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JÉSSICA BARBOSA MARTINS PDC: Análise de Alimentos II 1° Bimestre Jaguariúna - SP 2021 RESUMO A palavra bromatologia deriva do grego, sendo definida como a ciência que estuda os alimentos. Busca conhecer as composições químicas das substâncias presentes em todos os níveis, desde alimentos “in natura” até processados e industrializados. Os métodos de análises permitem que haja maior segurança no consumo, e consequentemente que melhores escolhas sejam feitas. Os estudos auxiliam no avanço da tecnologia, identificando as necessidades fisiológicas e bioquímicas de cada alimento. Palavras-chave: Bromatologia.Segurança.Alimentos. 2 Lista de Figuras Figura 1 - Fórmula da variância do desvio padrão……………………………………...12 Figura 2 - Fórmula do coeficiente de variação…………………………………………..12 Figura 3 - Fórmula da exatidão……………………………………………………………13 Figura 4 - Fórmula da estimativa do limite de detecção………………………………..13 Figura 5 - Fórmula do limite de quantificação…………………………………………...14 Figura 6 - Condições para avaliação de robustez………………………………………14 Figura 7 - Atividade de água dos microorganismos…………………………………….21 Figura 8 - Atividade de água dos alimentos……………………………………………..21 Figura 9 - Cálculo da umidade em base úmida…………………………………………22 Figura 10 - Cálculo da umidade em base seca………………………………………....22 3 Introdução à Análise de alimentos 5 História da alimentação 6 Segurança alimentar - desafios atuais da Ciência de Alimentos 6 Atuação do Nutricionista na área de Alimentos 7 Métodos para análises de alimentos 8 Importância das análises de alimentos subsidiando diversos ramos da Ciência de Alimentos 8 Regulamentação de alimentos no Brasil 8 Classificações de métodos (normalizados e não normalizados, convencionais e instrumentais, qualitativos e quantitativos) 9 Validação de métodos (parâmetros de desempenho) 10 Amostragem e preparo de amostras para análises de alimentos 14 Importância da amostragem 15 Planos de amostragem 15 Processos de amostragem (obtenção de amostra bruta, amostra de laboratório, amostra analítica) 16 Tipos de amostragem (probabilística e não probabilística) 17 Amostragem aleatória simples, amostragem aleatória estratificada e amostragem sistemática 17 Pontos críticos e cuidados na amostragem de alimentos 18 Umidade nos alimentos 19 Propriedades da água 20 A água nos alimentos (água livre, água combinada – adsorvida e ligada ou de monocamada) 20 Importância da água nos alimentos 21 Determinação de umidade em alimentos 22 Teores de umidade em alimentos 22 Métodos diretos e indiretos 23 Determinação de umidade por secagem, destilação, titulometria (método químico) e métodos físicos 23 Minerais nos alimentos 26 Classificação dos minerais 26 Fontes de minerais 29 Importância dos minerais nos alimentos 30 Determinação de minerais em alimentos – cinzas ou resíduo mineral 31 Queima seca e queima úmida (métodos clássicos e por micro-ondas) 31 Cinzas solúveis e insolúveis 32 Conclusão 34 Referências 35 4 1. Introdução à Análise de alimentos A análise de alimentos, ou bromatologia tem como objetivo a obtenção da composição química dos alimentos pela determinação de suas frações nutritivas. Os resultados dessa análise, permitem o balanceamento correto da dieta de humanos e animais e determina sua composição nutricional, aumentando a resposta produtiva. Em sua grande parte, busca identificar componentes conhecidos como centesimais, de grande importância, compreendendo a água, os carboidratos, os minerais, as proteínas, entre outros. O estudo científico aprofundado consiste em métodos avançados, baseados nas propriedades físico-químicas dos alimentos, buscando maior compreensão de suas estruturas e substâncias, para comprovação da disponibilidade dos nutrientes oferecidos e maior transparência nas transmissões de informações. A bromatologia, também permite que compostos adulterados e clandestinos sejam identificados, de forma que a segurança e qualidade dos alimentos seja evidenciada. A crescente mudança e avanços tecnológicos, cria a necessidade de uma análise sobre suas influências nos alimentos, identificando aditivos e outros compostos, para que possam ser classificados e analisados quanto às suas composições e possíveis modificações no alimento original. Os laboratórios e analistas que realizam as análises, precisam demonstrar confiabilidade nas avaliações e nos métodos empregados, em conformidade com a legislação e regulamentação, uma vez que são o ponto inicial para a aplicação de políticas de saúde pública e defesa do consumidor. Sendo assim, conhecer todos os processos e especificidades de cada um, permite maior segurança na escolha do método e consequente fidelidade e confiança nos resultados apresentados. 5 1.1. História da alimentação Acredita-se que os primeiros alimentos consumidos, foram raízes e frutos, devido a observação do comportamento de outros animais, que seguiu para carne crua e moluscos conforme passava por seu período evolutivo. Com a descoberta do fogo, foi possível assar e cozinhar, descobrindo novos alimentos e novas formas de prepará-los. A primeira sobremesa foi o mel de abelha, e devido às migrações, a agricultura teve início com a percepção da germinação de sementes. No período neolítico, os egípcios, através das ervas medicinais e do conhecimento em suas propriedades, procuravam formas de trazer saúde para a mesa. Na idade média, a presença de três sabores foi evidenciada, o doce, ácido e forte, e na idade moderna inicia-se a agricultura voltada para fins comerciais, que perdura até os dias de hoje. Durante a revolução industrial, o processo de urbanização deu origem a grandes concentração de pessoas, o que chamou a atenção para a disponibilidade de alimentos e para as condições de higiene precárias, que diminuía a qualidade dos alimentos, obrigando as autoridades a intervir e criar organizações e centros de pesquisa. Os europeus, principalmente os portugueses, desenvolveram técnicas avançadas de agricultura e criação de animais, o que permitiu a obtenção dos derivados, como queijos e alguns defumados. Durante todo esse período, nossos antepassados passaram por situações de extrema fome e doenças, onde aprenderam a utilizar os alimentos para combater e fortalecer o corpo, mas também na elaboração de sensações que antes não eram encontradas. Com o tempo, a alimentação se tornou primordial para um bom funcionamento do organismo e deixou de ser usada apenas para saciar a fome, para ocupar festas, reuniões familiares e estar presente nas mesas de famílias inteiras. 1.2. Segurança alimentar - desafios atuais da Ciência de Alimentos No período durante as duas grandes guerras mundiais, ficou evidenciado os reflexos da escassez de alimentos, pela falta de condições para a produção de alimentos saudáveis, especialmente devido à grande contaminação dos recursos naturais durante a produção de armas. Hoje, quase 100 anos depois, a distribuição ainda não é suficiente, países inteiros sofrem com a falta de disponibilidade de alimentos para toda a população, fazendo cada vez mais vítimas da fome. Pensando nisso, o termo “segurança alimentar” foi criado, para que práticas e iniciativas sejam adotadas, para que todas as pessoas tenham acesso a alimentos saudáveis, com valor nutricional e na quantidade adequada. Em 1993, foi criado o Conselho Nacional de Segurança Alimentar e Nutricional (CONSEA), e no Brasil, programas como o fome zero foram implementados, e juntamente com essas medidas, começaram a aparecer os desafios, que englobam desde questões sociais, até interações comerciais. Os principais são: ● Desperdício de comida Perdas são frequentes desde o período da plantação, o que dificulta ainda mais na distribuição dos alimentos. Plantações e safras são acometidas por diversos fatores, físicos, químicos e biológicos, que diminuem expressivamente a quantidade final. Há ainda o emprego de técnicas antigas, e falta de preocupação com processos como transporte e 6 armazenamento, que muitas vezes sofre com estruturas falhas, que aceleram o processode deterioração do alimento. ● Questões políticas Sem o incentivo do governo na criação de políticas públicas que garantam o acesso de alimentos para todos, a distribuição se torna mais desafiante. Pensando na cadeia dos alimentos, o acesso a equipamentos adequados, de qualidade para os produtores, garante que as perdas durante o processo de plantação sejam minimizadas, porém, é necessário que haja uma política que vise suprir a alimentação da população mais carente, assegurando seu acesso. ● Mudanças climáticas Condições climáticas são fundamentais para a disponibilidade de alimentos. A produção depende diretamente de um ambiente propício para seu crescimento e desenvolvimento, e mudanças extremas podem acometer grande parte, e às vezes, toda a plantação. Alimentos necessitam de condições específicas de acordo com seu tipo, para o sucesso do plantio, portanto é necessário que haja o investimento em tecnologias que propiciem ambientes controlados durante essas mudanças tão significativas. ● Escassez de recursos naturais A crise hídrica e a degradação dos solos, é de extrema importância na produção de alimentos. Devido às contaminações, e outros fatores, os solos encontram-se em degradação, aproximadamente 30% no mundo, de acordo com a Embrapa. Dessa forma, os nutrientes necessários para o desenvolvimento do alimento ficam comprometidos, o que dificulta o acesso ao alimento saudável, sendo necessário o aumento no uso de químicos para sua manutenção. A água tem destino de aproximadamente 70% para a agricultura, o que diminui ainda mais os reservatórios, causando maior competição e escassez acelerada. 1.3. Atuação do Nutricionista na área de Alimentos O nutricionista tem papel fundamental na elaboração de produtos nutricionalmente saudáveis, que atendam a necessidade dos diferentes tipos de consumidores que estão surgindo, buscando alimentos com maior apelo à saudabilidade sem perder suas características sensoriais. Todo alimento que passa por modificação ou redução de um ingrediente ou substância, precisa da avaliação do nutricionista, afinal deve-se manter as propriedades benéficas e para isso é necessário que as novas formulações mantenham seus benefícios apesar das mudanças em suas configurações e estruturas. Além disso, todo o processo de rotulagem necessita do olhar de um nutricionista, que garante a descrição correta dos ingredientes, visando maior transparência com o consumidor final. Dentro de restaurantes, o nutricionista atua na preparação de cardápios e na garantia da higiene durante toda sua elaboração. Também assina como responsável técnico por ter a visão necessária na identificação de alimentos impróprios para o consumo, exceto em frigoríficos, onde essa função se destina ao médico veterinário. 7 Na área de pesquisa, o profissional certifica e confirma os benefícios, malefícios que diversos produtos e atitudes podem trazer para o organismo humano, bem como avalia os efeitos da ausência de determinadas substâncias e sua real necessidade dentro da dieta. 2. Métodos para análises de alimentos A análise de alimentos, consiste em determinar um ou vários componentes específicos, qualitativamente ou quantitativamente, através de alguma propriedade física, como massa, volume, absorção da radiação, medida do potencial elétrico, entre outros. São divididos em grupos, os convencionais, onde apenas é necessário o uso de vidrarias e alguns reagentes, e os instrumentais, que são realizados em equipamentos sofisticados, sendo os mais utilizados. 2.1. Importância das análises de alimentos subsidiando diversos ramos da Ciência de Alimentos Não somente saber como estamos comendo, também é importante conhecer o que estamos comendo. Essa cadeia se inicia com a alimentação dos animais que produzem nossos alimentos e termina com o alimento pronto a mesa do consumidor. A análise dos alimentos, conhecida como bromatologia faz a parte científica deste estudo, buscando conhecer a composição química de cada alimento, mas também sua ação no organismo, valor nutricional, propriedades físico-químicas e toxicológicas, e possíveis adulterantes ou contaminantes. Quando mais aprofundada, a bromatologia define aspectos sensoriais, como cor, sabor e aroma e até mesmo modificações microbiológicas. Em relação a aplicação dessa ciência, temos diversas frentes interessadas, desde indústrias, em que é necessário a constatação da qualidade do alimento, do controle dos processos em águas, alimentos, matérias-primas, produto acabado e embalagens, a análise e melhoria do tempo de vida-de-prateleira, o desenvolvimento de novos produtos, pela avaliação das composições das matrizes, e o melhoramento de produtos que já estão consolidados no mercado. No entanto, apesar de representar a maior parcela de sua utilização, as indústrias dividem as aplicações com universidades e centros de pesquisa, onde ocorrem novos estudos e desenvolvimentos de metodologias, e em laboratórios privados, que utilizam das análises principalmente na prestação de serviços. Outra frente importante, são os órgãos de fiscalização, que por meio desse estudo, avalia os produtos disponíveis em relação a legislação vigente, padroniza os métodos e possíveis resultados, de acordo com as observações já levantadas, o que garante maior padrão de qualidade e segurança nos controles e processos empregados. 2.2. Regulamentação de alimentos no Brasil Pela legislação, os alimentos são: “toda a substância ou mistura de substância, que ingerida pelo homem fornece ao organismo os elementos normais à formação, manutenção e desenvolvimento”. Para sua classificação, são divididos em categorias que permitem facilitar sua identificação e aplicação. 8 ● Alimentos simples: transformados em metabólitos pela ação da reação química de enzimas. Compreendem os lipídios, proteínas, açúcares, entre outros. ● Metabólitos: substâncias que são metabolizadas após sua absorção, provenientes dos processos químicos no organismo humano. Compreendem a água, os sais, monossacarídeos, aminoácidos e ácidos graxos. ● Alimentos compostos: composição química variada, complexa, de origem animal ou vegetal, ou da mistura de alimentos simples, como leites, carnes e frutas. O processo a que esses alimentos são submetidos, geram subprodutos, chamados derivados. ● Alimentos aptos para o consumo: cumprem as exigências da legislação vigente, não contém adulterantes e possuem rótulos legalizados. Também são chamados de alimentos genuínos. ● Alimentos naturais: são considerados aptos se apenas a remoção da parte não comestível for suficiente para seu consumo seguro. ● Alimentos não aptos para o consumo: todos e qualquer alimento que por algum motivo específico não pertence à legislação permitida. Alguns fatores para que sejam considerados não aptos são: ➔ Contaminação: por agentes vivos, como vírus, bactérias e parasitas, ou por substâncias químicas minerais ou orgânicas, como defensivos, metais pesados, que não pertençam a sua composição original, tóxicos ou não, como sais e nitratos, em quantidades acima das permitidas. ➔ Alteração: sofrem modificações por causas naturais, físicas, químicas ou biológicas, que podem auxiliar na deterioração de suas características organolépticas, composição ou valor nutritivo. ➔ Falsificação: possuem aparência e algumas características sensoriais de um produto original, mas são provenientes de fabricação clandestina e não autorizada. ➔ Adulteração: Adição de substâncias capazes de ocultar problemas ao controle de qualidade, sendo impuro e impróprio para o consumo, previsto como crime, na Lei Federal 9677/98. 2.3. Classificações de métodos (normalizados e não normalizados, convencionais e instrumentais, qualitativos e quantitativos) Métodos normalizados são aqueles desenvolvidos por um organismo de normalização, como ABNT, ASTM, ANSI, em que os métodos já foram validados e são aceitos para a análise em questão. Já os não normalizados, são métodos desenvolvidos pelo próprio laboratório, partes envolvidas, ou a partir de métodos já consolidadose validados, como os publicados em revistas técnicas, orientados pelos fabricantes, quando há a utilização de kits de ensaio e instrumentos portáteis. Nesse caso, o laboratório deve 9 validar esse método, apresentando planejamento, dados obtidos, resultados, documentados e registrados para que haja a rastreabilidade do processo. Os métodos convencionais não necessitam de nenhum equipamento especializado, sendo possível a análise somente com vidrarias e reagentes, com processos mais comuns como gravimetria e volumetria. Os métodos instrumentais, diferentes dos convencionais, necessitam de instrumento eletrônico sofisticado, com alto grau de exatidão, eliminando possíveis erros. No momento da escolha do método, alguns fatores devem ser observados: ● Tipo de produto; ● Quantidade do componente (> 1% - convencional e 0,01 até 1% - instrumentais); ● Exatidão requerida (até 99,9% com o analito em mais de 10% da amostra - convencional); ● Composição química; ● Recursos disponíveis; ● Quantidade de amostras. Algumas vantagens dos métodos convencionais são o baixo custo, não necessita de equipamento sofisticado, economicamente viável, em alguns casos é adotado como oficial previsto na legislação. As desvantagens são, o tempo para a execução tende a ser mais longo, possibilidade maior de erros acumulativos e a falta de sensibilidade, deixando a desejar na detecção de microconstituintes. Os métodos instrumentais, tem como vantagens o alto grau de exatidão, menor tempo na análise, maior rendimento e minimização de erros, e como desvantagens, alto custo e a necessidade de treinamento para sua realização. Os métodos qualitativos são aqueles onde há a análise da composição química, baseando-se em suas propriedades físicas, químicas e biológicas, e podem ser a identificação de um ou mais analitos, por meio de técnicas analíticas, e de classificação de amostras, rápida e confiável, com critérios pré-estabelecidos. 2.4. Validação de métodos (parâmetros de desempenho) Quando um método analítico é utilizado, este precisa ser validado em conformidade com os órgãos responsáveis para garantir qualidade das medições e análises químicas, pela comparação, confiança e rastreabilidade, de forma que resultados diferentes das especificações perdem sua confiabilidade, causando danos nas tomadas de decisões e problemas financeiros. Isso define uma padronização no processo de análise, o que garante maior qualidade dentro dos limites de tolerância estabelecidos pelas agências de regulamentação responsáveis. No Brasil, a regulamentação é feita por três agências: Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Instituto Nacional de Metrologia, Normatização e Qualidade Industrial (INMETRO) e Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA). Internacionalmente, os métodos são validados de acordo com as exigência do IHC, compostos pela Europa, Estados Unidos e Japão, em concordância com a Food and Drugs Administration (FDA), Internacional Organization for Standardization (ISO) e Internacional Cooperation on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Veterinary Medical Products. Métodos devem ser validados, quando não são reconhecidos pela ANVISA e revalidados, se a composição ou produção do produto for alterada de forma que haja impacto significativo no método já validado. Para isso, documentos contendo a descrição do 10 procedimento, parâmetros analíticos, critérios de aceitação e resultados obtidos, devem ser elaborados de forma detalhada, permitindo sua reprodução e avaliação. Nessa etapa, alguns parâmetros são empregados, de forma que o torne legítimo, por meio de comprovação em documentos, englobando todos os processos, desde a produção, controle de qualidade, condições ambientais, insumos e matérias-primas. ● Seletividade ou especificidade Principal método de validação, é o precursor das etapas seguintes, por comprometer seus resultados caso não seja realizado de forma eficaz. Portanto, é aplicado continuamente durante todo o processo de execução e, identifica ou quantifica o analito de interesse, mesmo em presença de outros componentes, garantindo que o sinal da medição seja proveniente do analito em questão. Dessa forma, quando muitos analitos são analisados e há resposta de um componente em maior proporção, esse método é seletivo, e quando há resposta para apenas um analito, o método é específico, este menor frequência. Analisando as interferências pela variação da resposta do sinal ou do instrumental usado, pode-se visualizar os componentes, comparando a matriz em presença ou ausência do analito ou pelo método de adição de padrão, com valores aceitáveis entre 80% - 120% de recuperação, pela seguinte fórmula: %Recuperação = |𝐴𝐹|−|𝐴| / |𝑃| × 100 Onde: |𝐴𝐹| = concentração da amostra padrão; |𝐴| = concentração da amostra |𝑃| = incremento de concentração esperado pela adição do padrão ● Linearidade Capacidade de demonstrar que os resultados são diretamente proporcionais à concentração do analito na amostra, em um intervalo específico, por meio de padronização interna ou externa, expressos matematicamente. São usadas cinco concentrações diferentes com análise em triplicata realizando os cálculos a partir dos dados das concentrações reais pelas dados obtidos no método, para cada concentração diferente. Por meio desses cálculos, é obtido uma curva analítica, para a construção de um gráfico da relação dos resultados (eixo y) pelas concentrações (eixo x), com nível de significância de 5%. A relação entre as variáveis em questão, gera uma expressão, conhecida como equação da reta: y = a + bx Onde: y = resposta medida de acordo com a finalidade do método; x = concentração; a = intersecção com o eixo y; b = declive da curva analítica. 11 Por essa expressão, é possível obter o coeficiente de relação ®, que representa o grau de dispersão entre os valores obtidos e qualidade da curva analítica, sendo esperado valor acima de 0,99, com coeficiente angular diferente de zero. ● Precisão Um método preciso, demonstra que os resultados obtidos em ensaios pelas mesmas amostras, amostras semelhantes ou padrões definidos, apresentam valores muito próximos a um valor central, buscando-se estimar erros durante a medição, até que seja eliminado ou insignificante pela observação de sua incidência próxima a um valor médio. Esse método é expresso de diferentes formas. ● Repetibilidade: deve ser realizado por um mesmo responsável, em um único laboratório, com os mesmos equipamentos, realizado por nove determinações, em três concentrações com três réplicas, resultando em 6 testes individuais; ● Precisão intermediária: realizada em um mesmo laboratório, porém com intervalos de tempo, com análises em dias diferentes; ● Reprodutibilidade: realizada em laboratórios diferentes com as mesmas repostas analíticas. Os erros aleatórios do método de precisão podem ser calculados pelas seguintes expressões: Onde: Figura 1 - Fórmula da variância do desvio padrão S = desvio padrão; x = média aritmética de n número de medições; xi = valor individual da medição efetuada; n = número de medições. Onde: Figura 2 - Fórmula do coeficiente de variação CV = coeficiente de variação; S = desvio padrão; x = concentração média dos resultados obtidos. ● Exatidão Aproximação dos valores entre os resultados obtidos individualmente em relação ao valor de referência, expresso pela análise de um material certificado de referência, MRC, ensaios interlaboratoriais, EIL, ou ensaios de recuperação. A avaliação deve ser realizada por no mínimo nove determinações, em 3 concentrações em triplicata, de forma independente. A exatidão é dada pela fórmula: 12 Figura 3 - Fórmula da exatidão Por ser associada a erros sistemáticos devido aos ensaios interlaboratoriais, é usado a seguinte fórmula: Z − score = xlab−xy s Onde: xlab = valor obtido pelo laboratório; xy = valor de referência (verdadeiro); s = desvio padrão de referência. Um Z-score positivo está entre -2 a +2. ● Limite de detecção Menor quantidade de analitopresente em uma amostra que pode ser detectado de forma confiável, por métodos experimentais estabelecidos, por meio de análise de soluções conhecidas e decrescentes até o menor nível possível de detecção. Pode ser feita visualmente em métodos não instrumentais, observando-se o menor nível até que haja mudança de alguma propriedade, e por meio de da relação de 3 vezes o ruído da linha de base, em métodos instrumentais, sendo representado pela seguinte equação: Figura 4 - Fórmula da estimativa do limite de detecção Onde: DP = desvio padrão em interseção com o eixo y por no mínimo três curvas de calibração; IC = inclinação da curva de calibração. ● Limite de quantificação Menor quantidade de analito presente em uma amostra que pode ser detectado com precisão e exatidão por métodos experimentais estabelecidos, principalmente para ensaios quantitativos de impurezas e produtos de degradação em fármacos, expressos como concentração do analito . A análise é feita pela análise de soluções com concentrações decrescentes até menor nível, com precisão e exatidão aceitável. Também pode ser determinado pelo ruído, com limite superior a 10.1. É dado pela seguinte expressão: 13 Figura 5 - Fórmula do limite de quantificação Onde: σ∗ = desvio padrão em intersecção com o eixo y por no mìnimo três curvas de calibração, residual da linha de regressão ou pela curva de calibração da análise de determinados números de amostras do branco; β^1 = inclinação da curva de calibração. ● Robustez Método é confiável, que resiste a pequenas variações sem alteração, que pode ser quantitativo, onde essas variações são avaliadas de acordo com os critérios da exatidão, ou qualitativos, se causam mudanças na resposta analítica. No quadro abaixo, alguns parâmetros são demonstrados para indicar robustez. Figura 6 - Condições para a avaliação da robustez 3. Amostragem e preparo de amostras para análises de alimentos Alguns alimentos são produzidos em larga escala, dificultando sua análise, portanto, é necessário que uma pequena parte, apropriada para a avaliação em laboratório, 14 representando a totalização da amostra, seja retirada. Quanto mais homogênea, mais difícil se torna o processo de amostragem, dessa forma, todas as operações empregadas devem garantir que a porção analisada contenha todos os componentes da matriz, seguindo os métodos analíticos compatíveis com um ou vários componentes a se determinar, como no caso da composição centesimal e mineral, usadas para conhecer e controlar quimicamente a qualidade dos produtos. O método utilizado é escolhido de acordo com a quantidade relativa do componente, requisitos gerais do método, exatidão requerida, eficiência analítica e composição química da amostra. 3.1. Importância da amostragem O tempo empregado no processo de amostragem é de aproximadamente 60% em relação às demais etapas da análise, com gasto de 40%. Os erros estimados ficam em torno de 30%, contra 70% no restante do processo. Analisando esses dados, é perceptível a importância do planejamento inicial para as demais etapas da análise, sendo o ponto de partida, garantindo maior representatividade, resultados confiáveis sobre a composição do produto, possibilitando que dietas mais confiáveis sejam elaboradas, atendendo às exigências e a manutenção das deficiências nutricionais, em humanos e animais, com maior desempenho e produtividade. A atenção no momento da coleta e um plano bem elaborado evita erros posteriores, uma vez que estes não podem ser corrigidos nas demais etapas da análise, o que prejudica sua exatidão e precisão. 3.2. Planos de amostragem Após a coleta da amostra é necessário planejar o regime a ser adotado, como quantas amostras serão analisadas, qual sua composição, método a ser empregado, como será feita a coleta e armazenamento até o momento da análise, qual o local proveniente da amostra, como produtos in natura ou industrializados, identificação do lote e especificações técnicas. As amostras nunca devem ser retiradas de um mesmo ponto, para que a confiabilidade na avaliação da totalização produzida esteja assegurada, portanto poderão ser colhidas nos locais de fabricação, preparo, depósito, acondicionamento, transporte e exposição à venda. Através da amostra indicativa, ou seja, número total de unidades produzidas, é retirada uma parte representativa, como o número de unidades que representam o lote, e desta é retirada a menor porção, ou embalagem unitária compatível com a avaliação em laboratório. Pode ser feito por atributos, de forma qualitativa, por meio de observação visual de parâmetros estabelecidos, como cor, odor, bolor, granulometria, grumos, pelotas, umidade, textura, presença de insetos, materiais estranhos, avarias, contaminantes e larvas, ou por variáveis, de forma quantitativa, em uma escala contínua de limites m, aceitável e M, inadequado. O plano de amostragem é definido pela avaliação da ausência ou contagem de algum critério físico, sensorial, microbiológico ou de composição química. No primeiro caso, é definido como um plano de duas classes, onde duas possibilidades existem, sendo aceitável ou não a presença de determinado critério, já no segundo caso, o plano é definido como de três classes, de acordo com as variáveis: 15 n = número de unidades coletadas aleatoriamente de um mesmo lote, com valor de aceitação estabelecido; c = número máximo aceitável de n com contagem entre limites m e M m = limite que separa a amostra aceitável e intermediária; M = limite que separa a amostra aceitável e inaceitável. Após a coleta, a amostra deve ser acondicionada para que não sofra alterações, e identificada ou rotulada acompanhada de um relatório com informações do momento de seu recebimento, como sua fabricação ou colheita, temperatura, embalagem, entre outros. Quando propícia a deterioração, devem ser mantidas refrigeradas ou congeladas, a depender da especificação. Amostras destinadas a análises microbiológicas devem ser mantidas em ambiente esterilizado. As amostras devem ser enviadas imediatamente, em transporte adequado, de forma que as condições originais da coleta não se alterem, evitando-se longas viagens. Algumas amostras são destinadas para análise fiscal ou de controle, nesse caso, devem ser feitas em triplicata, ou de forma única quando não for possível, em que uma parte fica em posse do local original para eventuais perícias e as demais são enviadas para análise de controle em laboratório, com métodos previstos na legislação, após liberação do órgão competente de Vigilância Sanitária. 3.3. Processos de amostragem (obtenção de amostra bruta, amostra de laboratório, amostra analítica) O processo de amostragem é resumido em três etapas. Os conjuntos de incrementos empregados na coleta de uma amostra, de acordo com critérios estabelecidos, formam a amostra bruta, que ao ser reduzida por operações de maneira a garantir sua representatividade, é classificada em amostra de laboratório. Em sequência, a amostra de laboratório é reduzida a uma porção ainda menor, com homogeneização suficiente para ser pesada e submetida a análise, caracterizada por amostra analítica. ● Amostra bruta Representa uma pequena porção de um todo, como um réplica, em relação a composição, particularidades e distribuição do tamanho da partícula. Amostras líquidas ou pastosas são coletadas em frascos de mesmo volume, a partir de frações do alto, do meio e do fundo do recipiente, após homogeneização por agitação. Amostras sólidas a granel ou embaladas em caixas e latas com diferença de texturas, densidade e tamanho devem ser moídas ou trituradas e misturadas. Quando as amostras se apresentam de forma única ou em pequena quantidade, o próprio material é definido como amostra bruta, e para lotes maiores, a coleta deve compreender 10 a 20% do número de embalagens, ou 5 a 10% do peso total, e em casos de lotes muito grandes, as amostras devem ser , com x como o𝑥 número de unidades do lote. ● Amostra de laboratório Após o processo anterior, a amostra deve ser reduzida e aplicado o métodode acordo com sua composição. Amostras em alimentos secos, como pós, podem ser realizadas de forma manual, por quarteamento, ou equipamentos tipo Riffle e Boerner. 16 Amostras líquidas devem ser homogeneizadas por agitação, inversão ou troca de recipientes, e após, retirar porções de diferentes camadas, alto, meio e baixo, misturando-as ao final. Amostras semi sólidas, como peças de queijos e chocolates devem ser raladas e seguidas de quarteamento. Alimentos úmidos, como carnes, peixes e vegetais, são picados, moídos e misturados, seguidos de quarteamento para posterior retirada de alíquota necessária, mantidos sob refrigeração. Alimentos em pasta ou líquidos contendo sólidos, como molhos e doces tipo pudim e compotas de frutas, são picadas, levadas ao liquidificador ou mixer, e misturadas para retirada de alíquota de análise. Amostras em emulsão, como manteiga e margarina e alguns molhos em separação de fase, devem ser aquecidas a 35°C em frasco com tampa, em seguida homogeneizado por agitação, para posterior retirada de alíquota. Frutas grandes devem ser cortadas em quatro partes iguais, com utilização de apenas duas partes que devem ser homogeneizadas em liquidificador. As demais partes devem ser descartadas e frutas pequenas homogeneizadas diretamente no liquidificador. ● Amostra analítica Na extração de um componente, é necessário preparação prévia, de acordo com critérios dos métodos de análise específicos a cada substância, como no caso da determinação de proteínas, que é necessário o processo de desintegração e de alimentos secos ou úmidos, em que há necessidade de peneiras específicas. Em casos como esses, a análise deve ser feita imediatamente, porém quando não há essa possibilidade, alguns métodos de conservação são empregados por inativação enzimática, diminuição das mudanças lipídicas, controle de ataque oxidativo e microbiológico. 3.4. Tipos de amostragem (probabilística e não probabilística) Durante a coleta da amostra pode ocorrer interferência do manipulador, como a escolha do material ou outros fatores, ou pode ser totalmente aleatória, escolhendo-se a representação ao acaso. No caso da amostragem probabilística, a amostra é retirada de forma aleatória, de forma que qualquer amostra escolhida, tenha a probabilidade de pertencer a matriz. Nesse tipo de amostra, é comum que haja uma lista com todas as características observadas, no caso dos alimentos, a composição ou quantidade de determinado composto no todo. As amostras não-probabilísticas, são retiradas de acordo com um critério para a seleção das amostras, em que mesmo retirando-se ao acaso, todas tenham a mesma possibilidade de apresentar tal critério. 3.5. Amostragem aleatória simples, amostragem aleatória estratificada e amostragem sistemática ● Amostragem aleatória simples Um dos métodos mais utilizados, onde as frações que compõem o todo, tem chance maior ou igual a zero de serem retiradas. Leva esse nome por representar um sorteio e é indicado em casos de matriz homogênea. Os elementos são rotulados, e a partir dessas 17 representações, escolhe-se ao acaso a fração da amostra, que deve conter os mesmos componentes listados, presentes na matriz. ● Amostragem aleatória estratificada A matriz é dividida em pequenos grupos, de forma que as composições sejam cada vez mais homogêneas, porém com um critério de avaliação adotado para cada subgrupo criado. De forma aleatória ou não, frações são retiradas de cada subgrupo, e em seguida, é feita a análise visando a representatividade da matriz. Esse tipo de amostragem se divide em uniforme, onde o número de elementos analisados para cada grupo, é sorteado igualmente, proporcional, onde o número de elementos de cada característica analisada é proporcional a quantidade total de cada subgrupo, e ótima, onde cada característica é definida com um número de elementos que é proporcional a quantidade total do subgrupo e também de sua variação. ● Amostragem sistemática A matriz é dividida em subgrupos com mesma quantidade, que devem ser analisados adotando-se um fator matemático, a ser escolhido. A cada fração retirada de um subgrupo, o fator matemático deve ser levado em consideração na escolha. Por exemplo, em uma amostragem, em que a matriz representa um saco de 500kg, 50 grupos de 10kg são retirados, de forma que a cada fração retirada de um grupo, um componente seja analisado. Olhando-se para a amostra, uma quantidade x, deve ser determinada para a retirada, onde aplicando-se um fator matemático que criará uma sequência, seja possível obter uma representabilidade mais fiel ao todo, devido a probabilidade de existência de determinado componente, a ser analisado, em cada subgrupo. 3.6. Pontos críticos e cuidados na amostragem de alimentos Um ponto crítico de controle corresponde a qualquer escolha, que ao ser tomada, evite ou reduza a níveis muito baixos, um potencial risco de erro, de forma que se as práticas realizadas não forem feitas corretamente, colocarão em risco todo o processo e consequentemente todas as etapas seguintes. Em um laboratório de análise de alimentos, encontramos esses pontos em determinados momentos. ● Coleta e preparo da amostra O cuidado durante a amostragem, para que a amostra seja representativa, com o tamanho e quantidade corretos, é um dos pontos principais para o sucesso do processo. Além disso, os alimentos sofrem alterações de acordo com variações em parâmetros físico-químicos e ambientais, o que pede maior atenção no momento da coleta, para que evitem-se erros e a análise possa ocorrer mais rapidamente. Dessa forma, para garantir uma coleta eficiente, a documentação deve estar pronta, o controle de contaminação deve ser avaliado, bem como o transporte e armazenamento. Algumas alterações comuns são a perda de umidade, decomposição, separação de fases, infestação de insetos e contaminação microbiológica. ● Métodos de análise 18 Após a avaliação da amostra a ser analisada, deve-se adotar um método que preencha todos os requisitos: exatidão, seletividade, precisão e especificidade, de forma rápida, prática e viável. Os atributos principais e fundamentais para o sucesso da análise devem ser levados em consideração no momento da escolha do método, levando-se em conta a relação exatidão e precisão. ● Tipos de erros em análise de alimentos Os erros podem ocorrer por falha do operador, quando a descrição da amostra é incorreta, os procedimentos não são seguidos, os cálculos não são presentativos ou algumas informações não são transmitidas, falhas no equipamento, com erros durante a medição e calibragem incorreta, reagentes com baixa qualidade ou com presença de impurezas, e erros na escolha do método. ● Instrumentação Os equipamentos tendem a sofrer desgastes com o tempo, portanto deve-se atentar ao uso de padrões e calibragens periódicas. Ainda assim, esses desgastes podem comprometer a análise se um instrumento levar mais tempo para alterar a temperatura da amostra ou identificar incorretamente a quantidade da fração. ● Analistas Treinamentos devem ser oferecidos para que o analista consiga determinar com máxima precisão e exatidão os componentes, em concentrações altas e muito baixas. Exames devem ser realizados para verificar eventuais problemas de saúde, que possam comprometer a análise minuciosa, a exemplo, problemas de visão. 4. Umidade nos alimentos Industrializado ou não, todo alimento contém em maior ou menor quantidade umidade ou teor de água, que é o reflexo do teor de sólidos e demonstra seu grau de perecibilidade, que ao estar fora das recomendações causa grande estabilidade química, deterioração microbiológica, alteração fisiológica e comprometimento da qualidade do alimento. Na temperatura de 105°C, a água sofre volatização, o que permite sua separação do material a ser analisado, resíduo seco, de forma que em seu ponto de ebulição, a 100°C, ocorrem perdas mínimas de alguns minerais, sendo, portanto, o primeiro método de análise bromatológico a ser realizado. Em alguns casos, outras substâncias voláteis podemestar presentes na amostra, necessitando de separação por destilação. Frequentemente, a umidade representa a água livre de um alimento, correspondendo a perda de peso que ocorre no aquecimento. 4.1. Propriedades da água 19 Em qualquer organismo vivo, a água se apresenta como um componente abundante, portanto, está diretamente ligada à alimentação. Para que seja adequada, deve atender parâmetros microbiológicos, físico-químicos e radioativos de potabilidade, que podem variar de acordo com sua origem e tratamento. Sua molécula é formada por um átomo de oxigênio que compartilha dois pares de elétrons com 2 átomos de hidrogênio, permitindo sua interação com outras moléculas de água ou não pela sua característica de eletronegatividade e pontes de hidrogênio. Essa capacidade de interação é determinante para sua ação solvente, inferindo diretamente na composição de alguns alimentos, como sais, açúcares, alcoóis e alguns aminoácidos que são fracamente solúveis e, em gorduras e aminoácidos apolares, que apresentam baixa solubilidade. A água apresenta algumas propriedades que são essenciais para sua utilização e consumo, como dureza, alcalinidade, cor e alguns componentes como cloro, ferro e flúor. 4.2. A água nos alimentos (água livre, água combinada – adsorvida e ligada ou de monocamada) A quantidade de água de um alimento é expressa pelo valor da totalidade de água contida, porém, essa definição não fornece informações sobre a distribuição, o que dificulta determinar a quantidade de água ligada ao alimento. Conhecer esse dado permite determinar a possibilidade no desenvolvimento de microorganismos pelo teor de disponibilidade, e seu congelamento. Sendo assim, fica evidente que existem moléculas com propriedades e distribuições diferentes em um mesmo alimento. Podemos definir essas moléculas em dois grupos: ● Água livre Está fracamente ligada aos componentes do alimento, entre os espaços intergranulares nos poros do alimento. É a água que permite o crescimento microbiano, causando alterações sensoriais indesejáveis e, atua como meio para reações químicas e bioquímicas, que também modificam os alimentos. É conhecida como umidade de superfície, por estar presente na superfície do alimento, atuando como agente dispersante para substâncias coloidais e solventes para compostos cristalinos. É facilmente evaporada ou congelada. ● Água adsorvida Uma pequena parte encontra-se na superfície interna e externa dos colóides macromoleculares, como amidos , pectinas, celuloses e proteínas, por força de Van de Waals e pontes de hidrogênio. Propicia o desenvolvimento microbiano e reações químicas e bioquímicas, atuando como solvente. ● Água ligada ou de monocamada Fortemente ligadas aos demais componentes do alimento, formando a primeira camada de hidratação, combinada químicamente com as substâncias, não permitindo o desenvolvimento de microorganismos, reações químicas e bioquímicas. Não sofre 20 alterações em processos de congelamento e é de difícil determinação em análises de umidade por ser de difícil eliminação. 4.3. Importância da água nos alimentos O teor de água livre infere diretamente na conversação dos alimentos. É expresso pela atividade de água, sendo a relação entre a pressão do vapor de água em equilíbrio e a pressão de vapor de água pura, na mesma temperatura, caracterizando-se pela umidade relativa (URE), dada pela expressão URE/100. O valor máximo da atividade de água deve ser 1 na água pura, no entanto, alguns alimentos ricos em água apresentam esse teor abaixo de 0,90, fornecendo substrato para o desenvolvimento de microorganismos. Nesses casos, as reações químicas ocorrem mais lentamente, devido a baixa concentração dos reagentes. Atividade de água entre 0,40 e 0,80 permitem reações químicas e enzimáticas com maior velocidade, devido a maior concentração de reagentes, e quando, inferiores a 0,30, estão fortemente ligadas ao alimento, atingindo a zona de adsorção primária. A tabela abaixo, demonstra os diferentes teores de água para o desenvolvimento de microorganismos, bem como a atividade de água em diferentes alimentos. Figura 7 - Atividade de água dos microorganismos Figura 8 - Atividade de água dos alimentos A atividade de água está diretamente ligada a umidade de um alimento, o que se relaciona com sua estabilidade, qualidade e composição, afetando a estocagem, que em presença de alta umidade são mais facilmente deteriorados pelo desenvolvimento de microorganismos ocorrer de forma mais rápida, a embalagem, que devido ao seu material sofre influência de determinados fatores, como luz e temperatura, causando aumento da 21 umidade e, no processamento, devido ao comportamento do alimento durante a fabricação, pela inferência do teor de umidade. 4.4. Determinação de umidade em alimentos Apesar de parecer simples, os métodos comumente utilizados para determinar a umidade de alimentos ainda encontram algumas dificuldades, como a separação incompleta da água do produto, a decomposição do produto com formação de água além da original e perda das substâncias voláteis do alimento. Os mais utilizados, permitem a decomposição dos componentes orgânicos e volatilização dos compostos voláteis, conhecidos como base seca, baseados na secagem, destilação e interação física da água. 4.5. Teores de umidade em alimentos Em aquecimento a 105°C temos a separação da água e do que chamamos resíduo seco ou anidro, porém, alguns a incidência de alguns erros deve ser observada, evitando alteração nos resultados. Alguns erros mais comuns são devido a secagem incompleta, oxidação do material, erros de amostragem e pesagem e erros do observador. Algumas amostras se decompõem a essa temperatura, portanto, o aquecimento deve ser feito em temperaturas inferiores ou estufas a vácuo, com pressão de 25 mmHg e temperatura de 70°C. Alguns processos são usados baseando-se em reações na presença de água, como o método Karls-Fischer, por radiação infravermelha ou microondas. Para a determinação da umidade de um produto existem duas formas diferentes, em base seca, usada em trabalhos de pesquisa e equações de secagem, e base úmida, mais utilizada para atividades comerciais e de armazenamento. Os cálculos abaixo representam a determinação da base úmida ou base seca após a análise. Umidade em base úmida (Ubú) (%) Figura 9 - Cálculo da umidade em base úmida Onde: Pa = peso da água; Ps = peso da matéria seca (valor constante) e P(t) = peso total. Umidade em base seca (Ubs) (%) Figura 10 - Cálculo da umidade em base seca 22 4.6. Métodos diretos e indiretos Os métodos diretos determinam o valor da umidade pela remoção da água presente no alimento pelo processo de aquecimento. Tem alta confiabilidade, sendo portanto os mais utilizados como padrão, porém exigem um longo período de execução. São utilizados os métodos de estufa, destilação, infravermelhos e Karl-Fischer. Já os métodos indiretos, usam as propriedades elétricas, capacitância e resistência dos alimentos. São mais rápidos e práticos, porém são mais propícios a erros decorrentes das propriedades físicas, temperatura e distribuição de umidade dos alimentos. Os equipamentos são aferidos de acordo com o método de estufa, com variação permitida de 0,5% para teores inferiores entre 20 e 25% e, com exigência técnica específica de acordo com o alimento. Esse método é mais utilizado para a determinação de umidade em grãos. 4.7. Determinação de umidade por secagem, destilação, titulometria (método químico) e métodos físicos ● Métodos por secagem ➔ Secagem em estufas O ar quente proveniente do aquecimento, é absorvido por uma fina camada do alimento e inserido no interior por condução. A propriedade de condução térmica dos alimentos é relativamente baixa, o que torna maior o tempo necessário para que o calor atinja suas porções mais internas, levando entre 6 a 18 horas, em temperatura de 100 a 105°C. No momento da evaporação, pode ocorrer a remoção incompleta da água pela força das ligações da água ligada e determinação incorreta da umidade por perdade substâncias voláteis ou reações de decomposição. Esse método necessita apenas de uma estufa e cadinhos, porém pode apresentar erros devido a temperatura de secagem, umidade relativa e movimentação do ar na estufa, vácuo na estufa, tamanho das partículas e espessura, construção da estufa, número e posição das amostras na estufa, formação de crosta seca na superfície, material e tipo do cadinho e pesagem da amostra quente. As partículas devem ser moídas nas menores espessuras possíveis e a pesagem somente após resfriamento em dessecador. Estufas simples, tem temperatura de evaporação minimamente superior a 100°C a pressão atmosférica é de aproximadamente 70°C em estufa a vácuo. O uso de cadinho de alumínio mostrou-se mais eficiente por elevar a velocidade de evaporação, em relação aos de vidro e porcelana. Amostras líquidas devem ser evaporadas em banho maria até obter consistência pastosa, amostras açucaradas necessitam de adição de areia ou pedras, pela formação de crosta em sua superfície, que pode impedir a saída de água de seu interior. O peso das amostras deve ser de 2 a 5g bem distribuída no cadinho, transportada com pinça ou papel, para evitar a passagem da umidade da mão para o cadinho, para a estufa. Após evaporação total, o cadinho deve ser retirado com pinça ou papel e levado para o dessecador até completo esfriamento e em seguida, pesado. O valor obtido deve ser descontado do peso do cadinho vazio. ➔ Secagem por radiação infravermelha 23 Uma lâmpada de radiação infravermelha com 200 a 500 watts com temperatura entre 2000 e 2500 °K (700°C), incide a cerca de 10 cm de uma amostra com espessura entre 10 e 15 mm, por um período de 20 minutos para produtos cárneos e 10 minutos para grãos. O peso da amostra varia de 2,5 a 10g. Sua desvantagem é a impossibilidade de secagem de mais de uma amostra ao mesmo tempo, com repetibilidade afetada pela variação de energia elétrica, no entanto, é mais efetivo por ser feito pela penetração do calor dentro da amostra, o que diminui o tempo de secagem em até 1⁄3 do total. ➔ Secagem em fornos de microondas A radiação eletromagnética causa o aquecimento por rotação dipolar e polarização iônica, na frequência de 3 Mhz a 3000 Ghz, fazem as moléculas com cargas elétricas dipolares girarem, na tentativa de alinhar seus dipolos a mudança do campo elétrico, que por fricção passam calor para as moléculas vizinhas. O calor é distribuído uniformemente, pela capacidade do equipamento de aquecer seletivamente áreas com maior umidade, facilitando a evaporação da água e evitando formação de crosta. A amostra é misturada ao cloreto de sódio para evitar espirramento, e óxido de ferro para maior absorção de radiação. É um método novo, rápido e simples, que permite secar de 2 a 30g de amostra entre 2,5 e 90 min, e calibração de tempo e energia, diferente a cada tipo e quantidade de amostra. ➔ Secagem em dessecadores: Utilizados com vácuo e compostos químicos que absorvem a água, a temperatura ambiente, o que causa lentidão no processo de secagem, podendo levar até meses para a finalização. Pode-se também utilizar o vácuo e temperatura em torno de 50°C, o que causa melhora significativa em sua resposta. ● Métodos por destilação Existe a mais de 70 anos, porém deixou de ser utilizado devido a sua demora de resposta. No entanto, esse método protege a amostra contra a oxidação pelo ar e diminui a decomposição por altas temperaturas, o que permite sua utilização em substâncias com muitos componentes voláteis, que são recolhidos e separados da matéria orgânica. Inicia-se com a pesagem do material com quantidade de água entre 2 e 5 mL, em seguida coloca-se a amostra em frasco com solvente com ponto de ebulição superior ao da água. No condensador, deve-se aquecer o frasco até que sejam observados os dois níveis separados, água e solvente, nessa ordem. A água deve ser retirada das paredes com um fio de cobre em espiral, lavando o fio com tolueno dentro do frasco coletor. Após, deve-se destilar por mais 5 minutos, deixar esfriar e fazer a leitura de volume de água, com precisão de até 0,01 mL. Apesar de relativamente simples, o método enfrenta algumas dificuldades, como precisão relativamente baixa do frasco coletor, dificuldades na leitura do menisco, aderência de gotas de água no vidro, solubilidade da água no solvente de destilação, evaporação incompleta da água e destilação de produtos solúveis em água. Também é importante verificar alguns pontos como utilização de solventes de tolueno (PE = 111°C) tetracloroetileno (PE = 121°C) e xileno (PE = 137°C), lavar o equipamento com solução de ácido sulfúrico-dicromato, enxaguar em água destilada e com álcool seco após cada uso, calibrar frasco coletor com destilações sucessivas e quantidades de água conhecidas e, 24 escolher frasco coletor de acordo com o volume de água , grau de calibração, facilidade de escoamento, entre outros. ● Métodos químicos O método mais utilizado para alimentos é através do reagente de Karl-Fischer, composto de iodo, dióxido de enxofre, piridina e um solvente que pode ser metanol, piridina, dioxano e dimetil formamida. Consiste em titulação visual ou eletrométrica, com coloração amarelo canário onde o I2 é reduzido para I na presença de água, até todo o consumo da mesma, obtendo coloração amarelo-marrom, pelo iodo em excesso. O reagente Karl Fischer tem alto poder dissecante, portanto a amostra e o reagente utilizado devem ser protegidos contra a umidade atmosférica, e alguns pontos devem ser observados, como o método de titulação não deve ser aplicado em substâncias que reagem com o iodo por causar modificação do material e, alguns vegetais desidratados, contém aldeídos e cetonas vivos que ao reagirem com o metanol, produzem água. É mais usado quando amostras não apresentam resultados consideráveis pelo método de secagem a vácuo, com análise, em sua maior parte, de vegetais desidratados, balas, chocolates, café torrado, óleos e gorduras e, em produtos açucarados como mel, e produtos ricos em açúcares e proteínas, como cereais. Pode ser aplicado em produtos com umidade intermediária, como pães, misturas para bolo e produtos com altos níveis de óleos voláteis. ● Métodos físicos ➔ Radiação infravermelha: a medida da absorção da radiação em comprimentos de onda obtém a quantidade de água, sensível em larga gama de materiais orgânicos e inorgânicos; ➔ Cromatografia gasosa: aplicada em faixa de umidade de 8 a 56%, como cereais, frutas e seus derivados por 5 minutos, com diferença de método padrão de secagem a cada alimento; ➔ Ressonância nuclear magnética: equipamento caro e sofisticado que fornece medidas precisas, e muito rápidas, de aproximadamente 1 minuto, sem destruir a amostra. Também pode ser usada para determinação de gordura, simultaneamente. ➔ Índice de refração: feito no refratômetro baseado na medida do ângulo de refração da amostra. É bastante simples, porém menos preciso que os demais; ➔ Densidade: mais usado em amostras com alto teor de açúcar, em que a quantidade de água é medida pela densidade. É um método, simples e barato, porém pouco preciso; ➔ Condutividade elétrica: baseado na quantidade de corrente elétrica que passa em um alimento, em relação a quantidade de água, sendo proporcional. É um método muito rápido, aproximadamente 1 minuto, mas pouco preciso; ➔ Constante dielétrica: é baseado na constante dielétrica da água em relação aos alimentos, uma vez que amido, proteínas e componentes similares tem constante dielétrica de cerca de 10, e a água de 80. Portanto, qualquer 25 mudança, ainda que pequena na quantidade de água, causa uma alteração, com resposta muito rápida, mas pouca precisão. Os dois últimos métodos, por serem elétricos, podem ter suas medidas afetadas pelas texturas dos alimentos, tipo de embalagem, teor de metais, temperatura e distribuição de água. Apesar de serem bastante utilizados na avaliação de matéria-prima, deve-se aplicar a correção da temperatura e calibração específica a cada tipo de alimento. 5. Minerais nos alimentos Mineraisdos alimentos, são também conhecidos como cinzas, que é o resíduo inorgânico, em que átomos de carbono não estão ligados a átomos de hidrogênio, que permanece após a queima da matéria orgânica em temperatura de 550 a 570°C, transformando-se em CO2, H2O e NO2, para a análise de fins nutricionais e segurança alimentar, como em casos de resíduos metálicos ou presença de contaminação química e biológica. A cinza é constituída por macronutrientes, que em uma dieta são requeridos acima de 100 mg diários, na forma de K, Na, Ca, P, S, Cl e Mg, como micronutrientes, requeridos em um dieta abaixo de 100 mg diários, na forma de Al, Fe, Cu, Mn e Zn e, como elementos traços, que se encontram em pequenas quantidades nos alimentos , alguns necessário e outros tóxicos, que se apresentam na forma de Ar, I, F, Cr, Co, Cd e outros elementos. A cinza que é obtida não é necessariamente parte da matéria orgânica presente originalmente no alimento, uma vez que pode ocorrer perda por volatilização ou interação entre os constituintes, apresentando-se como elementos minerais, na forma de óxidos, sulfatos, fosfatos, silicatos e cloretos, a depender da condição de incineração e composição do alimento. Nesse processo, algumas mudanças podem ocorrer devido ao aquecimento modificar alguns componentes por meio de reação química, como é o caso do oxalato de cálcio, que pode se transformar em carbonato ou em óxido. A composição de um mineral varia para cada alimento, de acordo com o método empregado. 5.1. Classificação dos minerais São encontrados na composição de tecidos animais e vegetais, apresentando-se como micronutrientes, quando essenciais e não sintetizados pelo organismo, sendo necessário sua reposição pela ingestão de alimentos que contenham esses componentes. São divididos em seis grupos diferentes, porém os mais importantes e conhecidos são os macrominerais, microminerais e elementos traços. ● Macrominerais: ➔ Potássio: tem a função de manter a pressão osmótica especialmente em líquidos intersticiais, facilitando o transporte de água nos tecidos. É encontrado em frutas, hortaliças, batatas, carnes e leite, sendo necessária a ingestão diária de 2000 mg para uma pessoa adulta. Sua carência causa debilidade muscular, letargia e transtorno da função cardíaca, e seu excesso 26 é eliminado na urina em funções renais normais, podendo causar perda de peso. ➔ Sódio: cria pressão osmótica nas células através da retirada de água dos tecidos, reduzindo a tensão e regulando metabolismo hídrico, auxilia na contração muscular e em processos metabólicos. É encontrado no sal marinho, sal gema, alimentos salgados e água mineral, sendo necessária a ingestão diária de 550 a 2000 mg. Sua carência causa dores de cabeça, problemas de circulação e câimbras musculares, e seu excesso provoca hipertensão. ➔ Cálcio: necessário na formação de ossos e dentes, no funcionamento do sistema nervoso e muscular e na coagulação do sangue. É encontrado em leites e derivados, frutas secas, legumes e espinafres, com maior aproveitamento quando em conjunto com proteínas e vitamina D, sendo necessária a ingestão diária de 800 mg para uma pessoa adulta. Menos de 40% de cálcio é absorvido pelo organismo, e sua carência causa degradação dos ossos, raquitismo, excitação de nervos e músculos, e seu excesso pode formar cálculos renais. Por estar intimamente ligado ao fósforo, a dieta deve ser balanceada para que não haja maior ingestão de fósforo. ➔ Fósforo: em conjunto com o cálcio, participa na formação dos ossos e dentes, é componente das enzimas e participa da transformação energética do metabolismo. É encontrado em carnes e derivados, leites e derivados, ovos, pescados, cereais e bebidas de cola, sendo necessária a ingestão diária de 1200 a 1500mg para uma pessoa adulta. Sua carência prejudica a absorção de cálcio. ➔ Enxofre: protagonista dos fenômenos biológicos celulares, possui funções energéticas, plásticas e desintoxicação, com importância em tecidos densos, como cartilagens, cabelos e unhas, e são fundamentais na constituição das secreções mucosas, humor vítreo, fluido sinovial e na síntese de colágeno. É encontrado em carnes, leites, ovos, queijos, cereais e frutas secas, sendo necessária a ingestão diária de 850 mg. Sua carência pode desenvolver asma, erupções, cefaléia e reumatismos. ➔ Cloro: mantém a pressão osmótica das células, o funcionamento da função renal e é um componente do suco gástrico. É encontrado em alimentos salgados, com presença de cloreto de sódio (NaCl), sendo necessária a ingestão diária mínima de 830mg. Sua carência causa dores de cabeça, cãibras musculares e má circulação. ➔ Magnésio: essencial para a formação dos ossos, atividade muscular e nervosa, e para processo metabólicos. É encontrado em cereais, legumes, laticínios, hortaliças, frutas secas e água mineral, sendo necessária a ingestão diária de 300 a 350 mg para uma pessoa adulta. Sua carência causa transtornos metabólicos e excitação muscular. ● Microminerais ➔ Alumínio: Encontrado em alguns tipos de chá e ervas e alguns condimentos. Seu excesso pode causar doenças neurológicas como Mal de Parkinson, Mal de Alzheimer, escleroses, demência, doenças ósseas, obesidade e câncer de 27 mama. Sua ingestão diária máxima recomendada é de 2mg/kg em relação ao peso corporal. ➔ Iodo: responsável pela síntese de hormônios da tireóide. É encontrado em pescados marinhos, vísceras, leite e ovos, sendo necessária a ingestão de 0,18 a 0,20 mg. Sua carência pode causar aumento da tireóide e formação de bócio, e seu excesso o hipertireoidismo. ➔ Ferro: participa dos pigmentos do sangue, como hemoglobina e atua no transporte de oxigênio. É encontrado em carnes e derivados, vísceras, cereais integrais e espinafre, sendo necessária a ingestão diária de 10 a 15 mg para uma pessoa adulta. Sua carência pode causar anemia, cansaço e debilidade muscular, e seu excesso, pardeamento da cor da pele e transtornos hepáticos. A vitamina C auxilia na absorção, enquanto que o café e chá preto, dificultam, devido a formação de sais com tanino. ➔ Cobre: componente de muitas enzimas que catalisam o processo de oxidação e redução e também participa do metabolismo do ferro. É encontrado em vísceras, fígado, pescados, cacau e hortaliças verdes, sendo necessária a ingestão diária de 1,5 a 3,0 mg. Sua carência pode causar doenças sanguíneas, conteúdos elevados de ferro no fígado e alteração na cor do pelo. ➔ Manganês: constitui diversas enzimas que participam do metabolismo dos carboidratos, aminoácidos e colesterol, funciona como antioxidante e colabora na função de cartilagens e ossos. É encontrado cereais integrais, nozes, leguminosas, abacaxi e chás, sendo necessária a ingestão diária de 2,3 mg para homens adultos e 1,6 mg para mulheres. Sua carência pode interferir no crescimento e causar anormalidades do esqueleto, menor tolerância à glicose e alterações no metabolismo dos carboidratos e gorduras. ➔ Zinco: auxiliar de enzimas. É encontrado em vísceras, carne magra, laticínios, pescados e moluscos, sendo necessária a ingestão diária de 12 a 15 mg. Sua carência causa dificuldade no crescimento, falta de apetite, dificuldade na cicatrização e maior vulnerabilidade a infecções. ● Elementos traços ➔ Cromo: participa do metabolismo de hidratos de carbono. É encontrado em elaborados de carnes, leveduras de cervejas, queijos e cereais integrais, sendo necessária a ingestão diária de 50 a 200 μg, na forma de cromo trivalente. Não se conhece consequência da ausência ou falta, porém na forma hexavalente, usado em indústrias químicas, é cancerígeno. ➔ Flúor: estabiliza os ossos e endurece o esmalte dental, prevenindo cáries. É encontrado em pescados marinhos, cereais, vísceras, água e chá preto, sendo necessária a ingestão diária de 1,0 mg. Sua carência pode causar atrofia óssea e tendência à formação da cárie dental, e seu excesso é tóxico, porém por sua baixa concentração em alimentos, sua ingestão exagerada é pouco provável. 28 5.2. Fontes de minerais A Organização Mundial da Saúde(OMS), reconhece o papel de 18 tipos de minerais como necessários ao bom funcionamento do organismo. São elementos inorgânicos combinados a outro elemento químico, como óxido, carbonato, sulfato, entre outros. No corpo humano essas combinações se apresentam de forma mais complexa, combinados com outros constituintes orgânicos, formando o que é chamado de quelação. Entre os minerais mais conhecidos, temos o cálcio, um macroelemento com grande participação na constituição do organismo, ocupando 1100 a 1200 g, com 90% alocados no esqueleto. Auxilia na liberação de neurotransmissores no cérebro, mantém ossos e dentes fortes, e está presente na maioria dos tecidos, sobretudo nos músculos e plasma sanguíneo, que realizam trocas entre si, mantendo o equilíbrio. Participa na permeabilidade da membrana celular, na coagulação do sangue e nas contrações das fibras musculares lisas. A quantidade de cálcio presente no sangue é conhecida por calcemia, resultado da absorção do cálcio no intestino delgado e reabsorção óssea, e da deposição nos ossos e perdas pela urina. No entanto, a calcemia não deve ser usada como indicativo de uma patologia por deficiência de cálcio, uma vez que a osteoporose, uma das doenças que melhor representa essa deficiência, não precisa de alteração na taxa de cálcio para se manifestar. A regulação do nível de cálcio no organismo se dá através do hormônio paratormônio, secretado pelas glândulas paratireóides e pela vitamina D. Algumas interações entre componentes, gera um desequilíbrio na disponibilidade única de cálcio, como por exemplo, uma alimentação com proteínas em excesso, que aumenta a liberação cálcica pela urina, ou a ingestão de alimentos ricos em ácido oxálico e fítico aumenta a formação de sais insolúveis, prejudicando a taxa de cálcio disponível, bem como a cafeína, álcool e alguns medicamentos. A hipocalcemia, carência profunda de cálcio, costuma acontecer raramente. No entanto, carências moderadas são frequentes, com sintomas como formigamentos, agulhadas e entorpecimento dos membros e contrações musculares, apresentando-se como raquitismo, retardamento do crescimento e osteoporose, a nível ósseo. O inverso também acontece e é chamado de hipercalcemia, com sintomas como aumento na necessidade de urinar, formação de cálculos renais, perda de apetite e sonolência, que se não tratada, irá se desenvolver em câncer com metástase óssea, hiperparatireoidismo e insuficiência renal. Normalmente, o consumo de cálcio diário é de 500 a 600mg, com aumento no período da gravidez para 1500 mg/dia. Outro mineral classificado como essencial, é o fósforo, que se encontra no organismo na combinação com o cálcio, formando o esqueleto, e em tecidos moles, como músculos, o fígado e o baço, no teor de 10%. Este mineral também sofre influência da vitamina D e do paratormônio, compõe a estrutura celular, com maior incidência nos fosfolipídeos, participa de atividades enzimáticas e fornece energia na forma de ATP (adenosina trifosfato). O fósforo é abundante nos alimentos, notadamente na presença do cálcio, como leite, queijos e frutas secas, mas também em peixes e ovos, e portanto, seus níveis no organismo são de grande importância. A carência se apresenta de diversas formas, desde a dificuldade na absorção da alimentação parenteral, alcoolismo, jejuns prolongados ou desnutrição, perdas digestivas, como diarréias e vômitos, e precipitação do suco gástrico em tratamentos prolongados, e seus sintomas costumam ser a diminuição dos reflexos, formigamentos, fraqueza muscular e distúrbios de atenção. Com grande importância na atividade hormonal e na contração e relaxamento dos músculos, o magnésio é o cátion intracelular com maior importância depois do potássio. 29 Regula mais de 300 reações enzimáticas, intervém na duplicação dos ácidos nucléicos, agindo sobre as trocas iônicas da membrana celular, com boa parte fixada nos ossos na forma de fosfato e bicarbonato, e outra na composição da massa molecular e na fração sanguínea, onde está ligada às proteínas. Um desequilíbrio na disponibilidade de magnésio no organismo, pode afetar o metabolismo, crescimento, proliferação celular e a função cardíaca, sendo a única forma de reduzir certas arritmias. Sua carência causa hiperexcitação neuromuscular, que aumenta ainda mais sua perda, pelo alto nível de estresse. A perda ocorre pela intoxicação por chumbo, uso de alguns medicamentos diuréticos, problemas intestinais, alimentação parenteral, pancreatite, diabetes e alta ingestão de álcool e alimentos lipídicos. 5.3. Importância dos minerais nos alimentos Alimentos naturais, de origem vegetal e animal são as principais fontes dos minerais, que se apresentam na forma de um complexo orgânico natural. Estão presentes em pequenas quantidades no corpo humano, porém, por não serem sintetizadas por seres vivos, o organismo é incapaz de realizar sua reposição. No entanto, apenas pela ingestão desses alimentos não é suficiente para atender as necessidades do organismo, levando inevitavelmente a busca por suplementos. Em um processo conhecido como quelação, onde os aminoácidos envolvem o mineral, impedindo este de reagir com substâncias vizinhas, ocorre a absorção pela corrente sanguínea, após a transformação de composto inorgânico para orgânico. Quando acontece, esses aminoácidos que participam na digestão da proteína, em conjunto com demais minerais, como cálcio, ferro, entre outros, são absorvidos de forma mais eficiente e até mesmo superior a diversos suplementos encontrados no mercado. Minerais auxiliam na manutenção e funcionamento do corpo humano, prevenindo e combatendo doenças, desde anemias, até casos mais graves, como alguns tipos de câncer e distúrbios neurológicos. Além disso, formam grande parte das estruturas ósseas, pigmentação da pele e pelos, constituição de cartilagens, permitindo a movimentação livres de tensão, sendo primordial para o desenvolvimento em fases iniciais de crescimento e na reposição dos potenciais perdidos pela idade. São ótimos reguladores do sistema imune, elevando a resposta defensiva do organismo, conferindo maior resistência a infecções e até mesmo, a degradação de substâncias prejudiciais, como as gorduras responsáveis pelo aumento do colesterol LDL. Alguns elementos têm sua ação melhorada quando em conjunto, como é o caso do cobre, que auxilia na absorção do ferro, e do cálcio, que tem sua ação potencializada quando na presença do mineral fósforo, sendo primordial a presença, no caso inverso. Apesar de serem auxiliadoras, essas interferências podem dificultar a absorção, uma vez que se tornam competitivos em seus mecanismos de ação, ou perdem sua totalidade por serem envolvidos no metabolismo da reação de outros componentes. Outra aplicação importante, é o uso dos minerais para a fortificação dos alimentos, de forma que ao receber tratamento especificado, o alimento apresenta maior disponibilidade na reposição de seu mineral de origem. O cálcio vem sendo amplamente utilizado nesse processo, na fortificação de leites e derivados, devido a grande demanda de dieta modificada, por mulheres na fase adulta. No entanto, devido a competição entre os compostos, a maior ingestão de um, pode acarretar na deficiência de outro, gerando um efeito adverso. 30 5.4. Determinação de minerais em alimentos – cinzas ou resíduo mineral A metodologia aplicada na determinação de cinzas em alimentos pode ser dividida em duas partes, a determinação da cinza bruta, total, solúvel e insolúvel, e a determinação dos componentes individuais presentes na cinza. 5.5. Queima seca e queima úmida (métodos clássicos e por micro-ondas) ● Cinza seca Mais usada para determinar cinzas totais, cinza solúvel em água e insolúvel em ácido e na determinação de metais mais conhecidos que aparecem com maior frequência. Simples e para análises de rotina, é um processo lento, mas pode-se usar catalisadores, como glicerina, álcool e oxidantes químicos, ou deixar a temperaturas mais baixas durante a noite, para acelerar. Não reage bem a altas temperaturas,com alta taxa de volatilização, e algumas reações entre os metais e componentes podem ocorrer, bem como entre eles e o cadinho, devido ao seu material. Pode-se usar amostras muito grandes e tem alta sensibilidade para amostras naturais. Durante sua realização é necessário uma maior supervisão. A quantidade amostra será de acordo com o tipo de alimento, sendo 3 a 5g para cereais, queijos e leite, 5 a 10g para açúcar, carnes, legumes e vinho, 25g para sucos, frutas frescas e enlatadas, e 10g para geléias, xaropes e doces em massa. Os alimentos também devem receber pré tratamento de acordo com seu estado físico. Líquidos ou amostras úmidas precisam estar secas, e devem ir para a estufa até que esteja completamente livre de umidade. Alimentos com grande quantidade de matéria volátil, como condimentos, devem ser aquecidos aos poucos, até que comece a fumegar, sem queimar, para evitar perdas de minerais, gorduras também devem ser aquecidas lentamente, evitando-se o excesso de chamas. Peixes e animais marítimos gordurosos, devem ser incinerados inicialmente a baixas temperaturas até que comece a fumegar sem queimar. Queijos, necessitam da adição de algodão absorvente, com quantidade de cinza conhecida, que deve ser incinerado evitando-se respingos. Produtos como a manteiga, com muita gordura, necessitam de extração da amostra seca por um solvente orgânico, como éter etílico ou éter de petróleo, antes da incineração. Produtos açucarados têm tendência a formar espuma, portanto, é necessário que se adicione uma pequena quantidade de vaselina ou azeite de oliva, que por não possuírem teor de cinzas, auxiliam no controle durante a incineração. Em métodos oficiais, esses produtos devem ser secos a 100°C, em banho maria ou estufa, para adicionar posteriormente, algumas gotas de azeite puro, para depois iniciar a incineração. O procedimento se inicia com a escolha do material do cadinho, de acordo com a análise e tipo de alimento, sendo os mais comuns os de quartzo, Vycor, porcelana, aço, níquel, platina e uma liga de ouro platina. Em seguida, o cadinho deve ser incinerado, esfriado e tarado, respectivamente, para receber 5g da amostra. Após, o conjunto deve ser incinerado em uma mufla iniciando a uma temperatura mais baixa e depois de acordo com o tipo de alimento: ➔ 525 ºC: frutas e produtos de frutas, carne e produtos cárneos, açúcar e produtos açucarados e produtos de vegetais; 31 ➔ 550 ºC: produtos de cereais, produtos lácteos (com exceção da manteiga) ➔ 500 ºC), peixes e produtos marinhos, temperos e condimentos e vinho; ➔ 600 ºC: grãos e ração. Deve permanecer no equipamento até completa carbonização, que pode ser validado pela observação da coloração da amostra, sendo branca ou cinza. Em alguns casos esse período pode ser muito longo, então deve-se molhar o conteúdo, para posterior secagem e aquecimento até que se obtenha a coloração branca. Ao atingir essa etapa, a amostra deve ser levada ao dessecador para esfriar, e posteriormente pesada juntamente com o cadinho, evitando-se a perda, utilizando de um vidro de relógio. A pesagem deve descontar o valor do cadinho tarado no início do processo. ● Cinza úmida Utilizada para a determinação de minerais individualmente, elementos traços que podem ter se perdido na cinza seca, e para metais tóxicos. Pode ser usada em baixas temperaturas, o que reduz a perda por volatilização, é um processo rápido, que não usa reagentes com grande potencial corrosivo, porém não pode ser aplicado em amostras grandes, necessita de supervisão e de branco, e não é prático para ser usado como método de rotina. Para a decomposição, é utilizado um ou mais ácidos, a depender da característica da amostra. ➔ Ácido sulfúrico: agente oxidante fraco, com maior tempo para a decomposição completa. Como solução, pode-se adicionar sal como o sulfato de potássio, que vai aumentar o ponto de ebulição, tornando a reação mais rápida. ➔ Ácido nítrico: bom oxidante, mas pode ser evaporado antes da oxidação completa, o que pode comprometer a reação. Pode causar a formação de óxidos insolúveis. A mistura dos dois ácidos, permite maior eficiência no processo, principalmente em amostras vegetais. Amostras ricas em açúcares e gorduras, devem ser embebidas em H2SO4- e em seguida adicionar uma pequena quantidade de HNO3, com aquecimento entre as duas etapas. No final, para a completa decomposição, pode-se adicionar H2O2. Amostras com proteínas e carboidratos, sem gorduras, é usada a mistura HNO3-HClO (ácido perclórico), que deve ser feita cuidadosamente, por ter alto índice de explosão. Em grãos de trigo, a mistura HNO3 + 70% HClO4, na proporção de 1:2 acelera a reação de decomposição em relação a mistura usual de HNO3 +H2SO, de 8 horas para 10 minutos. Após obter a cinza úmida, podemos determinar os componentes individualmente, por meio de absorção atômica, emissão de chama, colorimetria, turbidimetria e titulometria. A maioria desses métodos, com exceção do último, que pode ser realizado facilmente em laboratório, requer o uso de equipamentos sofisticados. 5.6. Cinzas solúveis e insolúveis Esse método é usado como indicativo de várias propriedades, como índice de refinação de açúcares e farinhas, onde a quantidade prejudica diretamente sua extração, e 32 um valor muito alto dificulta a cristalização e descoloração do açúcar. Propriedades funcionais dos alimentos podem ser avaliadas, a exemplo da gelatina, geléia de frutas e doces em massa, em que sua determinação permite conhecer o conteúdo na parte de frutas. O valor nutricional de alimentos e rações está diretamente ligado ao teor de cinzas, permitindo a identificação de areia pela análise da insolubilidade em ácido. A saber, os minerais, em relação ao funcionamento do organismo, são classificados como indispensáveis, se influem diretamente no metabolismo, constituindo elementos essenciais em uma dieta, e em elementos sem função conhecida, chegando até mesmo, a serem prejudiciais. Esses podem ser encontrados no solo, após a pulverização de agrotóxicos ou por resíduos industriais, com efeito tóxico, afetando reações químicas de vitaminas, como é o caso do Cu, que causa desestabilização e sucos de fruta de laranja, pela oxidação do ácido ascórbico, e da fermentação que sofre alteração na presença de determinados minerais. 33 6. Conclusão A análise bromatológica tem grande importância na avaliação da segurança e qualidade dos alimentos, sendo elemento principal para conhecer os efeitos no organismo, e suas composições. No ramo da pesquisa, tem papel fundamental na elaboração de novas tecnologias e na avaliação de métodos já usados. Pelos métodos empregados é possível rastrear toda a cadeia produtiva de um alimento, garantindo confiança nas informações prestadas ao consumidor. Pela observação, as mudanças sensoriais que comprometem as características de um alimento podem ser revertidas, o que permite a adoção de medidas eficazes, proporcionando maior conservação e evitando a deterioração precoce. As composições químicas dos alimentos têm grande importância na elaboração de rótulos, garantindo escolhas mais seguras pelos consumidores. 34 Referências https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/4655991/mod_resource/content/1/05_Desenvolvime nto%20e%20Valida%C3%A7%C3%A3o%20de%20M%C3%A9todos_Francielle.pdf http://www.portalaction.com.br/validacao-de-metodologia-analitica/116-limite-de-quantificaca o http://bvsms.saude.gov.br/bvs/saudelegis/anvisa/2003/res0899_29_05_2003.html http://abrapaalimentos.com.br/documentos/simposio%209/Palestras/Palestra1-LaercioGoula rte.pdf https://www.passeidireto.com/arquivo/37508726/metodos-de-analise-dos-alimentos https://www.passeidireto.com/arquivo/6560211/teor-de-umidade-em-alimentos http://www.unisalesiano.edu.br/biblioteca/publicacoes/bromatologia.pdf https://wp.ufpel.edu.br/nutricaobromatologia/files/2013/07/NormasADOLFOLUTZ.pdf https://www.opuspesquisa.com/blog/tecnicas/amostragem/ http://www.de.ufpb.br/~luiz/Adm/Aula9.pdf https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/1204142/mod_resource/content/1/Andrade%202003
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