relatório prática - 04 análise de ácidos amargos

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Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia do Ceará
Disciplina de Laboratório de Química Orgânica
Quarta prática
Análise de ácidos amargos (alfa e beta ácidos) e xanthohumol em extratos hexânicos e metanólicos de lúpulo, utilizando cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)
 Alunos: xxxxxxxxxx
	 
Professor: xxxxx
 
Data da Prática: 20/05/2019 e 03/06/2019 
Data da Entrega: 17/06/2019
INTRODUÇÃO
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A grande variedade de combinações entre fases móveis e estacionárias a torna uma técnica extremamente versátil e de grande aplicação. [1] 
Visto ser uma técnica bastante versátil e de grande aplicação, existem vários tipos de Cromatografia, que são:
Cromatografia em camada delgada é uma técnica para líquido-sólido, na qual a fase líquida ascende por uma camada fina de adsorvente sobre um suporte, geralmente, uma placa de vidro colocada dentro de um recipiente fechado. Ao ascender, o solvente arrastará mais os compostos que interagiram menos na fase estacionária. Isso provocará a separação dos componentes mais adsorvidos. [2]
A cromatografia gasosa é um processo de separação dos componentes da mistura através de uma fase gasosa móvel sobre um solvente. Esse método ocorre em um tubo estreito, por onde os componentes da mistura irão passar por uma corrente de gás, que representa a fase móvel, em fluxo do tipo coluna. A fase estacionária é representada pelo tubo. Os fatores que promovem a separação dos componentes são: a estrutura química do composto, a fase estacionária e a temperatura da coluna. [2]
	Figura 1: Etapas da cromatografia gasosa
	
	Fonte: https://www.todamateria.com.br/cromatografia/
Na cromatografia líquida, a fase estacionária é constituída de partículas sólidas organizadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel. A cromatografia líquida compreende a cromatografia líquida clássica e a cromatografia líquida de alta eficiência: Cromatografia líquida clássica: a coluna é preenchida, geralmente, uma só vez, pois parte da amostra usualmente se adsorve de forma irreversível. Cromatografia líquida de alta eficiência: é uma técnica que utiliza bombas de alta pressão para a eluição da fase móvel. Isso faz com que a fase móvel possa migrar a uma velocidade razoável através da coluna. Assim, pode realizar a análise de várias amostras em pouco tempo. Porém, necessita de equipamentos específicos. [2]
	Figura 2: Etapas da cromatografia líquida
	
	Fonte: https://www.todamateria.com.br/cromatografia/
	
	
A HPLC é utilizada em análises de compostos não voláteis ou instáveis termicamente onde a cromatografia a gás não pode ser utilizada. Nas análises clínicas é utilizada na detecção de metabólitos, proteínas, peptídeos, aminoácidos etc. Como exemplo temos a dosagem de 25-Hidróxi-vitamina D, Hemoglobina glicada, hormônios esteroides, entre outras. [3] Outra aplicação da técnica é na identificação de compostos de interesse da indústria cervejeira, a partir de análises em flores de lúpulo. 
Lúpulo, é uma liana, angiosperma, da espécie Humulus lupulus, da família Cannabaceae, nativa da Europa, Ásia ocidental e América do Norte. É uma planta dioicia, perene, herbácea, que cresce brotos no início da primavera e definha como um rizoma endurecido no inverno. Sendo uma trepadeira, tem capacidade de crescer em torno de 4,6 a 6,1 metros. [4] 
O lúpulo é tradicionalmente usado, junto com o malte (grão maltado), a água e a levedura, na fabricaçāo da cerveja. No calor do cozimento da mistura, o lúpulo libera suas resinas de sabor amargo, dando à cerveja sabor característico. O lúpulo é um conservante natural, sendo essa uma das principais razões para ser adotado na produção de cerveja.  A utilização na cerveja é o maior uso comercial do lúpulo.[5] A flor de Humulus Lupulus é utilizado como condimento e conservante em quase todas as cervejas hoje em dia. As resinas do lúpulo são compostas por dois principais ácidos: alfa ácidos e beta ácidos.
Ácidos alfas têm um leve efeito antibiótico/bacteriostático contra bactéria Gram-positiva, e favorece a atividade exclusiva da levedura durante a fermentação da cerveja. Os alfas ácidos são responsáveis ​​pelo sabor amargo na cerveja, porém o mesmo é insolúvel em água até ser isomerizado pela ebulição do mosto. Quanto maior o tempo de ebulição, maior o percentual de isomerização e mais amarga a cerveja será. No entanto, os óleos que contribuem com sabores e aromas característicos são voláteis e se perdem em grande quantidade durante longas fervuras. Há muitas variedades de lúpulo, mas estes podem ser divididos em duas categorias gerais: Amargor e Aroma. Lúpulos de amargor são ricos em ácidos alfa, cerca de 10 por cento de seu peso. [6]
Beta ácidos não isomerizam durante a fervura do mosto, e têm um efeito desprezível no sabor da cerveja. Em vez disso, eles contribuem para o aroma da cerveja; variedades de lúpulo com elevados níveis de beta ácidos são muitas vezes adicionados no final da fervura do mosto para conferir aroma. Beta ácidos, podem oxidar e dar origem a compostos como o dimetilsulfureto (DMS), que produz na cerveja sabores estranhos, como legumes podres ou milho cozido. [6]
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
MATERIAIS / MÉTODOS
- Béquer - enpedorff 			 - pipeta pasteur - pipeta automática - rota evaporador - bastão de vidro - proveta -- sistema sohxlet - vial - papel filtro - banho a frio - balão volumétrico - espátula - cone de lúpulo - ponteiras - centrífuga - bomba vácuo - hexano - metanol - ácido acético - extratos de lúpulo - padrão de xanthohumol 
DESCRIÇÃO
A primeira parte da prática foi o preparo e a secagem dos extratos. Foram pesados aproximadamente 5,01 gramas de flores de lúpulo e sob um papel laminado o material foi triturado com uma tesoura esterilizada e o mesmo foi colocado em um cartucho de papel filtro e vedado com algodão. Um sistema sohxlet foi preparado e 150 ml de hexano foram colocados no balão de fundo redondo, o sistema foi ligado e observou-se todo o ocorrido, o processo deve ser repetido três vezes com intervalo de 3 horas após a primeira virada. O mesmo processo deve ser repetido utilizando 150 ml de metanol. 
O professor realizou a volatilização do extrato utilizando um rota evaporador, a amostra foi inserida em um frasco de evaporação, que foi colocado no banho de aquecimento. Essa amostra passou, então, pelo processo de rotação horária e anti-horária, sendo realizada a evaporação. Depois de evaporada, a substância foi removida e direcionada para um condensador, onde, em
contato com água refrigerada, volta ao seu estado líquido. Dessa forma, as substâncias da amostra podem ser separadas com eficiência e facilidade, conseguindo recuperar até 90 % do solvente.
Na segunda parte foi demonstrado como se faz uma análise cromatográfica no HPLC, a amostra é dissolvida em um solvente e introduzida na coluna cromatográfica preenchida com a fase estacionária (FE). Um solvente (FM) é bombeado com vazão constante e desloca os componentes da mistura através da coluna. Esses se distribuem entre as duas fases de acordo com suas afinidades, as substâncias com maior afinidade com a FE movem-se mais lentamente. Já as substâncias com pouca afinidade com a FE movem-se mais rapidamente. Ao sair da coluna, os componentes passam por um detector que emite um sinal elétrico o qual é registrado, constituindo um cromatograma.
Para a construção da curva de calibração foi utilizado um software de planilha, no qual foi inserido as informações das amostras, como o comprimento de onda e área de retenção, a partir desses dados foram construídos gráficos relacionando o comprimento de onda com as áreas de cada concentração. Como é mostrado a seguir:
Gráfico 1: Curva de calibração Xanthohumol extraído da planta Humulus lupulus em 325 nm.
Gráfico 2: Curva de calibração Xanthohumol extraído da planta Humulus lupulus em 275,4 nm.
Gráfico 3: Curva de calibração Xanthohumol extraído da planta Humulus lupulus em 278,4nm.
Gráfico 4: Curva de calibração Xanthohumol extraído da planta Humulus lupulus em 340 
nm.
 Considerada as condições de preparo da solução que foi submetida a corrida cromatográfica que gerou a curva, podemos destacar os seguintes valores:
	Massa molar da flor
	10, 0732 gramas
	Massa do extrato (MeOH)
	1,7230 gramas
	Concentração da solução
	10 mg/ml (10.000 ppm)
	Massa molecular do xanthohumol
	340g/mol
	Massa da amostra
	40452,70193
Tabela 1: Informações em termos de massa e concentração no preparo da solução até a realização da corrida.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Através da equação do valor de R², que tem que ser próximo de um, foi observado que o gráfico 4 tem a curva mais correta, logo este será usado para determinar a quantidade de Xanthohumol extraído da planta Humulu Lupulus.
Através da equação da reta do gráfico 4, podemos descobrir a concentração em ppm, contidas na amostra.
X = = X = 88,62 ppm
 Agora é determinada a quantidade em percentual do extrato.
10.000 ppm --- 100%
88,62 ppm -------- X
X= 0,8862%
Relacionando a massa do extrato e relações percentuais, juntamente com a porcentagem de extrato podemos descobrir a massa em gramas do Xanthohumol.
1,3720g ---- 100%
X ---- 0,8862%
X = 0,015g
Agora a porcentagem de extrato para a massa de 10,0732g da flor analisada.
10,0732 --- 100 %
 0,015 g ---- X
X = 0,14%
BIBLIOGRAFIA 
[1] DEGANI, Ana Luiza; CASS, Quezia; VIEIRA, Paulo. Cromatografia um breve ensaio. QUÍMICA NOVA NA ESCOLA, (abreviado ou não) Local de Publicação, N° 7, págs. 21-25, maio 1998.
[2] MAGALHÃES, Lana – Cromatografia– disponível em: <https://www.todamateria.com.br/cromatografia/> – acesso em: 16 de junho de 2019. 
[3] CAMMARA, Brunno – HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência – disponível em: < https://www.biomedicinapadrao.com.br/2015/04/hplc-cromatografia-liquida-de-alta.html> – acesso em: 16 de junho de 2019. 
[4]  S.A., Priberam Informática,. «Significado / definição de pé-de-galo no Dicionário Priberam da Língua Portuguesa». www.priberam.pt. Consultado em 16 dejunho de 2019.
[5]  A. H. Burgess, Hops: Botany, Cultivation and Utilization, Leonard Hill (1964), ISBN 0-471-12350-1.
[6] Palmer, John. «How to Brew». Consultado em 6 de Julho de 2012.