Técnica do número mais provável

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Técnica do número mais 
provável 
O QUE PERMITE ESTIMAR? 
➤método que permite estimar a densidade de 
micro-organismos viáveis presentes em uma 
amostra sob análise 
➤permite calcular o número de 
microrganismos específicos numa amostra de 
agua ou alimento com uso de tabelas de 
probabilidade 
➤estimativa= confirmação da presença de 
microrganismos procurado deve ser feita em 
meio seletivo 
PRINCÍPIO 
➤A determinação do número de micro-
organismos é baseada no princípio de que, 
subdividindo a amostra em alíquotas, algumas 
alíquotas vão conter os micro-organismos e 
outras não, dependendo da quantidade 
existente na amostra. 
➤Parte da premissa de que os microrganismo 
a serem contados estão distribuídos ao acaso 
pela amostra 
O QUE NÃO PERMITE 
➤Esta técnica não permite a contagem "fixa" 
de células viáveis oumde unidades 
formadoras de colônias (UFC), como 
acontece com a técnica de contagem em 
placas – o que permite é estimar por cálculo 
de probabilidade a densidade original de 
micro-organismos na amostra. 
BENEFÍCIOS 
➤Técnica bastante versátil. 
➤Pode ser utilizada para diferentes grupos: 
• Coliformes a 35 °C e 45 °C e E. coli 
• S. aureus 
COMO ACONTECE 
➤A amostra a ser analisada é 
homogeneizada e submetida a diluições 
seriadas → de cada uma dessas diluições → 
alíquotas iguais são transferidas para três ou 
para cinco tubos contendo o meio de cultura 
escolhido, indicado para o microrganismo 
desejado, e um tubo coletor de gas (tubo de 
Durhan) →todos os tubos são incubados → 
em seguida, os positivos são identificados → 
os tubos positivos são aqueles que 
apresentarem crescimento → identificados 
pela turbidez do meio e produção de gas de 
fermentação → a densidade bacteriana é 
determinadas pela combinação de resultados 
positivos e negativos numa tabela que fornece 
NMP do microrganismo pesquisado por grama 
da amostra (NMP/g), entre um limite inferior e 
um superior de confiabilidade 
PRECISÃO DO MÉTODO 
➤Pode ser melhorada com aumento do 
número de tubos em cada diluição 
➤Quanto maior o número esperado de 
microrganismos pesquisado = maiores 
deverão ser as diluições usadas 
ETAPAS 
A)PREPARO DA AMOSTRA 
1. usar técnica asséptica durante os 
procedimentos de manuseio do 
alimento 
2. Desinfetar a superfície de trabalho com 
álcool 70% 
3. Antes de abrir qualquer embalagem, 
limpar área em volta do local de onde 
será retirada a amostra com álcool 70% 
4. Amostras liquidas e semi liquidas, em 
frascos com espaço suficiente para 
agitação, devem ser homogeneizadas 
antes da retirada da unidade analítica, 
invertendo-se a embalagem 25 vezes. 
Retirar a alíquota a 2,5 cm abaixo da 
superfície 
1. Amostras desidratadas devem ser 
misturadas assepticamente com uma 
colher esterilizada 
2. Sólidos e semissólidos devem ser 
pesados (25g) e diluídos em 225 ml de 
agua peptonada 0,1% 
3. Homogeneizar em “stomacher” em 2 
minutos 
B) DILUIÇÃO 
1. Proceder a diluição da amostra e o 
plaqueamento, simultaneamente 
2. As diluições devem ser 
homogeneizadas em agitador do tipo 
vórtex 
3. 25g do alimento →225 ml de agua 
0,1% peptonada → homogeneização 
de 2 minutos → diluição seriada em 
agua peptonada 0,1% → ágar 
• Mesofilos aeróbios- ágar PCA 
• Fungos filamentosos e leveduras – 
ágar BDA 
NMP DE COLIFORMES (TESTE 
PRESUTIVO) 
➤Visa detectar a presença de micro-
organismos fermentadores de lactose. 
➤Princípio: 
• Meio de cultura rico em nutrientes → 
rápido crescimento 
• Única fonte de carbono: lactose → 
fermentação → gás 
• Lauril sulfato: inibe a microbiota 
acompanhante 
1. Inocular em 3 séries de 3 tubos com caldo 
LST (Lauril sulfato triptose) e os tubos de 
Durham invertidos a alíquota de 1 mL de cada 
uma das diluições preparadas anteriormente. 
2. Incubar a 35 °C/24-48h. 
3. Observar os tubos positivos (produção de 
gás nos tubos de Durham) após 24 h. Incubar 
os tubos negativos por mais 24h e anotar o 
resultado. 
 
NMP DE COLIFORMES 35 °C (TESTE 
CONFIRMATIVO) 
➤Princípio 
• O “caldo verde brilhante lactose bile 
2%” contém inibidores (bile e verde 
brilhante) da microbiota Gram positiva; 
• Única fonte de carbono: lactose 
• Assim, a produção de gás indica o 
desenvolvimento de bactérias gram-
negativas fermentadoras de lactose, 
que são os coliformes. 
 
1. Após verificar quais diluições foram 
positivas, transferir uma alçada dos tubos de 
caldo LST para os tubos de caldo Lactose-
Verde Brilhante (possui substancia que limita 
crescimento de bactérias que não sejam gram 
negativas) 
2. Incubar a 35 °C/48h. 
3. Observar os tubos positivos (produção de 
gás nos tubos de Durham). 
4. Comparar a sequência de tubos positivos e 
consultar a tabela de NMP para verificação do 
NMP/g ou mL de sua amostra. 
NMP DE COLIFORMES A 45 °C 
1. Após verificar quais diluições foram 
positivas, transferir uma alçada dos tubos de 
caldo LST para os tubos de caldo EC. 
2. Incubar a 45 °C/24h. 
3. Observar os tubos positivos (produção de 
gás nos tubos de Durhan). 
4. Obter o NMP usando a tabela para diluições 
em séries de três tubos e expressar o 
resultado como NMP/ g ou mL de coliformes a 
45° C. 
PLAQUEAMENTO 
➤Método mais comum de determinar o 
numero de microrganismos 
➤Considera-se que uma célula microbiana ou 
um gruoi de células viáveis (Unidades 
Formadoras de Colônias -UFC) da origem a 
uma colônia a qual se desenvolve na 
superfície ou no meio do agas contido na 
placa petri 
➤Amostra deve ser diluída adequadamente, 
semeada nas placas e incubada por 
determinado tempo de acordo com o 
microrganismo pesquisado 
➤As características do meio de cultura como 
presença de nutrientes, pH e as condições de 
incubação (temperatura, tensão de oxigênio) 
são fatores determinantes no 
desenvolvimento de microrganismos e na 
formação de colônias. 
CONTAGEM EM PLACAS PETRIFILM 
PARA COLIFORMES À 35OC E E. COLI 
➤A Placa 3MTM PetrifilmTM para Contagem 
de E. coli/Coliformes é um sistema de meio de 
cultura pronto para uso. 
➤Estas placas fornecem informação de 
contagem de E. coli e coliformes totais, com 
resultados confirmados em apenas 24 a 48 
horas. 
1o Levante o filme protetor e adicione a 
alíquota da diluição apropriada da amostra. 
2o Incubar à 35oC por 24 a 48h. 
3a Interpretação: Conte as colônias. 
Coliformes confirmados apresentam-se como 
colônias vermelhas ou azuis com bolhas de 
gás associadas. E. coli confirmada apresenta-
se como colônias azuis com bolhas de gás 
associadas. 
MESOFILOS AERÓBIOS 
➤Será adotada a Técnica pour plate ou 
profundidade – semeadura da alíquota de 
forma a permitir a mistura com ágar 
➤Alíquota de 1 ml 
➤Intervalo de contagem de 25 a 250 colônias 
1o Colocar 1 mL da diluição apropriada da 
amostra em cada placa. 
2o Adicionar o meio de cultura na temperatura 
d 45o C. 
3o Realizar a homogeneização da alíquota e 
do ágar PCA com movimentos de ‘em forma 
de 8’. 
4o Incubação: Incubar as placas invertidas, a 
36 ± 1°C, por 48 h. 
5o Leitura: Selecionar as placas que 
contenham entre 25 e 250 colônias. 
 
PLACAS PARA FUNGOS 
FILAMENTOSOS E LEVEDURAS 
➤Será adotada a Técnica spread plate ou 
superfície 
➤Alíquota de 0,1 ml 
➤Intervalo de contagem de 15 a 150 colônias 
1o Inocular 0,1 mL da diluição apropriada da 
amostra em cada placa. 
2o Realizar o espalhamento da alíquota no 
ágar com a alça de Drigalski previamente 
flambada. 
➤Lembre-se: deve-se aguardar o 
resfriamento da alça antes de conduzir o 
resfriamento. 
3o Incubação: Incubar as placas, sem inverter, 
a 25 ± 1°C, por 5 a 7 dias. 
4o Leitura: Selecionar as placas que 
contenham entre 15 e 150 colônias. 
➤OBS: Após o período de incubação não 
abrir, em hipótese alguma, as placas que 
contenham crescimento de fungos, para evitar 
a contaminação ambiental por meio da 
dispersão de esporos. 
CONTAGEM 
➤Para computar o número finalde micro-
organismos por mL ou por grama de alimento, 
considera-se a alíquota e a diluição usada. 
➤Por exemplo: Foi feita análise de um 
alimento sólido e constatou-se 30 colônias na 
placa após a incubação, quando foi utilizado 
0,1 mL de alíquota de uma diluição 10-4 
➤O cálculo é realizado da seguinte forma: 
 
➤O número de colônias provera de uma 
média das contagens em cada uma das 
placas (caso tenha mais de uma placa para a 
diluição) 
➤Caso nas duas diluições, a contagem das 
duas deu fora da faixa esperada: escolhe a 
menor diluição 
➤Caso nas duas diluições, a contagem das 
duas deu dentro da faixa esperada: escolhe a 
menor diluição 
➤Quanto mais diluído = menos concentrado 
= teoricamente o valor teria que ser menor em 
relação ao menos diluído