DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE, COM FOCO NO IMUNODIAGNÓSTICO

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UNIFG - CENTRO UNIVERSITÁRIO
FARMÁCIA
FELIPE DA SILVA MOREIRA, RUAN FERREIRA SARAIVA, UESLEY LIMA DA SILVA.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE, COM FOCO NO IMUNODIAGNÓSTICO
Guanambi – BA
2020
FELIPE DA SILVA MOREIRA, RUAN FERREIRA SARAIVA, UESLEY LIMA DA SILVA.
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DENGUE, COM FOCO NO IMUNODIAGNÓSTICO
Trabalho da disciplina de Imunologia Clinica, bom o objetivo de enfatizar os conteúdos abordados na matéria durante o período do corrido semestre 
Professor: Raimundo Nonato Faria
Guanambi – BA 
2020
Sumário
INTRODUÇÃO	4
ASPECTOS EPEDEMIOLOGICOS DA DENGUE.	5
CARACTERÍSTICAS CLINICAS DA DENGUE	6
IMUNODIAGNÓSTICO DA DENGUE	7
TRATAMENTO	10
REFÊNCIAS:	12
	
INTRODUÇÃO
A dengue constitui-se a mais importante arbovirose que afeta a espécie humana no continente americano. Caracteriza-se como uma doença infecciosa febril aguda, de etiologia viral e de evolução benigna, na maioria dos casos, podendo apresentar duas formas clínicas: Dengue Clássica e Febre Hemorrágica da Dengue/Síndrome do Choque da Dengue. É causada pelo arbovírus, do gêne-roflavivírus, família flaviviridae, transmitido pela picada do mosquito Aedes aegypti ou qualbopictus que costumam se proliferar em águas sem vazão conforme enfatizam Oliveira e Santos (2012).
Segundo Milani (2016) a dengue se constitui na virose humana mais difundida no mundo, pois com exceção da Europa, ocorre em todos os continentes tropicais e subtropicais que possibilitam o desenvolvimento do seu vetor. Assim, com a inexistência de vacina eficaz, a transmissão da doença só pode ser reduzida por meio do controle populacional do mosquito.
O Aedes aegypti apresenta um ciclo de vida de 45 a 60 dias, da fase de ovo até a sua morte na fase de mosquito, a qual dura de 36 a 47dias. Quando um indivíduo está infectado pelo vírus da dengue e o mosquito se alimenta com seu sangue, este se infecta, passando por um período de latência, no qual o mosquito está contaminado, mas não transmite doença, com duração de 3 a 15 dias, após este período passa a contamina outros indivíduos dos quais venha a se alimentar. Nos humanos o período de latência varia de 5 a 8 dias. O vírus se desenvolve e apresenta a sintomatologia da doença apenas no ser humano7. Atualmente, o Aedes aegypti é considerado problema de saúde pública, visto que além do vírus da dengue, “é transmissor da Febre Chikungunya e Febre Zika sendo que a primeira está relatada em 55 países territórios do continente americano e a segunda em 18 países ou territórios do mesmo continente, ambas com complicações e sequelas importantes pós infecção (POMPEO, 2016 p. 12).
Atualmente são conhecidos quatro diferentes sorotipos do vírus da dengue: DEN-1, DEN-2, DEN-3 e DEN-4. “O ser humano ao ser infectado por um destes quatro tipos de microorganismos desenvolve a dengue e, ao curar-se está protegido para o resto da vida. Isto ocorre graças à produção de defesa específica, porém a proteção não se dá para os outros tipos” (POMPEO, 2016 p. 12).
ASPECTOS EPEDEMIOLOGICOS DA DENGUE. 
Segundo Organização Mundial da Saúde (OMS) 80 milhões de pessoas são infectadas, anualmente, com cerca de 550 mil hospitalizações e 20 mil óbitos . Dessas, aproximadamente, 50 milhões encontram-se em regiões tropicais e subtropicais, levando-se em consideração que, atualmente, 2,5 a 3 bilhões de pessoas vivem expostas ao risco de serem infectadas por esta arbovirose, além do mais, tem sido observado um padrão sazonal de incidência coincidente com o verão, devido à maior ocorrência de chuvas e aumento da temperatura nessa estação. É mais comum nos núcleos urbanos, onde é maior a quantidade de criadouros naturais ou resultantes da ação do ser humano. Entretanto, a doença pode ocorrer em qualquer localidade desde que exista população humana susceptível, presença do vetor e o vírus seja introduzido. 
Nas Américas – a dengue tem sido relatada nas Américas há mais de 200 anos. Na década de 50, a FHD foi descrita, pela primeira vez, nas Filipinas e Tailândia. Após a década de 60, a circulação do vírus da Dengue intensificou-se nas Américas. A partir de 1963, houve circulação comprovada dos sorotipos 2 e 3 em vários países. Em 1977, o sorotipo 1 foi introduzido nas Américas, inicialmente pela Jamaica. A partir de 1980, foram notificadas epidemias em vários países, aumentando consideravelmente a magnitude do problema. Cabe citar: Brasil (1982/1986-2002), Bolívia (1987), Paraguai (1988), Equador (1988), Peru (1990) e Cuba (1977/1981). A FHD afetou Cuba em 1981, evento de extrema importância na história da Dengue nas Américas. Essa epidemia foi causada pelo sorotipo 2, tendo sido o primeiro relato de febre hemorrágica da Dengue ocorrido fora do Sudeste Asiático e Pacífico Ocidental. O segundo surto ocorreu na Venezuela, em 1989 (Carvalho,2006). 
No Brasil – há referências de epidemias desde o século XIX. No século passado há relatos em 1916, em São Paulo, e em 1923, em Niterói, no Rio de Janeiro, sem diagnóstico laboratorial. A primeira epidemia, documentada clínica e laboratorialmente, ocorreu em 1981-1982, em Boa Vista/Roraima, causada pelos sorotipos 1 e 4. Em 1986, ocorreram epidemias no Rio de Janeiro e algumas capitais da região Nordeste. Desde então, a Dengue vem ocorrendo no Brasil de forma continuada, intercalando-se com a ocorrência de epidemias, geralmente associadas com a introdução de novos sorotipos em áreas anteriormente indenes. Na epidemia de 1986, identificou-se a ocorrência da circulação do sorotipo DEN1, inicialmente no estado do Rio de Janeiro, disseminando-se, a seguir, para outros seis estados até 1990. Nesse ano, foi identificada a circulação de um novo sorotipo, o DEN 2, também no estado do Rio de Janeiro (Carvalho,2006).
Durante a década de noventa, ocorreu aumento significativo da incidência, reflexo da ampla dispersão do Aedes aegypti no território nacional. A presença do vetor associada à mobilidade da população levou à disseminação dos sorotipos 1 e 2 para 20 dos 27 estados do país. Entre os anos de 1990 e 2000, várias epidemias foram registradas, sobretudo nos grandes centros urbanos das regiões Sudeste e Nordeste do Brasil, responsáveis pela maior parte dos casos notificados. As regiões Centro-Oeste e Norte foram acometidas mais tardiamente, pois as epidemias de Dengue só foram registradas a partir da segunda metade da década de 90. A maior incidência da doença foi observada em 2002, quando foram registrados cerca de 790 mil casos (Carvalho,2006).
Segundo Carmem (2008) A circulação do sorotipo 3 do vírus foi identificada, pela primeira vez, em dezembro de 2000, também no estado do Rio de Janeiro e, posteriormente, no estado de Roraima, em novembro de 2001. Desde o início da epidemia de 2002 observava-se a rápida dispersão do sorotipo 3 para outros estados: no primeiro semestre de 2004, por exemplo, 23 dos 27 estados do país já apresentavam a circulação simultânea dos sorotipos 1, 2 e 3 do vírus da Dengue.
CARACTERÍSTICAS CLINICAS DA DENGUE 
As manifestações clínicas da infecção por dengue causam uma doença cujo espectro inclui desde formas oligo ou assintomáticas, até quadros com hemorragia e choque, podendo evoluir para óbito. Dentre essas destacam-se a seguir.
Dengue clássico (DC) É a primeira manifestação é a febre alta (39° a 40°C), de início abrupto, seguido de cefaléia, mialgia, prostração, artralgia, anorexia, astenia, dor retroorbital, náuseas, vômitos, exantema, prurido cutâneo. Hepatomegalia dolorosa pode ocorrer, ocasionalmente, desde o aparecimento da febre. Alguns aspectos clínicos dependem da idade do paciente. Desse modo, dor abdominal generalizada tem sido observada mais freqüentemente entre crianças e manifestações hemorrágicas como petéquias, epistaxe, gengivorragia e metrorragia têm sido relatadas mais freqüentemente entre adultos, ao fim do período febril. A doença tem duração de 5 a 7 dias, mas o período
de convalescençapode ser acompanhado de grande debilidade física, e prolongar-se por várias semanas (Larissa; Antunes, 2016). 
Febre hemorrágica da dengue (FHD) – os sintomas iniciais são semelhantes aos do DC, porém há um agravamento do quadro no terceiro ou quarto dias de evolução, com aparecimento de manifestações hemorrágicas e colapso circulatório. A fragilidade capilar é evidenciada pela positividade da prova do laço*. Outras manifestações hemorrágicas incluem petéquias, equimoses, epistaxe, gengivorragia, hemorragia em diversos órgãos (gastrintestinal, intracraniana, etc.) e hemorragia espontânea pelos locais de punção venosa. Nos casos graves de FHD, o choque geralmente ocorre entre o 3º e 7º dias de doença, geralmente precedido por dor abdominal. O choque é decorrente do aumento de permeabilidade vascular, seguida de hemoconcentração e falência circulatória. É de curta duração e pode levar a óbito em 12 a 24 horas ou à recuperação rápida, após terapia antichoque apropriada. Caracteriza-se por pulso rápido e fraco, com diminuição da pressão de pulso e arterial, extremidades frias, pele pegajosa e agitação. Alguns pacientes podem ainda apresentar manifestações neurológicas, como convulsões e irritabilidade (Larissa; Antunes, 2016).
Além do mais, A Organização Mundial da Saúde definiu um critério de classificação das formas de FHD, em 4 categorias, de acordo com o grau de gravidade:
Grau I – febre acompanhada de sintomas inespecíficos, em que a única manifestação hemorrágica é a prova do laço positiva;
Grau II – além das manifestações constantes do Grau I, somam-se hemorragias espontâneas (sangramentos de pele, petéquias, epistaxe, gengivorragia e outras);
Grau III – colapso circulatório com pulso fraco e rápido, diminuição da pressão arterial ou hipotensão, pele pegajosa e fria e inquietação;
Grau IV – choque profundo, com pressão arterial e pulso imperceptíveis (síndrome do choque da dengue).
O Anexo 2 apresenta um roteiro para o diagnóstico e manejo clínico do paciente com dengue (Larissa; Antunes, 2016).
IMUNODIAGNÓSTICO DA DENGUE 
Considerando que os sintomas iniciais da dengue são pouco específicos para diferenciá-los de outras doenças febris, o desenvolvimento de diagnósticos laboratoriais para essa doença torna-se extremamente importante. O diagnóstico da dengue pode ser realizado de forma direta ou indireta. O diagnóstico de forma direta inclui isolamento viral em cultura seguido por revelação da presença das partículas virais através de anticorpos específicos. Outras técnicas de detecção direta são os testes de imuno-histoquímica e o teste molecular por RT-PCR, sendo este último o mais utilizado para o diagnóstico da dengue. Esta técnica é baseada na detecção do RNA viral no soro de pacientes com suspeita, e quando os genes correspondentes às proteínas estruturais são utilizados, pode-se realizar simultaneamente a detecção e a tipagem do sorotipo através da técnica de PCR semi-nested, existe ainda o RT-PCR quantitativo que além de detectar e tipar o sorotipo infectante é capaz de determinar a carga viral (Lanciotti; Gomes 2007).
O diagnóstico indireto, por sua vez, inclui ensaios formato ELISA de captura para detecção de anticorpos IgM, e ELISA indireto para a demonstração de anticorpos da classe IgG no soro de pacientes (métodos mais comumente utilizados), ensaios de inibição da hemaglutinação e fixação de complemento, ambos pouco utilizados, além da técnica de soroneutralização (Reynes et al.,1994 ; Pavri & Ghosh, 1969). O teste utilizado no diagnóstico da dengue deve ser escolhido levando-se em conta a fase da doença com base na data do início dos sintomas no paciente. Porém, quando possível, testes pareados devem ser priorizados para definição mais precisa de infecções primárias e secundárias (Schilling, 2004).
O isolamento viral é considerado o teste padrão-ouro para o diagnóstico e sorotipagem das infecções por DEN. Porém é uma metodologia morosa, pois demanda infecção de culturas de células com amostras suspeitas, equipamentos e reagentes para análise dos resultados, além de pessoal técnico qualificado. A detecção de ácidos nucléicos virais oferece um diagnóstico mais rápido e sensível do que os métodos tradicionais de isolamento, mas requer técnicos especializados e equipamentos e reativos na maioria das vezes importados. Deste modo, testes diagnósticos sorológicos de formato simples e rápidos, como os ensaios do tipo ELISA, permitem a análise simultânea de um grande número de amostras, o que se apresenta como uma opção atrativa, especialmente no contexto epidêmico da dengue nas Américas.
Existem disponíveis no mercado alguns testes para o diagnóstico dengue, a maior parte utilizando o formato de ELISA, este ensaio em formato de ELISA de captura é capaz de detectar imunoglobulinas da classe IgM e IgG utilizando a proteína E recombinante dos quatro sorotipos da dengue .Vale salientar que a maioria chega ao Brasil importados de países europeus, EUA ou Austrália. Alguns destes kits podem detectar IgM e/ou IgG e distinguir simultaneamente uma infecção primária de uma infecção secundária. Como exemplo é possível citar o teste rápido Pan BioTM, onde IgG ou IgM são detectadas no soro de pacientes por um sistema baseado em imunocromatografia, onde aos anticorpos contra o vírus dengue são detectados no soro de indivíduos com suspeita de dengue por testes em formato de ELISA de captura para IgM ou ELISA indireto para IgG (Cuzzubbo; Vajpayee 2001).
Alguns kits para dengue utilizam partículas virais inativadas obtidas de cultura celular ou extratos brutos. Porém, este tipo de metodologia esbarra em limitações que vão desde as variações entre lotes, uso de um grande número de animais e risco da manipulação de material patogênico (Borba, 2004).
Embora a maioria dos testes para detectar a infecção pelo vírus dengue atualmente comercializados no Brasil apresente um bom desempenho, o uso de partículas virais inativadas como antígeno pode gerar reatividade cruzada com anticorpos gerados contra outros Flavivirus. Na tentativa de contornar esses problemas, a utilização de anticorpos monoclonais contra epítopos específicos do vírus da dengue tem se tornado uma alternativa viável para a inclusão em kits diagnósticos que utilizam como antígeno partículas nativas ou proteínas recombinantes. Diversos clones produtores de anticorpos antidengue já foram obtidos e caracterizados por imunização de animais com partículas virais nativas ou proteínas recombinantes (Falconar.,1998; Antúnez., 2001).
A metodologia empregada nos anticorpos monoclonais ocorre em uma das fases da reação. Resumidamente, anticorpos anti-IgM foram fixados à fase sólida e após incubação das placas com o soro dos pacientes adicionou-se à reação antígenos virais tetravalentes. Os antígenos foram então detectados com o anticorpo monoclonal grupo – específico (4G2) ou com soro de pacientes contendo IgG contra o vírus dengue. Os resultados obtidos demostraram que a utilização de um anticorpo monoclonal foi capaz de aumentar a especificidade da reação. Outros dois trabalhos descrevem o desenvolvimento de testes em formato de ELISA de captura, e que utilizam anticorpos monoclonais para a detecção da proteína não-estrutural NS1 do DENV-1 e DENV-2. Compilando o resultado destes dois estudos é possível afirmar que a utilização de anticorpos monoclonais em uma das fases da reação foi capaz de aumentar a sensibilidade e especificidade dos testes (Young, 2000).
Contudo, uma vez que não existem vacinas e/ou terapias antivirais específicas contra a dengue, a única forma de se reduzir a mortalidade causada pela infecção é o diagnóstico. Uma detecção rápida e inequívoca da infecção permite a adoção de medidas de suporte ao paciente, como a hidratação, que contribui para reduzir a gravidade da doença. Portanto, torna-se crucial a disponibilidade de testes de diagnóstico de baixo custo, rápidos e específicos para dengue.
TRATAMENTO
Não existe tratamento específico para dengue sendo indicados a princípio, apenas sintomáticos e hidratação, certo é que existe umprotocolo que descrito pelo Ministério da Saúde. Ele foi criado com intuito de evitar o retardo no diagnóstico de formas graves de dengue e no seu tratamento, e propõe que todo paciente com suspeita da doença seja dividido em quatro grupos, de acordo com os achados da anamnese e do exame físico, orientando a conduta adequada a ser adotada em cada caso. 
Grupo A: Casos suspeitos de dengue com prova de laço negativa, sem manifestações hemorrágicas espontâneas e sem sinais de alarme, para esses casos é recomendada a coleta de hemograma, que deve ser feita no mesmo dia podendo o resultado ser checado em até 24 horas. Tratamento consiste em: hidratação oral com volume de 60 a 80ml/Kg/dia, sendo 1/3 desse volume com soro de reidratação oral e os 2/3 restantes com líquidos caseiros como água, suco de frutas, chás (Ministério da Saúde. Dengue, 2007).
Grupo B: Casos suspeitos de dengue com prova do laço positiva ou manifestações hemorrágicas espontâneas, sem repercussões hemodinâmicas. Sinais de alarme ausentes, Nesses pacientes a coleta de hemograma é obrigatória e deve ser feita de imediato. O paciente deve permanecer na unidade de saúde, recebendo inicialmente hidratação oral e sintomáticos conforme descrito no grupo A, até que se tenha o resultado do hemograma, quando poderão ocorrer três situações:.
Se for verificado hematócrito aumentado em até 10% acima do valor basal (ou, na ausência deste, hematócrito entre 40-44% para mulheres e 45-50% para homens) e/ou plaquetopenia entre 50-100.000/mm3e/ou leucopenia <1.000 células/mm3: o tratamento também poderá ser ambulatorial, mas deverá ser feita hidratação oral vigorosa, com 80ml/Kg/dia, esse paciente deverá retornar para reavaliação clínico-laboratorial em 24 horas, ou antes, se surgirem sinais de alarme e, nesse retorno, deverá ser reestudado
Grupo C: Casos suspeitos de dengue com presença de algum sinal de alarme, podendo as manifestações hemorrágicas estar presentes ou ausentes. Nesse grupo é obrigatório não apenas a coleta de hemograma como também de tipagem sanguínea, dosagem de albumina sérica, radiografia de tórax. Deve se realizar Hidratação endovenosa deve ser imediatamente iniciada, com 25ml/Kg de solução fisiológica ou ringer lactato em 4 horas. Reavaliar posteriormente. Se houver melhora clínica e laboratorial, iniciar etapa de manutenção, administrando inicialmente 25ml/Kg em8 horas e depois o mesmo volume em 12 horas. Se a resposta for inadequada, repetir a conduta inicial, o que pode ser feito por até três vezes, reavaliando ao final de cada etapa. Caso a resposta persista insatisfatória o paciente deverá ser tratado como os do grupo D
Grupo D: Casos suspeitos de dengue apresentando pressão arterial convergente, hipotensão arterial ou choque. Manifestações hemorrágicas podem estar presentes ou ausentes, para esses, Os exames laboratoriais a serem colhidos são os mesmos indicados aos pacientes do grupo C e os pacientes deverão permanecer sob cuidados médicos por no mínimo 24 horas. Deve-se iniciar hidratação parenteral com solução salina isotônica (20ml/Kg em até 20 minutos) imediatamente. Se for necessário, repetir por até três vezes. Deve ser feita reavaliação clínica a cada 15-30 minutos e colhido hematócrito após 2 horas do início do tratamento. Se houver melhora clínica (normalização da pressão arterial, do débito urinário, pulso respiração), o paciente deve ser tratado como no grupo C, sendo iniciada a etapa de manutenção da hidratação (Ministério da Saúde. Dengue, 2007).
REFÊNCIAS: 
NASCIMENTO, Deuza. Diagnóstico laboratorial da dengue no município de Belém-Pará: a atuação do Laboratório Central do Estado do Pará. 2003.
TAUIL, Pedro Luiz. Urbanização e ecologia do dengue. Cadernos de Saúde Pública, v. 17, p. S99-S102, 2001.
TAUIL, Pedro Luiz. Aspectos críticos do controle do dengue no Brasil. Cadernos de Saúde Pública, v. 18, n. 3, p. 867-871, 2002.
BARRETO, Maurício L.; TEIXEIRA, Maria Glória. Dengue no Brasil: situação epidemiológica e contribuições para uma agenda de pesquisa. Estudos avançados, v. 22, n. 64, p. 53-72, 2008.
DIAS, Larissa. Dengue: transmissão, aspectos clínicos, diagnóstico e tratamento. Medicina (Ribeirao Preto Online), v. 43, n. 2, p. 143-152, 2010.
FRANÇA, Eduardo Luzia et al. Aspectos epidemiológicos da dengue em Jaciara, Mato Grosso. Revista de Ciências Médicas, v. 20, n. 5/6, p. 121-126, 2012.
Organização Mundial de Saúde. Dengue Hemorrágica: diagnóstico, tratamento, prevenção e controle. São Paulo: Editora Santos; 2001