota a gota, acompanhando a neutralização com papel indicador de pH. Deixar o tubo T0 na estante. Colocar o tubo A em banho-maria fervente. Decorridos 10 minutos, remover uma alíquota de 1 mL do tubo A para um tubo rotulado como T10 e proceder à neutralização. Acrescentar aos tubos T0 e T10, 1 mL de Reagente de Benedict, misturar bem e colocá-los em banho-maria fervente. Observar. Explicar os resultados obtidos nos tubos T0 e T10. 2. HIDRÓLISE DE POLISSACARÍDEO Colocar em erlenmeyer: 10 mL amido 0,5% + 5 gotas HCl concentrado. Misturar bem e retirar imediatamente duas alíquotas de 1 mL, colocando em dois tubos de ensaio rotulados como T0 (zero minutos de incubação) sendo: T0B (para análise de Benedict) e T0L (para análise de Lugol). Neutralizar apenas o tubo T0B e deixá-lo na estante. Colocar o erlenmeyer diretamente no bico de gás, sobre a tela de amianto, controlando a fervura. Decorridos 10 minutos de fervura, remover duas alíquotas de 1mL para dois tubos de ensaio rotulados como T10 (10 minutos de incubação) sendo: T10B (para análise de Benedict que deverá ser neutralizado como feito anteriormente) e tubo T10L (para análise de Lugol) Após o resfriamento dos tubos, adicionar 4 gotas de Lugol aos tubos T0L e T10L. Aos tubos T0B e T10B adicionar 1 mL de Reativo de Benedict e aquecer em banho- maria. Anotar e explicar os resultados obtidos. 17 6 a AULA: ENZIMAS 1. INTRODUÇÃO As enzimas são proteínas especializadas em catalisar reações biológicas, ou seja, aumentam a velocidade de uma reação química sem interferir no processo. Elas estão associadas a biomoléculas, devido as suas extraordinárias especificidade e poder catalítico. As enzimas, parte deste grupo de proteínas, funcionam como catalisadores, permitindo que uma reação química venha a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biológicas. Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma enzima e como esta funciona, devemos considerá-la tantocomo uma proteína quanto um catalisador biológico. 2. PROCEDIMENTO 2.1 PREPARO DAS ENZIMAS 2.1 Amilase salivar: Coletar aproximadamente 3,0mL de saliva num béquer de 50 mL graduado e completar para 30 mL com solução salina (NaCl 0,9%). Manter no gelo. 2.2 Invertase: misturar 50g de levedura seca (fermento de padaria) com 150mL de NaHCO3 0,1M em um erlenmeyer de 1L. Fechar o frasco com algodão e colocá-lo em banho-maria a 40 - 45 o C. Deixar a preparação autolisar-se durante 24 horas. Centrifugar a 15.000 g por minuto durante 15 minutos. Decantar. Manter o sobrenadante em banho de gelo a 0 - 2 o C. 3. ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA DA INVERTASE Adicionar a 4 tubos de ensaio (a, b, c, d), mantidos em recipiente com gelo picado, 2,0 mL de invertase. Em seguida adicionar 2,0mL dos componentes indicados abaixo: a) Água (H2O) b) Sacarose c) Amido d) Ovoalbumina 18 Homogeneizar as soluções e colocar no banho termostatizado a 37 o C. Após 15 minutos de incubação, voltar os tubos para o gelo e retirar uma alíquota de 1,5mL de cada tubo (a, b, c, d) respectivamente para os tubos aL bL cL dL Adicionar 4 gotas do Reativo de Lugol a cada tubo e anotar os resultados. Aos tubos que foram incubados (a, b, c, d), fazer a reação de Benedict, adicionando l,0 mL deste reagente a cada tubo e aquecimento em banho de água fervente por aproximadamente 5 minutos. Anotar os resultados. 4. ESPECIFICIDADE ENZIMÁTICA DA AMILASE SALIVAR Seguindo o mesmo protocolo do item anterior, adicionar a 4 tubos de ensaio (a, b, c, d), mantidos em recipiente com gelo picado, 2,0mL de amilase. Em seguida adicionar 2,0mL dos componentes indicados abaixo: a) H2O b) sacarose c) amido d) ovoalbumina Após 15 minutos de incubação a 37 o C, retirar uma alíquota de 1,5mL de cada tubo (a,b,c,d) e transferir essas alíquotas respectivamente para os tubos aL bL cL dL Adicionar 4 gotas do Reativo de Lugol a cada tubo e anotar os resultados. Aos tubos que foram incubados (a, b, c, d) fazer a reação de Benedict, adicionando l,0mL deste reagente a cada tubo e aquecimento em banho de água fervente por aproximadamente 5 minutos. Anotar os resultados. 5. DESNATURAÇÃO Colocar em 4 tubos, mantidos no gelo, aproximadamente: a) 1,0mL de amilase salivar (saliva 1:10) in natura b) 1,0mL de amilase salivar (saliva 1:10) previamente fervida durante 10 minutos e resfriada c) 1,0mL de amilase salivar (saliva 1:10) in natura + 5 gotas de HCl 2M d) 1,0mL de H2O 19 Acrescentar a cada tubo 2,0mL de amido 0,5%, misturar bem e em seguida incubar por 15 minutos em banho-maria a 37 o C. Após a incubação: a) Retirar alíquotas de aproximadamente 1,0mL de cada tubo incubado (a, b, c, d) para novos tubos que serão rotulados como: aL bL cL e dL e adicionar a cada um 4 gotas do reativo de Lugol a frio. b) Em seguida nos tubos a, b, c e d, que foram incubados, adicione 1,0mL do reagente de Benedict a cada tubo e os rotule como aB bB cB dB. Aqueça-os em banho de água fervente por aproximadamente 5 minutos e anote os resultados. 6. QUESTIONÁRIO 1. Explicar os resultados obtidos em todos os tubos. 2. Correlacionar os resultados entre os tubos. 3. Qual o objetivo do experimento realizado? 4. Qual é a ação da amilase e da invertase no experimento? 5. Porque foi adicionado o Reagente de Lugol nos tubos? Qual se obteve resultado positivo e por quê? 6. Porque foi adicionado o Reagente de Benedict nos tubos? Qual se obteve resultado positivo e por quê? 20 7 a AULA: LIPIDEOS Lipídeos são substâncias caracterizadas pela baixa solubilidade em água e outros solventes polares, e alta solubilidade em solventes orgânicos (apolares). São vulgarmente conhecidos como gorduras e suas propriedades físicas estão relacionadas com a natureza hidrófoba das suas estruturas. A maioria dos lipídios é derivada ou possuem na estrutura, ácidos graxos que são ácidos orgânicos, a maioria de cadeia alquil longa, com mais de 12 carbonos e a cadeia alquil pode ser saturada ou insaturada. 1. ADIÇÃO DE IODO – REATIVO DE HÜBL (solução de iodo e cloreto mercúrico em etanol) Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 1 mL de água b) 3 gotas de óleo (aprox. 200 mg de óleo de soja) c) 1 pitada de gordura (aprox. 200 mg de gordura vegetal) d) 1 pitada de margarina (aprox.. 200 mg de margarina) e) 200 mg de estearina Acrescentar a cada tubo 3 mL de clorofórmio. Agitar até dissolução total. Acrescentar 4 em todos os tubos 3 gotas de reativo de Hübl. (7,8 g de I2 + 9+ g de HgCl2 em 300 mL de etanol). Observar. Explicar. 2. HIDRÓLISE ALCALINA DOS TRIGLICERÍDEOS Colocar um pedaço de manteiga ou qualquer gordura em um erlenmeyer e adicionar 20 mL de KOH 5% em álcool. Cobrir com papel alumínio. Aquecer em banho-maria, durante aproximadamente 5 minutos. Verificar se a saponificação foi completa, observando a solubilidade de uma alíquota da mistura em água. Guardar a solução. Dar a reação química ocorrida. Obs: Se for grande a evaporação, pode ser acrescentada água. 21 3. FORMAÇÃO DE SABÃO INSOLÚVEL Colocar em um tubo de ensaio 2 mL de solução de sabão preparada no item 2. Acrescentar 2 mL de CaCl2 – 10%. Observar. Explicar. 4. DIFERENCIAÇÃO ENTRE SABÃO E DETERGENTE Os sabões são sais de sódio ou potássio de ácidos graxos (RCOO - ), enquanto que os detergentes, usualmente encontrados no comércio são sais de sódio ou potássio de ácidos sulfônicos (R-OSO3 - ). Preparar a seguinte série de tubos, contendo aproximadamente: a) 2 mL do sabão preparado no item 2 b) 2 mL do sabão preparado no item 2 c) 2 mL da solução diluída de detergente (1:10) d) 2 mL da solução diluída de detergente (1:10) Acrescentar aos tubos a e c 1 mL de HCl 1 M. Observar. Explicar. Acrescentar aos tubos b e d 2 mL de solução saturada de NaCl. Observar. Explicar. Acrescentar aproximadamente 5 mL de água a cada um dos quatro tubos. Observar. Explicar. EM TODOS OS EXPERIMENTOS FAZER TABELAS COM OS RESULTADOS QUESTÕES 1 - Em que consiste o teste da solubilidade dos lipídeos? 2 - Quais os produtos da hidrólise alcalina de um triglicerídeo (reação de saponificação)? 3 - Qual a finalidade do teste de saponificação? 4 - Em que consiste o teste do iodo? O que caracteriza o teste do iodo como positivo? 5 - Por que o teste do iodo é capaz de identificar ácidos graxos insaturados? 22 REFERÊNCIAS BROSSI, E. Apostila de laboratório de Bioquímica. Faculdades Oswaldo Cruz. Curso de Bacharelado em Química. 2014. CHAMPE, P. C. Bioquímica Ilustrada. 2. ed. Porto Alegre: Artes Médicas, 1996. MARZZOCO, A.; TORRES, B. B. Bioquímica Básica. 3. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan S.A., 2007. ISBN 978-85-277-1284-2.
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