Bromatologia e Análise Bromatológica - Fibras Alimentares

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DETERMINAÇÃO DE FIBRA ALIMENTAR
DEFINIÇÕES
FIBRA ALIMENTAR - carboidratos resistentes à digestão e absorção no intestino delgado humano,
passam inatingidas, e sofrem fermentação completa ou parcial no intestino grosso
FIBRA ALIMENTAR TOTAL - composta de fibra alimentar solúvel + fibra alimentar insolúvel
Diferença da solubilidade da fibra alimentar promove os diferentes efeitos fisiológicos que são
benéficos à nossa saúde
SOLÚVEL: maior possibilidade de ser fermentada pelas bacterias da microbiota intestinal, produtos da
fermentação destas fibras pela microbiota auxiliam em aspectos de saúde
(ex.: redução do colesterol - ácidos graxos de cadeia curta, absorção até o fígado, inibição de
enzimas da síntese do colesterol)
INSOLÚVEL: aumento da viscosidade do bolo fecal, auxiliando no aumento da motilidade intestinal
EXEMPLOS DE CARBOIDRATOS QUE COMPÔEM FIBRA
CONSTITUINTES EXEMPLOS
Polissacarídeos não-amido Celulose
Hemiceluloses (galactomananas, glicomananas,
arabinoxilanos, arabinogalactanos [fibra do
milho: xilose])
Gomas (extratos de sementes)
Inulina
Mucilagens (exsudatos de plantas, psyllium -
reduz a absorção do colesterol)
Polissacarídeos de algas
Pectinas
Oligossacarídeos resistentes à digestão Fruto-oligossacarídeos - hidrólise da inulina,
raizes de vegetais e tubérculos
α - Galactosídios (estaquiose, rafinose) -
encontrados na soja
Frações do amido resistentes à digestão
(considerados fibras alimentares)
Amido resistente (vários tipos, como os
modificados - impedem hidrolise por nossas
enzimas) (presentes dentro de estruturas
vegetais que não hidrolisamos)
Dextrinas indigeríveis (conformação química,
como de isomaltoses derivadas da hidrólise do
amido, não pode ser processada por nossas
maltases)
Carboidratos sintéticos (produzidos pela
indústria, não obtidos naturalmente)
Galactooligossacarídeos (a partir da
transgalactosilação da lactose - adicionando
mais unidades de galactose à lactose inicial,
prébiótico)
Polidextrose (carboidratos com vários
monômeros de glicose, união das unidades por
ligações incapazes de serem rompidas por
nossas enzimas)
Metilcelulose
Carboximetilcelulose
Hidroxipropilmetilcelulose
(também são fibras insolúveis e indigeriveis
como a celulose, mas com maior afinidade de
hidratação, gelificação, emulsificação, que a
celulose original não possui - formulações de
sorvete etc)
Substâncias associadas aos polissacarídeos não
amido e à lignina em vegetais
(em vegetais in natura, estão combinadas com
esses polissacarídeos - estão intimamente
associadas e entram quantificados como fibra:
compostos fenólicos estimulam a microbiota)
Ceras, fitatos, saponinas, taninos, compostos
fenólicos, outros
Fibras de origem animal e fúngica
(maioria é de vegetais e algas, mas algumas são
de origem de crustáceos e fungos)
Quitina, quitosana, condroitina
(quitina e quitosana - exoesqueleto de
crustáceos; condroitina - uso de biotecnologia
a partir da multiplicação de fungos)
Lignina
(vegetais in natura, folhosos - polímero de
substâncias fenólicas)
-
Solúvel
Insolúvel
ERRO DE TRADUÇÃO
Fibra alimentar é DIFERENTE de fibra dietética
Erro se dá por um falso cognato na tradução
Dietary fiber (Estados Unidos) ou dietary fibre (Reino Unido)
Dietary é falso cognato para “dietético” - parece, mas não significa dietético como no português
Dietary (inglês) - relativo à dieta normal (qualquer dieta, basicamente qualquer fibra de qualquer
alimento que se come), fibra alimentar (geralmente natural) que funciona como nutriente (seria o
nosso “fibra alimentar)
Dietético (português) - legislação: produtos especialmente formulados ou processados, em que
introduzimos modificações de conteúdo para que possua nutrientes que possam ser utilizados em
dietas diferenciadas, para atender as necessidades de pessoas em condições metabólicas ou
fisiológicas específicas (diabéticos, perda de peso, etc)
O termo “dietético” não deve ser utilizado para um nutriente que deve estar presente na
alimentação humana normal
MÉTODOS DE ANÁLISE
Na literatura, existem várias metodologias
A escolha depende da necessidade de informações em relação a seus componentes: tipo de alimento,
se já conhecemos/temos prévia informação a respeito da composição de polissacarídeos desse
alimento (a menos que não tenha sido estudado antes)
Escolha de metodologia errada - variação no resultado, em função da metodologia utilizada e do tipo
de polissacarídeo predominante na fibra alimentar
Método escolhido com base no alimento e no polissacarídeo predominante
Cuidado com metodologias ultrapassadas - aparecem em artigos ou dissertações ou teses, não aceitos
em revistas mais criteriosas (subestimam os valores de fibra reais)
MÉTODOS ULTRAPASSADOS
GRAVIMÉTRICOS - Determinam o resíduo insolúvel, após uma extração química ou enzimática e
química dos componentes que não pertencem à fração fibra
FIBRA BRUTA - fornece valores inexatos de celulose e lignina (principais presentes), subestima estes
dois carboidratos e não quantifica nenhum dos outros tipos de carboidratos da fibra
DETERGENTE ÁCIDO (ADF) - determina o somatório de celulose + lignina
DETERGENTE NEUTRO SEM ALFA AMILASE (NDF) OU COM ALFA-AMILASE (NDFM) - quantifica a
celulose + lignina + hemicelulose insolúvel (maior parte arabinoxilanos), não quantifica fibra alimentar
solúvel
Encontrados em publicações sem tanto rigor científico, não quantificam os reais componentes da
fibra alimentar
Porque ainda encontramos estes métodos sendo utilizados?
Originalmente, foram métodos para analisar forragens/rações, e por conta disso, alguns
pesquisadores adaptaram para alimentos humanos no passado
Como não determinam componentes solúveis, não correspondem à definição atual de fibra
alimentar (insolúvel + solúvel)
Métodos gravimétricos quantificam somente a insolúvel (e muitas vezes nem isso)
Solúvel é importante demais para ser ignorada
MÉTODOS ENZÍMICO-QUÍMICOS OU ENZÍMICO-GRAVIMÉTRICOS
Quantificam a fibra alimentar como hoje é definida, corretamente
ENZÍMICO-GRAVIMÉTRICOS - métodos utilizados com maior rotina, tanto na indústria como
laboratórios (para fins de rotulagem nutricional); não é preciso em determinados alimentos
ENZÍMICO-QUÍMICOS - utilizados principalmente na pesquisa, já que são complementares aos
gravimétricos - determinam as fibras que os métodos gravimétricos não conseguem quantificar
MÉTODOS ENZÍMICO-QUÍMICOS
Utilizado em situações específicas para quantificar a fibra alimentar
Permite isolar e identificar os componentes que fazem parte da fibra, de forma individual
Celulose - polímero de glicose
Hemicelulose - vários monômeros diferentes em sua composição (galactoses, manoses, xiloses, ácidos
galacturônicos, etc)
Para cada tipo de fibra alimentar, é constituída de diferentes tipos de monômeros (que são isolados e
identificados)
ETAPAS
Primeiro - quantificação da amostra
Antes da análise - desidratação e trituração da amostra em moinho ou gral
Pesagem da amostra (seca e triturada)
DIGESTÃO ENZIMÁTICA - Amostra pesada é submetida a uma série de hidrólises que simulam a
passagem pelo trato gastro-intestinal
(existe uma etapa de filtração antes da próxima, que separa a fibra insolúvel da solúvel, mesmo após
à simulação gástrica)
Após esta sequência de hidrólises, a fibra alimentar solúvel vai ser precipitada com etanol a 80%
Após a precipitação, o precipitado vai ser submetido à hidrólise ácida
HIDRÓLISE ÁCIDA - necessária para a obtenção dos monômeros livres (!) de cada polissacarídeo
DETERMINAÇÃO DOS MONÔMEROS - liberados na hidrólise ácida (açúcares neutros e ácidos urônicos)
(cromatografia e/ou espectroscopia calibrada pela cromatografia - ??)
AÇÚCARES NEUTROS - identificados por técnicas colorimétricas, cromatografia gasosa (CG) ou
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
Se forem compostos apenas destes, por técnicas cromatográficas ou colorimétricas
calibradas por técnica cromatográfica, conseguimos identificá-los (pode ser detectado por
cromatografia gasosa, mas a líquida de alta eficiência é a mais indicada - padrão ouro)
ÁCIDOSURÔNICOS - primeiramente convertidos em açúcares neutros e posterior determinação por
colorimetria CG e CLAE
Para poderem ser identificados por cromatografia, precisam ser convertidos em seus
açúcares neutros correspondentes (ex.: ácido galacturônico -> galactose)
COMPONENTES INSOLÚVEIS DA FIBRA - após a hidrólise ácida da fibra alimentar solúvel, o resíduo
insolúvel que permanece é filtrado e pesado (lignina)
Celulose - apesar de insolúvel, pode ser hidrolisada (removida na etapa anterior de filtração,
antes de precipitar a fibra solúvel em etanol)
FIBRA ALIMENTAR TOTAL
Açúcares neutros (da fibra solúvel precipitada E da celulose retida antes disso) + ácidos urônicos (da
fibra solúvel) + lignina (resíduo da hidrólise ácida)
A partir dos açúcares/ácidos urônicos detectados em cromatografia, sabemos qual a fibra
inicialmente presente no alimento, de acordo com os monômeros encontrados
(!) lembrar que o ácido sulfúrico concentrado pode gerar uma perda de monômeros por
caramelização em furfurais (não sei nesse caso)
MÉTODOS ENZÍMICO-GRAVIMÉTRICOS
Casos gerais - não precisamos do enzímico-químico
Adaptações da metodologia enzímico-gravimétrica
AOAC 985.29/AACC 32-05 (fibra alimentar total – FAT)
Publicada em 1985 para fibra alimentar total
Simula a hidrólise do alimento pelo trato gastrointestinal, com 3 ajustes de pH para cada
etapa de hidrólise
AOAC 991.43/AACC 32-07 (fibra alimentar total – FAT)
Método anterior, modificado, publicado em 1991
Mantém as 3 hidrólises do trato GI, mas com apenas 2 ajustes de pH realizados - torna a
análise mais rápida
AOAC 991.43/AACC 32-07 (fibra alimentar solúvel e insolúvel - FAS e FAI)
Fracionamento das fibras (não possível em ‘85)
Soma e obtenção de fibra alimentar total
FUNDAMENTAÇÃO: metodologias baseadas na quantificação da massa de resíduo resultante após
eliminação de amido e proteína das amostras através de hidrólise enzimática, seguida de precipitação
da fibra alimentar solúvel em etanol a 78%
Quantificação da massa do resíduo após a eliminação do amido (hidrolisado em 2 dessas
sequências de hidrólise GI simulada: etapa da amilase salivar + etapa da amilase pancreática) e a
eliminação da proteína (digestão proteica); precipitação da fibra alimentar solúvel (etanol 78%,
semelhante ao Enz-Quimico)
Gordura = ????
Esta metodologia funciona bem para alimentos com BAIXO TEOR de GORDURA (teor de
gordura na amostra seca inferior a 10%)
Alimentos com ALTO TEOR de GORDURA (>10%): desidratar e desengordurar a amostra antes
desta análise (por Soxhlet, como visto na aula anterior - amostra que fica no interior do cartucho de
papel, sem gordura, que foi extraída)
AACC - American Association of Cereal Chemistry
AOAC - antiga Association of Official Agricultural Chemists, agora AOAC International (“publishes
standardized, chemical analysis methods designed to increase confidence in the results of chemical
and microbiological analyses”)
ETAPAS
DIGESTÃO ENZIMÁTICA - Sequência de hidrólises simulando a atividade das enzimas do TGI que
atacam moléculas grandes (enzimas α-amilase [cavidade oral], protease [estômago e intestino] e
amiloglicosidase [amilase pancreática])
Após hidrólises enzimáticas, filtração e pesagem do material hidrolisado (remoção da fibra insolúvel):
PRECIPITAÇÃO - da fibra solúvel, com etanol a 78%
Todas as fibras solúveis com mais de 12 unidades monoméricas (grau de polimerização) são
precipitadas com facilidade (pectinas, hemiceluloses solúveis, β-glicanos - fibra solúvel da aveia)
Resíduo de fibra solúvel >12 precipitada também filtrado e pesado
Determinação do resíduo obtido após a precipitação
Pesagens - quantificação, determinação de cinzas do resíduo (pode ter cinzas no resíduo de fibra,
devem ser subtraídas para obter um dado mais preciso), determinação de proteínas associadas à fibra
(quantificação por Kjeldahl)
Subtração das cinzas e das proteínas quantificadas - resíduo real da fibra alimentar
OBSERVAÇÕES
Para ter a segurança de que as enzimas estão reproduzindo exatamente o comportamento das
enzimas humanas:
Verificar constantemente (com frequência) a atividade e pureza das enzimas utilizadas
(devem estar sem contaminação com enzimas que nosso trato GI não possui: pectinases, β-glicanases
e hemicelulases - hidrolisam a fibra solúvel e não consegue ser precipitada na etapa com etanol,
subestimação da quantidade de fibra solúvel)
Para eficiência da hidrólise:
As amostras devem apresentar baixo teor de umidade e de lipídeos (< 10 g/100 g)
Se já na amostra úmida o teor for baixo: ok
Se não: desidratação e/ou retirada da gordura da amostra, depois análise
Também devem ser trituradas previamente às análises (tamanho de partícula entre 0,3 a 0,5
mm, utilização de moinho ou gral, se possível peneiramento das partículas em um tamis de graduação
adequada para obter tamanho de partícula adequado)
Preferencialmente, trabalhar com amostras previamente secas e desengorduradas
Método mais preciso e mais próximo da definição atual de fibra alimentar que os métodos
gravimétricos antigos
Existem casos em que nem mesmo o enzímico-gravimétrico pode ser utilizado
Carboidratos não-digeríveis, fontes de fibra alimentar solúvel, com menos de 12 monômeros
não são quantificados (ex. Inulina - raizes, frutooligossacarídeos - menores que a inulina, polidextrose
- cadeia curta tb, maltodextrinas resistentes - mesma coisa, estaquiose e rafinose,
galactooligossacarídeos, etc)
Esses carboidratos deverão ser quantificados por metodologias que são específicas para eles,
publicadas pela AOAC International (adaptações: cada carboidrato curto tem um método específico
para si, etapas de cromatografia, etapas adicionais de hidrólise, etc etc)
COMPONENTES USADOS NOS DOIS MÉTODOS
Materiais para filtração:
Cadinhos filtrantes
Filtrar o hidrolisado com fibra alimentar
Auxiliar de filtração de SiO2 (areia muito refinada) para retenção do resíduo (Celite® Analytical Filter
Aid, Sigma-Aldrich) (NileRed usa direto)
Adicionada ao cadinho de filtração (1g antes da análise)