B08 Dosagem de Proteínas pelo Método do Biureto

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UERJ
 INSTITUTO DE QUÍMICA
 DEPARTAMENTO DE TECNOLOGIA DE PROCESSOS BIOQUÍMICOS
 BIOTECNOLOGIA EXPERIMENTAL
Professora: Márcia Monteiro Machado Gonçalves
Prática n° 8: Dosagem de proteína pelo método do Biureto
OBJETIVO
- Dosagem de proteína por espectrofotometria
MATERIAL UTILIZADO
- Vidraria: Becher, tubos de ensaio, pipetas, cubetas. 
- Reagentes/soluções: Reagente do biureto-CuSO4 em solução alcalina 
Solução padrão de caseína 10 mg/mL em NaOH 0,1 M
Solução de extrato de levedura A e B em NaOH 0,1 M
Solução de proteína de soja em NaOH 0,1 M.
- Espectrofotômetro
- Fórmula do biureto:
CuSO4 . 5 H2O --------------- 1,5 g/L
Tartarato duplo ---------------- 6 g/L
NaOH 10% --------------------- 30 g/300 mL de NaOH
PROCEDIMENTOS
Seguiu-se o protocolo abaixo utilizando a solução padrão de caseína conforme tabela 1
Tabela 1: procedimento experimental
	Tubo
	Solução de Caseína (mL)
	Água (mL)
	Reagente biureto (mL)
	Br
	0,0
	1,0
	5,0
	1
	0,2
	0,8
	5,0
	2
	0,4
	0,6
	5,0
	3
	0,6
	0,4
	5,0
	4
	0,8
	0,2
	5,0
	5
	1,0
	0,0
	5,0
	A
	1,0 mL da solução de extrato de leveduras novo
	5,0
	B
	1,0 mL da solução de extrato de leveduras velho
	5,0
	C
	1,0 mL da solução de proteína de soja
	5,0
Após a adição dos reagentes, agitatou-se e aguardou 30 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Em seguida, leu-se as absorbâncias a 550nm, usando o tubo Br como referência.
RESULTADOS 
4.1. Cálculo das concentrações das proteínas 
x1 = 10 x 0,2 = 2 mg/mL
x2 = 10 x 0,4 = 4 mg/mL
x3 = 10 x 0,6 = 6 mg/mL
x4 = 10 x 0,8 = 8 mg/mL
x5 = 10 x 1,0 = 10 mg/mL
4.2. Gráfico
Com os dados obtidos através dos experimentos, foi elaborada uma tabela com os dados de concentração de proteínas e as respectivas absorbâncias em 550 nm:
Tabela 2: resultados experimentais
	Tubo
	Concentração de proteínas (mg/mL)
	Absorbância (550nm)
	1
	2
	0,050
	2
	4
	0,100
	3
	6
	0,120
	4
	8
	0,140
	5
	10
	0,160
	A
	?
	0,070
	B
	?
	0,045
	C
	?
	0,095
A partir da tabela 2 pode-se construir o gráfico Absorbância (550nm) x Concentração de proteínas (mg/mL).
Figura 1: Gráfico Absorbância x Concentração de porteínas
4.3. Determinação das concentrações de proteínas nos tubos A, B e C
( Solução de extrato de levedura novo – Tubo A:
	y = 0,012x + 0,044
	0,070 = 0,012x + 0,044
	x = 2,167 mg/mL
( Solução de extrato de levedura velho – Tubo B
y = 0,012x + 0,044
	0,045 = 0,012x + 0,044
	x = 0,083 mg/mL
( Solução de proteína de soja – Tubo C 
y = 0,012x + 0,044
	0,095 = 0,012x + 0,044
	x = 4,25 mg/mL
CONCLUSÕES
Com o experimento de dosagem de proteínas pelo método do biureto foi possível constatar que esse, de fato, é um método muito eficiente para fazer a dosagem de proteínas. As ligações peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagem com íons cúpricos em meio alcalino (Reagente do Biureto) formando um complexo de coloração violeta, cuja absorbância medida em 550 nm é diretamente proporcional à concentração de proteínas na amostra como pôde-se ser visto pelo gráfico da figura 1 com um coeficiente de correlação igual a 0,973.
A concentração do extrato de levedura velho (0,083 mg/mL) resultou num valor bem menor do que o extrato de levedura novo (2,167 mg/mL). Isso dar-se ao fato de que o extrato de leveduras velho houve degradação da proteína em moléculas menores, aminiácidos, não tendo mais as ligações peptídicas necessárias para que o íon cúprico reaja. A solução de proteína de soja foi a que obteve a maior concentração de proteínas (4,25 mg/mL).