Dosagem de proteínas do leite pelo método do biureto.

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR
RELATÓRIO DA AULA PRÁTICA 7.
“DOSAGEM DE PROTEÍNAS DO LEITE PELO MÉTODO DO BIURETO”
Jéssica Das Mercês Neiva Silva – 90818
Paloma Malheiros Lemos Crissafe Dos Santos – 93126
Alicia Beatriz Moreira de Queiroz– 93129
Bianca Horta – 93119
Introdução:
Alimentos ricos em proteínas (Fonte desconhecida).
Proteínas são macromoléculas biológicas constituídas por uma ou mais cadeias de aminoácidos. As proteínas estão presentes em todos os seres vivos e participam em praticamente todos os processos celulares, desempenhando um vasto conjunto de funções no organismo, como a replicação de ADN, a resposta a estímulos e o transporte de moléculas. Muitas proteínas são enzimas que catalisam reações bioquímicas vitais para o metabolismo. As proteínas têm também funções estruturais ou mecânicas, como é o caso da actina e da miosina nos músculos e das proteínas no citoesqueleto, as quais formam um sistema de andaimes que mantém a forma celular. Outras proteínas são importantes na sinalização celular, resposta imunitária e no ciclo celular. As proteínas diferem entre si fundamentalmente na sua sequência de aminoácidos, que é determinada pela sua sequência genética e que geralmente provoca o seu enovelamento numa estrutura tridimensional específica que determina a sua atividade. 
Estrutura das proteínas(Fonte desconhecida)
 Uma proteína contém pelo menos uma cadeia polímérica linear derivada da condensação de aminoácidos, ou polipeptídeo. Os resíduos individuais de aminoácidos estão unidos entre si através de ligações peptídicas. A sequência dos resíduos de aminoácidos em cada proteína é definida pela sequência de um gene, a qual está codificada no código genético. Durante ou após o processo de síntese, os resíduos de uma proteína são muitas vezes alterados quimicamente através de modificação pós-traducional, a qual modifica as propriedades físicas e químicas das proteína s, o seu enovelamento, estabilidade, atividade e, por fim, a sua f unção. Em alguns casos as proteínas têm anexados grupos não peptídicos, os quais são denominados cofatores ou grupos prostéticos. As proteínas podem também trabalhar em conjunto para desempenhar determinada função, agrupando-se em complexos proteicos. As proteínas podem ser purificadas a partir de outros componentes celulares recorrendo a diversas técnicas, como a precipitação, ultracentrifugação, eletroforese e cromatografia. Entre os métodos usados para estudar a estrutura e funções das proteínas estão a imuno-histoquímica, mutagénese sítio-dirigida, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa.
Por serem formadas por aminoácidos e considerando-se que os aminoácidos aromáticos absorvem luz na região ultravioleta, as proteínas, em geral, podem ser detectadas através da absorção de luz a 270 nm. No entanto, a detecção de proteínas em materiais biológicos envolve reações específicas com determinados reativos, os quais originam substâncias coloridas que absorvem luz na região visível, permitindo a sua quantificação. Dentre os métodos utilizados, situa -se o método do biureto, que é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino(reativo do biureto) com proteínas e peptídeos (no mínimo tripeptídeos).
A-Espectrofotometria:
 A espectrofotometria pode ser definida como toda técnica analítica que usa a luz para medir as concentrações das soluções, através da interação da luz com a matéria. A luz de uma maneira geral é mais bem descrita como sendo uma radiação eletromagnética em virtude de sua natureza dualística. Ou seja, ela existe e tem um comportamento de campos elétricos e magnéticos oscilantes.
Onda eletromagnética(Fonte desconhecida)
A técnica espectroscópica é baseada na no aumento de energia em função do aumento da frequência da radiação incidida. Quando uma espécie química absorve energia na forma de fótons, seus elétrons ficam excitados e ocorre uma transição de um orbital de mais baixa energia para outro de maior energia. Um exemplo disso são compostos químicos que apresentam duplas ligações C=C no benzeno e C=O, a carbonila.
Lei de Lambert-Beer:
Lambert (1870) observou a relação entre a transmissão de luz e a espessura da camada do meio absorvente. Quando um feixe de luz monocromática, atravessava um meio transparente homogêneo, cada camada deste meio absorvia igual a fração de luz que atravessava, independentemente da intensidade da luz que incidia. A partir desta conclusão foi enunciada a seguinte lei: " A intensidade da luz emitida decresce exponencialmente à medida que a espessura do meio absorvente aumenta aritmeticamente ".
Esta lei pode ser expressa pela seguinte equação:
I = Io . 10-x1
Onde: I = Intensidade da luz transmitida
Io = Intensidade da luz incidente
x = constante denominada coeficiente de absorção e que depende do meio absorvente empregado
1 = Espessura do meio absorvente
Gráfico (Fonte desconhecida)
O -log (I/Io) foi denominado densidade óptica (DO) ou absorbância (A) ou extinção (E). Portanto, A = k' . c. A relação entre A e a concentração da solução é linear crescente.
Método de Biureto: 
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols.9 . O cobre, em meio alcalino, reage com proteína formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analí- ticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método.
Biureto(Fonte desconhecida)
Objetivo Geral: 
Ser capaz de aplicar o método de Biureto para a dosagem de proteínas do leite.
Objetivo Específico:
Definir e interpretar a lei de Lambert-Beer
Utilizar equipamento destinado a medir a concentração de substâncias pela absorção da luz que atravessa as suas soluções.
Construir um gráfico da absorvância em relação á concentração de uma substância (curva padrão).
Fazer a regressão linear dos dados e avaliar o valor do coeficiente decorrelação.
Utilizar o gráfico obtido para determinar a concentração da substância em soluções de teor desconhecido.
Calcular o fator de diluição de uma amostra.
Expressar o teor de proteínas de uma amostra em mgL ,g.
 Material Necessário:
 Vidrarias, equipamentos e utensílios:
Erlenmeyer de 100 mL
Bureta de 25 mL
Pipetas de 1,2,5 e 10 Ml
Espectofotômetro ou fotocolorímetro
Papel-filtro
Proveta de 20 mL
Funil
Tubos de ensaio e estante para tubos
Lenço de papel
Reagentes:
Leite desnatado.
Soluções-padrão de proteína: 1,2,3,4,6,8 e 10 mg mL .
Ácido clorídrico a 2 mL/100mL.
Reagente de Biureto: 1,5 g de sulfato de cobre cristalizado; 6,0gde tartarato duplo de sódio e potássio e 500 mL de água destilada. Adicione 300 mL de NaOH a 10% (p/v), com constante agitação e complete o volume para 1 litro com água destilada. Filtre, se necessário.
Procedimento:
O objetivo geral é combinar íons cúpricos com as proteínas do leite (caseína, lactoalbumina e lactoglobulina), de modo que os produtos formados desenvolvam uma coloração caracterpistica. Dessa forma, a concentração das proteínas pode ser determinada com o auxilio de um fotocolorímetro e das cinco soluções-padrão de proteína.
Preparo da curva de calibração:
Enumere seis tubos de ensaio e coloque em cada um 4mL do reagente de Biureto e 1 mL de uma solução-padrão de proteína.
Agite os tubos para misturar os reagentes. Em seguida, deixe em repousopor 15 minutos.
Ligue o equipamento e ajustea posição do filtro no comprimento de onde de 540 nm.
Aguarde de 5 a 10 minutos para ajustar o valor zero de absorvância ou 100% de transmitância do equipamento.
Insira na cela do fotocolorímetro uma cubeta contenco o branco (tubo zero).
Ajuste o aparelho, fazendo com que o branco indique 100% de transmitância .
Faça a leitura das soluções-padrão (tubos 1 a 5) e anote os valores de absorvâncias.
Trace o papel gráfico de absorvância x concentraçãodas soluções-padrão em papel milimetrado.
Calcule, por regressão linear (método dos mínimos quadrados), a equação da reta mais representativa do dados experimentais (veja explicação a seguir).Calcule o coeficiente de correlação r.
Calcule dois valores de absorvância usando a equação da reta (pontos teóricos) e por eles trace a reta calculada no gráfico preparado. Verifique se os pontos experimentais estão distribuídos equidistantes. Um gráfico semelhante ao representado a seguir deverá ser obtido.
 Gráfico e tabela
Cálculo da equação da reta por regressão linear
A regressão linear é utilizada para obter a equação da reta mais representativa dos dados experimentais. A fórmula geral de uma reta é dada pela equação y=ax+b, em que y representa a absovância e x, a concentração, em gL
(Fonte desconhecida)
(n= número de pontos experimentais utilizados no gráficos).
 O coeficiente de correlação, que é a medida da dependência entre as variáveis , é dado pela equação:
(Fonte desconhecida)
Quantificação das proteínas do leite:
Preparo da amostra I
Adicione 10 ml de leite desnatado e 10 ml de agua em um frasco Erlenmeyer de 100ml.
Acrescente, com auxilio de uma bureta, ácido clorídrico a 2% (v/v) até ocorrer a coagulação do leite. Em pH 4,6 ocorrerá a precipitação isoelétrica da caseína.
Anote o volume de ácido gasto para que seja utilizado nos cálculos.
Filtre e descarte o que ficar retido no papel filtro. O filtrado é a Amostra I e será usado posteriormente. Reserve-o.
Indique a composição proteica presente na fração retida no papel-filtro e filtrado, considerando a composição proteica do leite.
Preparo da amostra II
Dilua o leite em 1/20 com água destilada( 2mL de leite +18 mL de água). Está pronta a amostra II.Essa contém as proteínas totais do leite, ou seja, caseína, lactoalbumina e lactoglobulina.
Ensaio e leitura da absorvância das amostras I e II pelo método do Biureto.
Enumere três tubos de ensaio e prepare os ensaios de determinação de proteínas de acordo com o volume estabelecido no esquema:
Agite os tubos para misturar os reagentes. Em seguida, deixe em repouso por 15 minutos.
Ajuste o equipamento para o comprimento de onda de 540 nm.
Coloque o branco (tubo 0) na cubeta e zere o equipamento.
Faça as leituras das amostras. Anote os valores de absorvância obtidos.
TABELLAAAAAAAAA
Resultados: 
TABELAAAA GRAFICO CONTAS
Discussão:
A análise dos dados mostra que o método do Biureto é muito eficaz para de determinar a presença de aminoácidos no leite e consequentemente proteínas, este método também possui a vantagem de ser rápido e se utilizar de reagentes de baixo custo, além do fato de não apresentar grande variação de absortividade especifica para diferentes proteínas, sendo sua grande desvantagem para com os outros métodos de análise, estar no fato de ele não ser muito sensível, mesmo assim, o método do biureto é muito indicado para determinação de proteínas em meios biológicos.
Exercicios:
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