ok controle prat 13.10.11

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Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
13/10/2011 - Prática
Prova: Bacillus cereus ; Clostridium perfringens ; Coliformes ; Vibrium parahaemolítico
Vamos finalizar a parte de clostridium, ficaram faltando 2 provas bioquímicas
E finalizar coliformes que foi metade da aula de reposição
Depois vamos ver a parte de vibrium.
Clostridium perfringens
Quanto ao Clostridium perfreingens ficaram faltando pra vcs as últimas 2 provas bioquímicas:
A penúltima prova que vamos fazer para verificar se era ou não a espécie clostridium perfringens é a prova da coagulação do leite.
Prova da coagulação do leite
Essa prova vai verificar a capacidade do MO produzir a enzima caseinase degradando a caseína do leite.
O objetivo dessa prova é verificar a capacidade do MO produzir a enzima caseinase, degradando a caseína.
Vamos utilizar o leite desnatado como meio de cultura. 
Vou semear colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado (que vimos na ultima aula, para restabelecer o potencial LOG) e pego de 3-5 colônias e vou semear no meio desnatado. Vamos encubar a 35-37°C.
Vou semear no leite desnatado e vou encubar a 35-37°C durante 24-48 horas
O Clostridium perfringens ele é produtor da enzima caseinase
Então ao retirar da estufa o que vou observar: vou observar que como houve a produção da enzima caseinase, a caseína foi degradada e com isso o leite desnatado que foi utilizado como meio de cultura vai estar coagulado.
Ao retirar da estufa eu vou verificar o leite coagulado. Isso significa que a prova é +.
Se o leite continuar no seu estado normal após a incubação significa que eu não tenho um MO produtor de caseínase.
No caso do C. perfringens ele deve ser positivo para essa prova.
Última prova:
Prova da fermentação da glicose e da lactose
Essa prova vai ser realizada utilizando-se o meio de cultura cistina triptose Agar. 
Esse meio de cultura vai possuir a cistina que vai ser essencial para o crescimento do MO.
Porque: A cistina reduz o O2 presente do meio. E o C. perfringens só vai fermentar os açúcares formando a glicose e lactose se o meio de cultura tiver baixas concentrações de O2. Então se eu não tiver cistina no meio o Clostridium não ia conseguir crescer. 
A função da cistina é essa, reduz o O2 presente do meio.
Vou trabalhar com 2 meios de cultura contendo o meio cistina triptose Agar. 
Em um tubo será adicionado além do meio de cultura a glicose. E no outro tubo vai ser adicionado a lactose.
Vou semear colônias que cresceram no Agar nutriente nesses 2 tubos e vou encubar. 
Encubei a 35-37°c durante 24-48horas. 
Após a incubação eu posso ter a prova positiva ou negativa para a fermentação. 
Como vou observar:
Dentro do tubo de ensaio também vai ter o indicador de pH vermelho de fenol.
Caso ocorra a fermentação da glicose produzindo ácido, e a fermentação da lactose produzindo ácido, o que vai acontecer: O meio vai ficar amarelo, caracterizando a prova positiva para fermentação da glicose e da lactose. Porque o vermelho de fenol em pH ácido vai dar essa coloração amarela. Como houve a fermentação da glicose e da lactose produzindo ácido, o pH desse meio vai estar amarelo.
(CTA + glicose)
(CTA + lactose)
Caso a prova seja negativo eu vou observar o meio de cultura com a coloração vermelha.
O C. perfringens é fermentador tanto da glicose quanto da lactose.
Então nesse momento eu posso falar que estou trabalhando com o C. perfringens porque eu já fiz toda a seriação bioquímica.
(Fim C. perfringens --//--)
Coliformes
Falamos das cepas patogênicas, do teste presuntivo e do teste confirmativo
Vamos trabalhar com a colimetria que é um método quantitativo de número mais provável. 
O que é isso:
Trabalho com tubos contendo caldos, como é caldo, é liquido, eu não consigo quantificar. Então eu trabalho com tabela através no numero de positivos eu vou obter o valor de um possível MO naquela amostra.
Vimos o teste presuntivo que tem como objetivo verificar a presença de um MO fermentador da lactose. E depois do teste presuntivo nós passamos para o teste confirmativo.
(Foto) Tubo contendo turvação e o tubinho pequeno dentro com gás: Nesse momento eu sei que existe um MO fermentador da lactose na minha amostra, porem eu não posso confirmar que é um coliforme.
Vou passar para a etapa do teste confirmativo, que vai ser a etapa que vai me confirmar se estou trabalhando com coliforme total e/ou coliforme termotolerante. Porque todo coliforme termotolerante é um coliforme total, porém nem todo coliforme total é um coliforme termotolerante.
Os tubos que foram positivos no teste presuntivo serão semeados em 2 tubos: 
- um tudo contendo o caldo VBBL, e;
- um tubo contendo EC
O caldo VBBL vai nos indicar a presença de coliforme total. 
E o caldo EC vai nos indicar a presença de coliformes termotolerantes.
Depois que encubei esses tubos eu vou poder ter diferentes resultados. Dependendo desses resultados eu vou continuar ou não minha análise.
Porque se eu tiver positividade no caldo VBBL e negatividade no caldo EC, significa que eu só tenho coliformes a 35°C, ou seja, eu só tenho coliformes totais, porque só o VBBL foi positivo.
Se eu tiver o VBBL e o caldo EC +, significa que eu tenho coliformes a 35°C e a 45°C, porque os 2 me confirmaram a presença do coliforme termotolerante. Se eu tenho coliforme termotolerante eu tenho coliforme total. Porque todo coliforme termotolerante é coliforme total.
Se tiver negativo nas 2 provas, não é coliformes, é ausência de coliformes.
Se for caldo negativo no VBBL e no positivo no EC, também eu vou ter ausência de coliformes. Porque é impossível eu ter um coliforme termotolerante sem ter coliforme total. É outro MO que cresceu nesse caso.
Tanto o positivo no caldo VBBL quanto no caldo EC, eu vou fazer o teste completo. 
O que vou fazer: vou pegar todos os tubos positivos no caldo EC e vou plaquear. Porque: porque eu preciso ter colônias isoladas para poder realizar as provas bioquímicas. Eu não tenho como realizar as provas bioquímicas a partir de um caldo.
O que vou fazer: Vou semear em superfície 0,1ml dos tubos positivos de caldo EC no meio de Levine. Semeei no meio de Levine, esse meio é rico em lactose, em azul de metileno e em eosina amarela. 
Só os tubos positivos de caldo EC, vou semear no meio de Levine. Vou incubar essa placa durante 48 horas a 35-37ºC.
Após essa incubação eu vou observar colônias escuras e com brilho verde metálico. Essas colônias são as colônias características dos coliformes termotolerantes. Já é esperado, porque se deu positivo no caldo EC e no caldo VBBL eu sei que é um coliforme termotolerante, a colônia tem que dar essa coloração. Se não crescer colônias características, houve algum erro no teste que eu fiz anteriormente.
Alem dessas colônias eu posso ter crescimento de outros coliformes que vão ter características mucóides, as colônias serão mucóides e sem brilho metálico.
Então as colônias mucoides sem brilho metálico que venham a ter crescido no meio Agar Levine são colônias que não são características de termotolerante.
(Foto) Todas essas colônias verdes são justamente os coliformes termotolerantes. Os que não são verdes, são coliformes totais, mas não são termotolerantes.
A partir das colônias que cresceram nesse Agar Levine, é que vou realizar as provas bioquímicas.
Eu já sei que tem coliforme termotolerante. Porém 2 coliformes termotolerantes, o que mais tem maior importância pra gente é a e.coli
Toda vez que a e.coli estiver presente no alimento, vai significar que essa contaminação foi oriunda do TGI, ou seja, teve origem fecal porque ela só é encontrada no TGI.
Enquanto que nos outros grupos pertencentes aos coliformes termotolerante eles podem ser encontrados tanto no solo, vegetais quanto no TGI. 
A nível de microbiologia de alimento, a mais importante é a e.coli
A e.coli vai ser uma bactéria muito importante, existem diversas cepas que vão ter ação diferente no nosso organismo.
Uma cepa muito importante é a e.coli enterohemorrágica (O157 H7) doença do hambúrguer
a partir dessas colôniascaracterísticas eu vou realizar as provas bioquímicas
As provas bioquímicas que vamos falar agora vai ser para fazer a identificação da espécie e.coli.
Essas provas bioquímicas são chamadas de provas do IMVIC: 
Toda vez que vcs lerem em algum lugar que foram realizadas as provas do IMVIC, significa que foram realizadas as provas bioquímicas para a e.coli.
Vão ser realizados: prova do indol, prova do vermelho de metila, prova do VP e a prova do citrato
As 2 provas que são diferentes do que vimos até agora é a prova do vermelho de metila e a prova do citrato. 
A prova do indol e prova do VP já vimos em outros MO. É a mesma coisa
Prova do Indol
Vou semear colônias que cresceram com as características de colônia verde com brilho metálico no caldo triptonado. Vou incubar a 35-37ºc durante 48 horas. Após essa incubação eu vou pingar o reagente de kovacs.
	Se a prova for positiva, vai haver formação de um halo vermelho na superfície do tubo.
Se a prova for negativo: vai formar um halo amarelo
A prova do indol tem como objetivo de verificar a capacidade do MO degradar o triptofano através da enzima triptofanase gerando o indol.
Então a formação do anel vermelho é característica do triptofano gerando o indol.
Depois da prova de indol, vamos partir para a prova do vermelho de metila
Prova do vermelho de metila
A prova do vermelho de metila será realizado no caldo MR-VP.
Vou semear colônias características que cresceram no Agar Levine no caldo MR-VP. Vou incubar a 35-37ºC durante 24-48 horas
Qual é o objetivo dessa prova: é verificar a capacidade do MO degradar a glicose gerando ácido.
Após a incubação eu vou olhar o que aconteceu no tubo. Nesse caldo MR-VP vai ser adicionado também o vermelho de metila a 0,02% que vai ser o indicador de pH que vai nos ajudar a verificar se houve ou não a degradação da glicose.
O vermelho de metila em pH ácido vai apresentar coloração vermelha e no pH neutro vai apresentar a coloração amarela.
- pH acido: vermelho
- pH neutro: amarelo
O que vai acontecer: ao tirar da estufa, se meu MO foi capaz de degradar a glicose gerando ácido, o meu meio de cultura vai adquirir a coloração vermelha.
Se não houver a degradação da glicose, o que vou ver: vou verificar que o tubo ficou amarelo.
Se o tubo tiver ficado vermelho: degradação da glicose produzindo ácido
Tubo amarelo: significa que a glicose não foi degradado e não houve a formação de radicais ácidos
Essa prova é realizada com a finalidade de verificar a capacidade do MO de degradar a glicose gerando radicais ácidos.
Prova do VP:
Já vimos. Vai ser realizada no mesmo caldo, caldo MR-VP. Porem a diferença é que em uma tem o vermelho de metila e aqui não tem o vermelho de metila a 0,02%.
Vou semear as colônias que cresceram no Agar Levine no caldo MR-VP. Vou incubar a 35-37°C durante 24-48 horas.
Após a incubação eu vou pingar 2 reagentes que são: o alfa naftol e o hidróxido de potássio.
Essa prova tem o objetivo diferente da prova do vermelho de metila: porque a prova do VP tem como objetivo verificar se o MO tem a capacidade de degradar a glicose produzindo acetil metil carbinol.
Então ao retirar da estufa eu vou pingar o alfa naftol e o hidróxido de potássio. Essas substâncias só vão reagir com o acetil metil carbinol. Então se tiver ocorrido a degradado da glicose em acetil metil carbinol, a substancia acetil metil carbinol vai reagir com o alfa naftol e com o hidróxido de potássio formando a coloração vermelha. Nesse caso a prova é positiva.
Caso o MO em questão não seja capaz de degradar a glicose gerando o acetil metil carbinol, após a incubação vou ter meu meio de cultura com a glicose, e a glicose não vai reagir com o alfa naftol e nem com o hidróxido de potássio, então a coloração vai ficar amarelo. Então vai ser prova negativa.
A diferença da prova do VM para a prova do VP é justamente que em uma eu tenho o vermelho de metila e na outra vou pingar os 2 reagentes (alfa naftol e o hidróxido de potássio). Sendo que uma prova vai avaliar se houve a produção do acetil metil carbinol (que é o caso do VP) ou se vai gerar radicais ácidos.
Prova do citrato
Vai ter como objetivo verificar a capacidade do MO de degradar o citrato utilizando esse citrato como única fonte de carbono. 
Será utilizado um meio de cultura chamado de “Citrato de Simmons”, onde vou semear colônias características que cresceram nesse meio de Levine no Citrato de Simmons. 
Vou incubar a 35-37ºC a 24-48 horas.
Após a incubação posso verificar 2 cores diferentes no meu tubo: a cor verde ou a cor azul.
Essa variação de cor vai se dar porque no Citrato de Simmons eu tenho o indicador de pH que é o azul de bromotimol.
Quando o citrato é utilizado como substrato vai ocorrer a produção de radicais alcalinos. O indicador de pH azul de bromotimol em pH alcalino ele vai dar essa coloração azul ao meio. E em pH neutro, a coloração verde.
O que vai acontecer: ao retirar da estufa, se o MO em questão tiver utilizado o citrato como fonte de carbono, o meu meio de cultura vai estar azul porque ele degradou o citrato gerando radicais alcalinos. No momento que ele gera os radicais alcalinos o meu indicador de pH vai mudar de cor ficando azul.
Então o tubo azul após a incubação na prova do citrato vai significar que o citrato foi utilizado como fonte de carbono gerando radicais alcalinos, então o tubo azul é a prova positiva
Nesse momento terminam as provas bioquímicas relacionada à e.coli.
Para ser e.coli, pode ter dado 2 resultados diferentes:
A e.coli pode ser indol positiva ou negativa, sempre vai ser VM positiva e VP e citrato negativas.
- Ou seja, ela pode ser positiva ou negativa para o indol
- Ela sempre vai ser positiva para o vermelho de metila
- Sempre vai ser negativa para a prova do VP e para o citrato
(Ser negativa na prova do citrato vai significar que aquele MO, porque a e.coli não consegue utilizar o citrato como fonte de carbono)
Dessa parte de coliformes, a parte de cepa é muito importante, e o objetivo de cada etapa é muito importante.
(Fim coliformes --//--)
Vibrio parahaemolyticus
É um Bacilo Gram -, não produtor de esporo. 
Não ser produtor de esporo é bom para nós consumidores porque a produção de esporo é uma característica de resistência. Então não ser produtor de esporo é uma característica muito boa para nós. 
Eles são extremamente sensíveis ao tratamento térmico. 
São mesófilos, possuindo como temperatura ótima de crescimento a temperatura de 35-37ºC. Podendo apresentar crescimento numa faixa que varia de 15 a 44°C, porem a temperatura ótima é de 35-37°C.
São anaeróbios facultativos. Então o fato de eu embalar um alimento a vácuo não vai evitar a sua multiplicação justamente porque se é um anaeróbio facultativo eles conseguem sobreviver a falta de O2. Ser anaeróbio facultativo é uma forma do MO sobreviver a condições adversas.
O pH ótimo de crescimento é o pH que varia de 7,5 a 8,5, é um pH extremamente alcalino.
São MO halofílicos, ou seja, necessitam da presença de sal para poder crescer. O Vibrio parahaemolyticus é muito chato quanto a isso, se não tiver sal ele não cresce.
Portanto todo meio de cultura que eu for utilizar para verificar a presença do vibrio eu preciso adicionar o NaCl (cloreto de sódio).
Por ele ser halofílico, ele vai estar relacionado com o consumo de produtos que sejam salgados, que tenham um teor alcalino mais alto.
Como eles são sensíveis ao tratamento térmico, significa que vai estar relacionado à ingestão de alimento salgado e cru ou mal cozido, porque ele é sensível ao tratamento térmico. 
O que acontece: Nem todas as cepas de Vibrio parahaemolyticus são patogênicas. Somente as cepas que produzem hemolisinas são as cepas patogênicas ao homem.
O que vai acontecer:
Vou ingerir o alimento contaminado com o MO. Então é um MO tipo infecção. O MO vai aderir e se multiplicar na mucosa intestinal provocando uma reação inflamatória. 
No momento da multiplicação vai ser o momento que a cepa vai produzir as hemolisinas que serão responsáveis pela manifestação dos sintomas
Os sintomas decorrentesde uma infecção gastrointestinal pelo vibrio não existe nenhum sintoma que seja patognomônico do vibrio, são sintomas comuns a qualquer tipo de intoxicação alimentar, é diarréia, vômito. Não tem nada diferente que possa fazer com que o medico veterinário chega ao diagnóstico que foi o vibrio que causou.
Uma coisa importante: Ele possui o tempo de geração extremamente curto, de 8 minutos. O tempo de geração curto vai fazer com que a dose infectante seja atingida muito rapidamente.
Uma coisa importante é que pelo Codex alimentarus, o Vibrio parahaemolyticus não é considerado um MO emergente.
O que é um MO emergente: é aquele MO que ele é conhecido, mas antigamente ele não provocava surtos. Sabia-se a existência do MO, porem ele não era responsável por surtos.
Pelo Codex alimentarus, o Vibrio parahaemolyticus não é um MO emergente. 
Porém para o ministério da saúde, aqui no país, o Vibrio parahaemolyticus é considerado um MO emergente. 
Porque a nível nacional é considerado um MO emergente? Nos últimos anos houve um aumento exacerbado do consumo de comida japonesa, que é basicamente peixe cru. É proveniente geralmente de água salina, que é o ambiente do vibrio, não sofre nenhum tratamento térmico porque é cru. 
E com a proliferação da comida japonesa no país,os surtos provocados pelo Vibrio parahaemolyticus aumentaram muito. 
Por isso que o ministério da saúde classifica como um MO emergente, porque era um MO que no passado não provocava surtos em numero consideráveis. Com o passar do tempo por mudança de hábito alimentar da população passou a ser um MO emergente.
Toda vez que nós pensarmos em comida japonesa vamos lembrar do vibrio.
Quando nós pensarmos no vibrio temos que lembrar que eles crescem em alimentos salgados e que principalmente a comida japonesa vai estar incriminada.
Alem disso vcs precisam se lembrar também que nem todo vibrio é patogênico. Só vai ser patogênico a cepa que produzir hemolisina.
Sintomas provocados vão ser os sintomas clássicos provocados por infecções intestinais.
Como vou fazer a contagem, identificação e o isolamento desse MO:
Vou receber a minha amostra, vou homogeneizar e vou fazer as diluições. A primeira etapa vai ser muito parecida com os coliformes porque é um teste presuntivo.
E eu vou trabalhar também com a tabela do numero mais provável, só que a diferença é que vai ser o numero mais provável para vibrio.
Então o que vamos fazer: Vamos receber a amostra, vamos homogeneizar.
Vamos proceder as diluições: (igual coliformes)
Ou 3 series de 3 tubos; 
Ou 5 series de 5 tubos. 
(série = diluição)
Eu vou inocular a minha diluição num meio de cultura chamado de caldo GSTB. 
O caldo GSTB é um meio de cultura rico em glicose que vai ser o substrato em cloreto de sódio (que é o sal) com o Teepol que é um inibidor de gram +.
Alem disso, nesse meio de cultura eu vou ter um indicador de pH que é o violeta de metila.
Nessa etapa é um teste presuntivo, então isso vai apenas presumir se existe o gênero vibrio ali ou não. 
Nessa etapa eu vou ver se existe um MO capaz de degradar a glicose (substrato que tem nesse meio), gerando ácido.
(incubação por 35-37°c durante 24-48horas)
Após retirar esse tubo da incubação, para o tubo ser considerado positivo eu vou verificar a coloração amarela.
 
Nesse momento eu vou anotar quais foram os tubos positivos e vou olhar na tabela o numero mais provável.
Os tubos que foram positivos significa que eu tenho um MO Gram – fermentador de glicose. Eu não posso afirmar ainda que é o gênero vibrio. Porque existem diversos outros MO Gram negativos (-) com essa característica de fermentar a glicose. 
O que vou fazer:
Vou retirar os tubos positivos da estufa, e os tubos positivos do caldo GSTB, ou seja, do teste presuntivo, serão encaminhados para a série confirmativa.
A série confirmativa vai ser a série que vai me confirmar que estou trabalhando com o gênero vibrio.
Essa serie confirmativa vai ser feita em 2 etapas:
- Meio utilizando o Agar TCBS
- Meio Agar utilizando TSI
Essa serie confirmativa vai ser feita em 2 etapas, uma etapa utilizando o Agar TCBS e uma etapa utilizando o Agar TSI.
Os tubos que foram positivos no caldo GSTB serão semeados no Agar TCBS. Vão ser encubados a 35-37°c por 24-48 horas.
Esse Agar é rico em tiosulfato de sódio, citrato e sacarose, que são substratos.
Também vai ter sais biliares que são inibidores. E o indicador de pH azul de bromotimol.
O que vai acontecer:
Após a incubação, se houver a possível presença do gênero vibrio, o vibrio só é capaz de utilizar o citrato como substrato. Então ele vai utilizar o citrato gerando radicais alcalinos. Vão formar colônias azuladas. Essas colônias azuladas são indicativas do gênero vibrio. 
Só usou o citrato e isso é uma característica do gênero vibrio.
Só que eu ainda não posso afirmar que é o gênero vibrio. Para eu afirmar que é do gênero vibrio eu preciso fazer a 2ª etapa da serie confirmativa.
Vou pegar as colônias azuladas e vou semear no Agar TSI por picada. 
Como é feito: Vou ter um tubo com um meio de cultura TSI, e com a alça de platina vou pegar as colônias azuladas que cresceram no meio TCBS e vou semear primeiro na superfície, depois vou furar o meio de cultura com a alça de platina e vou até o fundo semeando as colônias.
Porque isso: esse Agar TSI é rico em peptona e em glicose que são substratos. E também vai ter o indicador de pH que é o vermelho de fenol.
A peptona e a glicose são utilizadas como substrato para o vibrio, porém com uma ressalva:
Em condições de aerobiose, ou seja na superfície do meio, o vibrio tem a capacidade de utilizar a peptona. Somente em aerobiose, ou seja, na presença de O2.
Utilizando a peptona vai originar radicais alcalinos e vai formar nessa superfície do meio uma coloração púrpura (roxa).
Em condições de anaerobiose, ou seja, de ausência de O2, o gênero vibrio (não sei ainda que é da espécie Vibrio parahaemolyticus) ele é capaz de degradar a glicose gerando ácido e com isso no fundo do tubo eu vou ter a coloração amarela. 
Para eu afirmar que estou trabalhando com o gênero vibrio, o que eu preciso ter:
Eu preciso ter a formação de colônias azuladas no Agar TCBS e um tubo com a coloração púrpura na superfície e coloração amarela na base, no fundo do tubo.
Nesse momento eu posso afirmar que estou trabalhando com o gênero vibrio.
Agora que eu sei que estou trabalhando com o gênero vibrio eu vou partir para as provas bioquímicas.
 
Provas bioquímicas:
As 2 primeiras provas: prova da motilidade e a prova do VP. São provas iguais de semana passada, sendo que:
O vibrio é móvel, então ele é motilidade +. 
É produtor de indol, então na prova do indol vai ser +. 
É sulfito – ou seja, não tem a capacidade de reduzir o sulfito em sulfeto. 
Prova do VP: o Vibrio parahaemolyticus é negativo, ou seja, ele não é capaz de degradar a glicose produzindo acetil metil carbinol.
Então essas 2 provas são iguais as provas anteriores, o que vai mudar é o resultado do MO que estou trabalhando. São feitas da mesma forma.
lem dessas 2 provas que agente já conhece, vamos fazer a prova da oxidade e a prova da resistência.
Prova da Oxidase:
Na prova da oxidase eu vou verificar a produção da enzima oxidase. 
O vibrio é produtor de oxidase, então nessa prova ele tem que ser positivo para eu falar que estou trabalhando com Vibrio parahaemolyticus.
Quando estou fazendo a prova bioquímica, já é direcionada para a espécie que eu quero pesquisar, que nesse caso é o Vibrio parahaemolyticus. Toda prova bioquímica é feita para identificar a espécie, se eu não quiser verificar a espécie e só verificar o gênero não tem porque fazer a prova bioquímica.
Vou pegar uma placa de petri vazia e vou colocar um papel de filtro. Vou esfregar colônias azuladas que cresceram no GSTB. Antes de esfregar essas colônias eu preciso pegar essas colônias e colocar no outro meio que é o meio de triagem. Nesse momento que eu coloco no meio de triagem vai funcionar como o restabelecimento da fase log, que é a etapa que sempre vamos fazer antes de fazer a prova bioquímica.Só que nos outros MO que nós estudamos, nós utilizávamos ou o caldo BHI ou o Agar nutriente, e nesse caso não vou precisar, eu posso pegar as colônias que já cresceram no meio de triagem.
As provas bioquímicas relacionadas ao Vibrio parahaemolyticus serão feitas a partir das colônias que cresceram no meio TSI, que é um meio de triagem.
Vou pegar essas colônias e vou esfregar no papel de filtro. A 5cm mais ou menos do esfregaço, vou pingar um reagente. 
Se nesse intervalo de 5cm entre o local do reagente e o esfregaço das colônias houver formação de coloração púrpura em menos de 1 minuto significa que a prova é positiva.
Então para caracterizar a prova da oxidase como positiva eu vou utilizar as colônias que cresceram no meio TSI, vou fazer um esfregaço no papel de filtro. A 5cm do local que esfreguei vou pingar o reagente e se em menos de 1 minuto formar a coloração púrpura no local entre o reagente e o esfregaço, significa que a prova é positiva.
Prova de resistência
Essa prova vai avaliar a capacidade dos MO crescerem em diferentes concentrações salinas e à uma temperatura a 42°C.
Vou trabalhar com 4 tubos. Todos eles vão ter caldo peptonado.
Vamos trabalhar com 4 tubos porque vou avaliar com 3 concentrações salinas diferentes e vou avaliar uma temperatura diferente, que é a temperatura de 42°C. Em todos os tubos eu vou ter o mesmo meio de cultura, que é o caldo peptonado (que é rico em peptona).
Alem disso, no caldo peptonado eu vou ter o indicador de pH que é o violeta de metila.
O que vamos fazer:
- Em um tubo eu vou adicionar 6% de concentração salina
- Em outro tubo eu vou adicionar 8%
- No 3º tubo eu vou adicionar 10% de sal
- No 4º tubo não vou adicionar nenhuma concentração de sal, apenas o sal necessário no meio de cultura (que todos vão ter)
O que vou fazer: Vou incubar os 3 tubos com diferentes concentrações salinas a 35-37°c durante 24-48 horas. E vou incubar esse tubo onde só tem caldo peptonado à 42°c.
O que vamos observar: como tem peptona nesse meio de cultura, se houver o consumo de peptona vai haver produção de radicais alcalinos com isso o meio de cultura vai ficar púrpura. 
Então se houver consumo de peptona, vai gerar radicais alcalinos, dando uma cor púrpura.
Ao retirar da estufa, esses 3 primeiros tubos. O que eu tenho que observar para classificar como Vibrio parahaemolyticus:
O tubo com a concentração de sal a 6% deve ser positivo, ou seja, deve estar púrpura;
O tubo com a concentração de sal a 8% deve ser positivo, então também vai estar púrpura;
O tubo a 10%, para ser Vibrio parahaemolyticus deve ser negativo. O Vibrio parahaemolyticus não possui a capacidade de se multiplicar em condições salinas de 10%. Então vai estar amarelo.
O tubo que for encubado a 42°c precisa estar púrpura porque o vibrio tem a capacidade de crescer a essa temperatura.
Nesse momento eu sei que a minha amostra estava contaminada com o Vibrio parahaemolyticus.