Testes sorólogicos

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Daniella Machado
		Turma XXVI
Testes Sorológicos– Módulo 2 Daniella Machado
Morfofuncional – 2º período UniEVANGÉLICA		Turma XXVI
Testes sorólogicos ou imunoensaios
São técnicas para detectar e quantificar antígenos e anticorpos ou outras substâncias que desempenham o papel de antígeno no ensaio.
Importância e parâmetros
· Doenças infecto-parasitárias
· Doenças cardíacas e tumores é diferente
· Métodos sorológicas
· São rápidos, simples de execução, possibilidades de automação e baixo custo operacional
ELISA (ensaio imuno enzimático)
Fundamentos dos testes sorológicos
Reação antígeno-anticorpo
Especificidade
Quantidade e persistência
Isotipo
Afinidade: força de ligação entre o antígeno e anticorpo
Avidez: somatório das afinidades das diferentes regiões, podendo se amadurecer (se ligando com mais força cada vez mais)
IgM (pentâmero, com avidez alta) para IgG
Importância da pesquisa de anticorpos no diagnóstico individual
Necessário testes com alta especificidade, capaz de excluir casos sem doença. 
Elucidar processos patológicos com sinais e sintomas confundíveis
Mononucleose típicas e atípicas
Hepatite C ou B
Sífilis secundária ou Dematomicoses
Elucidar a fase da doença
IgM – IgG
IgA e IgE – IgM em certas doenças
Teste de avidez da IgG – maturação da afinidade, quanto mais afinidade, mais velha a IgG. Como o toxoplasma, pico de IgM fica negativo e depois produção de IgG.
Reagudização
Na gestação o IgG decaí e a IgM basal sobe para responder ao toxoplasma e o toxoplasma se multiplica. IgM positivo e IgG positivo, olhar a avidez de IgG, sendo muito avida (madura), pouca avidez (pouco madura). A toxoplasmose pode resultar em uma má-formação e natimorto.
Fase crônica ou aguda?
Memória imunológica com a produção de IgG elevada basal
	Infecção mais antiga, a avidez é alta e na infecção recente (pelo menos 4 meses de infecção) ocorre – portanto – a depuração da IgG, indo de uma IgG de baixa avidez para uma de alta avidez, a avidez é mais baixa.
	IgM e IgG positiva = fase aguda, reinfecção/reagudização ou IgM demorada
	Avidez baixa: infecção aguda recente (menos de 4 meses)
Avidez alta: reinfecção ou reagudização, ocorreu depressão do sistema imune (medicamentos anticoagulantes, HIV, transplante de medula óssea)
IgM que dura 1 ano ou 1 ano e meio como a toxoplasmose: IgM persistente, a avidez alta confirma a IgM persistente, avidez alta, o paciente está contaminado
Diagnosticar doença congênita
IgM não travessa barreira placentária
IgM anti-T pallidum no cordão umbilical – infecção
IgG anti-T. pallidum no cordão umbilical – infecção ou transferência de IgG materna (dura 3 meses)
Selecionar doadores de sague
Testes com alta sensibilidade, capacidade de detectar e dar positivo quando está presente. Melhor jogar uma bolsa de sangue boa do que usar uma contaminada.
Tipagem sanguínea e anticorpos
A produção de anticorpos demora a começar, por causa da janela imunológica.
Selecionar doadores de órgãos para transplantes
Avaliar os antígenos A, B e DR, para ver se há compatibilidade com o MHC.
Avaliar prognóstico da doença
HbeAg induz a formação de Ac: bom prognóstico
Hanseníase: resposta humoral > celular: mau prognóstico
Avaliar a imunidade adquirida naturalmente ou induzida
Anti-HbsAg > 10 mUI/ml
Quantificar anticorpos para avaliar imunização
Importância dos testes sorológicos na pesquisa de antígenos
Fase pré-sorológica (janela imunológica)
Anticorpo+ antígeno+ material genético
Inquéritos epidemiológicos
Uso mais restrito.
Levantamento de Ag de plasmódios, pode dar reatividade cruzada (pode dar positivo para outra doença, como a toxoplasmose).
Marcadores tumorais
Painel antigênico característico de determinados tumores.
Critério de cura
· Ausência do patógeno e seus produtos
· Testes com alta sensibilidade
· Definição da etiologia da doença
Reações antígeno anticorpo
Fatores que influenciam reações sorológicas
pH, temperatura, tempo de reação
Tipos de resultados
Qualitativo, quantitativo, semi-quantitativo (+ até +++)
Testes sorológicos
Detecção e quantificação de antígenos ou anticorpos (ou outras substâncias que atuem como Ag no ensaio, como citocinas, hormônios e drogas).
Reagentes não-marcados
Sensibilidade menor (grandes complexos Ag-Ac para visualização da reação)
Reagentes marcados
Amplificação do sinal
Precipitação
Imunodifusão simples (Oudin,1946)
Método de baixa sensibilidade. 1 semana para obter resultados, anticorpos começa a ligar com os antígenos começam a precipitar. Grande concentração de Ag.
Imunodifusão dupla
Precipitação ocorre na região equivalência entre Ag-Ac
18-24 horas para resultados
Baixa sensibilidade
Pode ser empregado na pesquisa de auto-Ac 
Imunodifusão radial
Solução de Anticorpo é diluída no ágar
Experimento ocorre com soluções antígeno com concentrações conhecidas
Concentração de antígeno é proporcional ao raio do halo
Em torno de 24 horas
Aglutinação 
Formação de agregados visíveis como resultados da interação de Ac-Ag insolúveis
1º estágio: ligação de Ac e Ag
2º estágio: ligação cruzada de Ac e Ag, formação de agregados
Quantidades de reagentes 500x menor que a precipitação 
IgM>> IgG
Aglutinação direta
Partículas antigenicamente relacionadas
Reação Ag-Ac diretamente
Diluições do soro com concentrações constantes do Ag
Aglutinação indireta/passiva
Sensibilização de partículas inertes (látex, leveduras e etc)
É necessário um carreador
Efeitos
Efeito prozona
Tanto anticorpo que não ocorre pontes de ligação (se atrapalham sem equilíbrio), excessivamente positivo que é negativo. É necessário a diluição da amostra até encontrar o equilíbrio.
Efeito pós-zona
Vai diluindo até não conseguir achar a reação.
floculação
Teste Aglutinação de cristais de colesterol
VDRL (veneral diseases research laboratory), só para a sífilis, está em desuso por utilizar antígenos não treponêmicos, sendo usado no lugar imunocromatografia com antígenos treponêmicos.
Cristais de colesterol sensibilizados com cardiolipina e lecitina, dá muita reação cruzada
Pesquisa por anticorpos antitroponêmicos e anti-material lipídico eliminado durante a infecção
Hemaglutinação
A placa tem um fundo em V
As hemácias ficam espalhadas, quando isso não ocorre elas se precipitam no fundo da placa
Sem aglutinação: tem anticorpo, amostra negativa
Título de reação
Inibição da Hemaglutinação 
HcG HAI
Sarampo, influenza e enterovírus
	Se o anticorpo está ligado ao antígeno não aglutina e a hemácia se precipita. A ausência de aglutinação é positiva
Técnicas imunoenzimáticas
Imunoperoxidase
Para marcar as lâminas
Onde houver vírus irá reconhecer e “gruda”, onde há a degradação a placa fica marcado
A enzima quebra o peróxido e fica colorido
Ficou amarelo teve ligação antígeno anticorpo
tipos de ELISA 
Hepatite B
Imunizado ou não: possuí anticorpo, ELISA indireta, só vai ficar grudado o anticorpo no antígeno, o conjugado tem que ser um anti anticorpo para encontrar o anticorpo
Grávida: possuí antígeno, ELISA sanduíche, o que está grudado é o anticorpo com o antígeno do paciente. Anticorpo preso e o conjugado vai se ligar no antígeno de superfície
Lavar a placa com técnica, podendo alterar no resultado
Conjugado - enzima: anticorpo marcado, na região Fc
Tirar os conjugados que não foram ligados
Substrato: a enzima quebra o substrato e produz uma cor, sendo proporcional ao anticorpo (cor forte – muito anticorpo), quantificação do anticorpo. Quantificar o antígeno (reações inespecíficas). 
reação negativa reagindo o dia inteiro vira positiva, pinga ácido sulfúrico, do azul vai para o amarelo
A máquina analisa a cor, vendo se vai dar positiva ou negativa
ELISA de quarta geração vai identificar o vírus e anticorpo 
Usar ELISA para diferenciar tipos de anticorpos
Resuminho
Imunoflourescência
O método direto vem do paciente
O método indireto a lâmina é fabricada e o que vem do paciente é o anticorpo
Direta 
Pesquisa e localização de células ou macromoléculas em tecidos. Elevada sensibilidade e especificidade.Usa um conjugado para cada sistema
Indireta
Amplificação do sinal obtido pelos métodos diretos. Mais sensível, uso de um único conjugado para diferentes sistemas. Pesquisa de Anticorpo. Ag fixado em lâmina +amostra contendo anticorpo
Conjugado anti-Ac
Determinação de classe de AC
Imunocromatografia
Uma molécula que dá a cor, acúmulo do ouro coloidal acima da linha teste, tem a linha controle que vai colorir também.
Quimioluminescência
Os fótons são medidos através de um fotomultiplicador (PMT) que tem a função de transformar a luz emitida pelos fótons em impulsos elétricos.
Estes impulsos são lidos em “contagens” de luz por segundo. Essa unidade é proporcional a quantidade de antígenos presentes na amostra.
Para saber mais: site de telelab
Janela Diagnóstica
Período da contaminação até o teste que irá dar o laudo positivo. Se for sorológico a janela diagnóstica coincide com a janela imunológica.
Teste HIV
Com ELISA indireta
Partículas fragmentadas do HIV – soro do paciente – anticorpos anti-IgG conjugado à enzima – substrato enzimático
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