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Resumo método de estudos das proteínas

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AULA 5 – TÉCNICAS DE ESTUDO DAS PROTEÍNAS
1)INTRODUÇÃO
Antes as análises de proteínas eram feitas mediante amostras biológicas BRUTAS
Haviam procedimentos laboratoriais feitos para retirar ao máximo os CONTAMINANTES das amostras 
DIÁLISE, PRECIPTAÇÃO...
2)COLUNA CROMATOGRÁFICA
Diferenças de CARGA, TAMANHO, AFINIDADE...
Um dos métodos MAIS EFICIENTES para a PURIFICAÇÃO na época
1°Utiliza-se uma COLUNA com um SÓLIDO no interior capaz de REAGIR com a BIOMOLÉCULA de INTERESSE
OBS* Quanto MAIOR a necessidade de se PURIFICAR = MENOR é a qtde FINAL de PROTEÍNAS DISPONÍVEIS
a)CROMATOGRAFIA GEL FILTRAÇÃO / EXCLUSÃO por TAMANHO
-A matriz sólida é constituída por MINÚSCULAS ESFERAS POROSAS
· Os POROS têm tamanhos PRÓXIMOS aos das PROTEÍNAS
· Quando se coloca as proteínas no tubo as MENORES entram nos POROS respectivos
· MENORES demoram MAIS tempo para chegar ao FUNDO por passarem pelos poros
· MAIORES chegam MAIS RÁPIDO ao fundo
· “SEPARAÇÃO por TEMPO”
b)CROMATOGRAFIA de TROCA IÔNICA
· MATRIZ SÓLIDA possui CARGA OPOSTA ao das PROTEÍNAS que foram inseridas
· 1°PROTEÍNAS ficam ADERIDAS à MATRIZ
· 2°Utiliza-se MUDANÇA no PH ou SAIS para bagunçar as POLARIDADES e SOLTAR as PROTEÍNAS para o RECOLHIMENTO
· Cromatografia de TROCA CATIÔNICA Matriz tem carga NEGATIVA Atrai as PROTEÍNAS com carga POSITIVA RETARDA a descida delas.
· Cromatografia de TROCA ANIÔNICA Matriz tem carga POSITIVA
c)CROMATOGRAFIA por AFINIDADE
· Liga-se COVALENTEMENTE a PROTEÍNA ALVO com a MATRIZ SÓLIDA por meio da ESTEREOESPECIFICIDADE 
· 1°Quando as proteínas-alvo entram elas vão reagir ESPECIFICAMENTE com seus ESTEREOESPECÍFICOS
· 2°Separação é feita utilizando mudança de PH ou adição de um ESTEREOESPECÍFICO maior que o da MATRIZ
· Qualquer proteína com AFINIDADE ao ligante vai ser RETARDADA
· Ex: Função biológica da proteína se relaciona com a LIGAÇÃO com ATP Coloca-se uma molécula SEMELHANTE ao ATP
3)IDENTIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS EM AMOSTRAS
Depois da SEPARAÇÃO não se tem ideia de qual proteína está em cada tubo
a)PRINCÍPIO DA ABSORBÂNCIA
1°Emite-se LUZ no recipiente Dependendo do CROMPRIMENTO de onda que for ABSORVIDO consegue-se saber a presença no interior do tubo
OBS* PROTEÍNAS 280nm = Esse comprimento é absorvido por aminoácidos de TRIPTOFANO e TIROSINA
b)PRINCÍPIO DA ELETROFORESE
· 1°Aplica-se frações das AMOSTRAS PURIFICADAS em um GEL POLIMÉRICO
· 2°Aplica-se um CAMPO ELÉTRICO nas EXTREMIDADES DO GEL
· 3°Proteínas com CARGAS DISTINTAS percorrem o GEL
· 4°PROTEÍNAS com MENORES CARGAS/MAIORES MASSAS percorrem o gel MAIS DEVAGAR
· PROTEÍNAS com MAIORES CARGAS/MENORES MASSAS percorrem o gel MAIS RÁPIDO e chegam ANTES na OUTRA EXTREMIDADE
· 5°DESLIGA-SE o CAMPO ELÉTRICO e se coloca CORANTES nas amostras 
c)PROTOCOLOS DESNATURANTES
· Conseguem DESNATURAR as PROTEÍNAS e fazer com que elas tenham a MESMA RAZÃO MASSA/CARGA
· Experimento passa a se basear, exclusivamente, na MASSA
· Usa-se o DODECIL SULFATO DE SÓDIO (SDS) QTDE de DODECIL absorvido pela PROTEÍNA é cerca de 1,4x sua MASSA
· Separação é feito com base no TAMANHO MOLECULAR dos constituintes
4)FOCALIZAÇÃO ISOELÉTRICA
Baseia-se no princípio isoelétrico dos aminoácidos Carga do aminoácido é DIFERENTE para CADA PH
· 1°Utiliza-se um TUBO em que a MATRIZ varia o PH com a ALTURA
· 2°Ao entrar em contato com o GEL as proteínas adquirirão CARGA
· 3°Supõe-se que a carga seja NEGATIVA Ao criar um CAMPO ELÉTRICO na MATRIZ as PROTEÍNAS MIGRARÃO para o POLO DE CARGA POSITIVA (polo inverso)
· 4°Chegará um momento em que as PROTEÍNAS chegarão em uma altura que o PH é igual ao seu PONTO ISOELÉTRICO Proteína com carga NULA deixará de se MOVIMENTAR
· 5°Corta-se a matriz sólida e separa-se as diferentes proteínas
5)Combinação entre ELETROFORESE e FOCALIZAÇÃO (ELETROFORESE BIDMENSIONAL)
ISOELÉTRICA GEL BIDIMENSIONAL
· Permite separar com base no PONTO ISOELÉTRICO e na MASSA
· Probabilidade de se ter PROTEÍNAS com o MESMO PONTO ISOELÉTRICO e MASSA é muito baixa Permite uma MAIOR PRECISÃO
6)DEGRADAÇÃO DE EDIMAN
Separação de cima NÃO permitiria identificar a SEQUÊNCIA dos aminoácidos ORDEM só pode ser vista com a SEPARÇÃO, PURIFICAÇÃO e IDENTIFICAÇÃO dos AMINOÁCIDOS das EXTREMIDADES da CADEIA POLIPEPTÍDICA
· Permite identificar, senão TODOS OS AMINOÁCIDOS, aqueles que estão na PORÇÃO AMINOTERMINAL da CADEIA PEPTÍDICA
· 1°REAGE a EXTREMIDADE AMINO-TERMINAL com uma molécula conhecida de CARGA OPOSTO a AM.-TE.
· 2°MOLÉCULA conhecida vai se CONECTAR a cadeia
· 3°CLIVA-SE a LIGAÇÃO PEPTÍDICA do AMINOTERMINAL retirando-o CLIVAÇÃO é FEITA na LIGAÇÃO PEPTÍDICA certa por meio de CONDÇÕES ÁCIDAS ESPECÍFICAS
· Obs 1* Esse processo é muito bom PORQUE PERMITE separar e identificar EXATOS AMINOÁCIDOS que estão sendo RETIRADOS da EXTREMIDADE AMINO-TERMINAL
· Obs 2*Apesar de ser BOM esse processo é TRABALHOSO Precisa-se desfazer MODIFICAÇÕES PÓS-TRADUCIONAIS, voltar a proteína para sua ESTRUTURA PRIMÁRIA...
7)ESPECTROMETRIA DE MASSA e SEQUENCIAMENTO
· 1°SEPARAÇÃO e DEGRADAÇÃO de proteínas em PEPTÍDEOS MENORES
· 2°IONIZAÇÃO dos PEPTÍDEOS por PROCESSOS FÍSICO-QUÍMICOS
· 3°Quebra por COLISÃO com GASES INERTES
· 4°Identificação das MASSAS MOLARES dos FRAGMENTOS
· 5°Reconstrução da SEQUÊNCIA da molécula ao JUNTAR os FRAGMENTOS
· 6°Identifica as moléculas pela “ASSINATURA de MASSA”
8)SÍNTESE IN VITRO DE PEPTÍDEOS
· 1°Fixação do resíduo carboxi-terminal a um SUPORTE (POLÍMERO INSOLÚVEL)
· 2°Reação de DESPROTEÇÃO do RESÍDUO de AMINOÁCIDO
· 3°Reação de ACOPLAMENTO de NOVOS RESÍDUOS protegidos ao GRUPO AMINO-TERMINAL DESPROTEGIDO
· 4°Repetição das etapas
· 5°Reação para LIBERAÇÃO DO POLIPEPTÍDEO
· Problemas:
· ENOVELAMENTO in vitro, muitas vezes, não é FIELMENTE alcançado, como in vivo
· Baixa eficácia pode gerar RESÍDUOS
9)SÍNTESE IN VIVO de PEPTÍDEOS e de PROTEÍNAS
Processo BIOQUÍMICO
· 1°Seleção de um GENE ESPECÍFICO Associado ao ALVO PROTEICO de interesse
· 2°Inserção do GENE DE INTERESSE em um ORGANISMO PRODUTOR
· 3°Cultivo do ORGANISMO PRODUTOR induzindo a TRADUÇÃO do GENE DE INTERESSE
· EX: INSULINA HUMANA
· CETUXIMAB Tratamento de CÂNCER
· NATALIZUMAB Tratamento ESCLEROSE MÚLTIPLA