termotolerantes pela técnica de tubos múltiplos

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termotolerantes pela técnica de tubos múltiplos
	
	Nossa amostra a ser analisada foi obtida do Arroio Cancela, em Santa Maria, RS
	
Durante a aula prática, realizou-se a determinação do NMP de coliformes totais e A água foi coletada no trecho localizado paralelo à rua Tamanday (anexo 1), entre as ruas Marquês do Erval e a rua Acre. Obtivemos como resultado tanto para Coliformes totais como para termotolerantes uma elevada concentração, pois em ambos os casos encontrou-se um valor de 1.600.0 coliformes a cada 100ml.
Para se ter uma idéia de tamanha poluição, podemos comparar esses valores ao máximo permitido pela RESOLUÇÃO CONAMA Nº 357, DE 17 DE MARÇO DE 2005, que nos diz que as águas doces de classe 2, não deverão exceder um limite de 1.0 coliformes termotolerantes por 100 mililitros.
Para um melhor entendimento da prática realizada, abaixo estão listados alguns conceitos importantes.
CONCEITOS Coliformes Totais:
Grupo de bactérias constituído por bacilos Gram-negativos, aeróbios ou anaeróbios facultativos, não formadores de esporos, oxidase-negativos, capazes de crescer na presença de sais biliares ou outros compostos ativos de superfície, que fermentam lactose com produção de acido e gás a 35ºC. O grupo inclui os seguintes gêneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella.
	Coliformes fecais ou coliformes Termotolerantes:
	
	capacidade
	
	Caldo lactosado:
	
São os coliformes capazes de se desenvolver e fermentar a lactose com produção de acido e gás a temperatura de 4,5ºC em 24 horas. O principal componente deste grupo é Escherichia coli. Sendo que alguns coliformes do gênero Klebsiella apresentam também essa
Meio de enriquecimento, no qual as concentrações de lactose e peptona fornecem condições ótimas para o crescimento de bactérias do grupo coliforme.
	Caldo lauril triptose :
	
Meio de enriquecimento para bactérias do grupo coliforme , em que o lauril sulfato de sódio atua como agente seletivo, com suspensão do crescimento de bactérias esporuladas produtoras de gás.
	Caldo lactosado com verde brilhante e bile a 2% ( CLVBB):
	
Meio seletivo em que ocorre inibição de bactérias gram-positivas e de bactérias esporuladas fermentadoras de lactose, permitindo um bom desenvolvimento de bactérias do grupo coliforme.
Meio EC:
Meio seletivo para detecção de coliformes fecais, em que os sais biliares inibem o crescimento de forma esporuladas e de bactérias gram-positivas e cuja incubação a 4,5ºC permite a seleção dos coliformes de origem fecal (coliformes termotolerantes).
	Número mais provável (NMP):
	
É a estimativa da densidade de bactérias em uma amostra, calculada a partir da combinação de resultados positivos e negativos, obtidos através da aplicação da técnica de tubos múltiplos.
Princípio do método dos tubos múltiplos:
A determinação do N.M.P de coliformes em uma amostra é efetuada a partir de aplicação da técnica de tubos múltiplos. Esta técnica é baseada no princípio de que as bactérias presentes em uma amostra podem ser separadas por agitação, resultando em uma suspensão de células bacterianas, uniformemente distribuídas na amostra. Consiste na inoculação de volumes crescentes da amostra em meio de cultura adequado ao crescimento dos microorganismos pesquisados, sendo cada volume inoculado em uma série de tubos. Através de diluições sucessivas da amostra, são obtidos inóculos, cuja semeadura fornece resultados negativos em pelo menos um tubo da serie em que os mesmos foram inoculados e combinação de resultados positivos e negativos permite a obtenção de uma estimativa da densidade das bactérias pesquisadas, através da aplicação de cálculos de probabilidade. Para análises de águas, tem sido preferencialmente o fator 10 de diluição, sendo inoculados múltiplos e submúltiplos de 1 mL de amostra, usado-se series de tubos para cada volume a ser inoculado.
Etapas do método:
O exame para determinação de coliformes totais se processa através de 2 etapas ( ensaios presuntivo e confirmativo), de realização obrigatória para todos os tipos de amostras de água. A densidade de coliformes fecais é obtida a partir de um exame específico, aplicado paralelamente ao teste para confirmação de coliformes totais.
Ensaio presuntivo:
Consiste na inoculação de volumes determinados da amostra em séries de tubos de
Caldo lauril-triptose ou Caldo lactosado, com púrpura de bromocresol, que são incubados a 35 (+/-) 0,5 º C, durante 24-48 horas, ocorrendo um enriquecimento de organismos fermentadores da lactose. A acidificação, com ou sem produção de gás, a partir da fermentação da lactose no meio de cultura empregado nesse ensaio, é prova presuntiva positiva para presença de bactérias do grupo coliforme.
Ensaio confirmativo:
Consiste na transferência de cada cultura com resultado presuntivo positivo ( produção de ácido com ou sem gás em C.L.T. ou C.L. com púrpura de bromocresol após 24 ou 48 horas a 35 +/- 0,5ºC) para C.L.V.B.B. , sendo a incubação efetuada também a 35(+/-) 0,5 º C, durante 48 horas. A produção de gás a partir da fermentação da lactose neste meio é prova confirmativa positiva para a presença de bactérias do grupo coliforme. Esta etapa do exame reduz a possibilidade de ocorrência de resultados falsos-positivos, decorrentes da atividade de bactérias esporuladas e de bactérias Gram-positivas fermentadoras de lactose.
Através do ensaio presuntivo e confirmativo, realizar a estimativa de concentração dos coliformes totais e termotolerantes presentes na amostra de água coletada no arroio Cancela no município de Santa Maria.
1. Material utilizado a) Autoclave; b) Estufa bacteriológica; c) Estufa de esterilização e secagem; d) Balança; e) Destilador; f) Banho-maria; g) Alça de platina com cabo; h) Lamparina a álcool ou bico de Bunsen; i) Tubo de Durham; j) Tubo de ensaio; k) Algodão em rama; l) Meios de cultura; m) Pipetas graduadas; n) Papel alumínio; o) Estante para tubos de ensaio. p) Frascos de coleta.
2. Diluição da amostra a) homogeneizar a amostra no mínimo 25 vezes, inclinando o frasco, formando um ângulo de 45º entre o braço e o antebraço; b) utilizar um frasco de vidro graduado contendo 90 ml de água de diluição esterilizada; c) adicionar 10 ml da amostra de água a ser examinada (amostra direta), obtendo-se assim a primeira diluição decimal (10−1), onde 1 ml da mesma corresponde a 0,1 ml da amostra.
d) homogeneizar o frasco contendo a primeira diluição e transferir, com uma nova pipeta esterilizada, 10 ml para um frasco contendo 90 ml de água de diluição, obtendo-se assim a segunda diluição decimal (10−2), onde 1 ml da mesma corresponde a 0,01 ml da amostra.
	e) proceder dessa maneira na sequência de diluições desejadas ( 10−1, 10−2
	10−𝑛).
(Fonte: Google imagens)
3. Preparação dos meios de cultura
3.1. Caldo lauriltriptose ou caldo lactosado (concentração dupla):
a) pesar 71,2 gramas do meio de cultura e dissolver em 1.0 ml de água destilada; amo b) distribuir em tubos de ensaio (10 ml em cada tubo) contendo o tubo Durham, tampar os tubos com algodão; c) esterilizar a 121ºC em autoclave durante 15 minutos; d) deixar esfriar; e) guardar no refrigerador (válido por uma semana).
3.2. Caldo lactosado verde brilhante bile a 2% (concentração simples):
a) pesar 40 gramas do meio de cultura desidratado e dissolver em 1.0 ml de água destilada; b) distribuir em tubos de ensaio (10 ml em cada tubo) contendo o tubo Durham, tampar os tubos com algodão; c) esterilizar a 121ºC em autoclave durante 15 minutos; d) deixar esfriar; e) guardar no refrigerador (válido por uma semana).
3.3. Meio E.C. (concentração simples):
a) pesar 37 gramas do meio desidratado e dissolver em 1.0 ml de água destilada; b) distribuir em tubos de ensaio (10 ml em cada tubo) contendo o tubo Durham invertido, tampar os tubos com algodão; c) esterilizar a 121ºC em autoclave durante 15 minutos; d) guardar no refrigerador (válido por 96 horas).
4. Preparo dos tubos de ensaio a) colocar o tubo de Durham na posição invertida dentro do tubo de ensaio;b) tampar o tubo de ensaio com um chumaço de algodão.
5. Procedimentos para a coleta da amostra a) as amostras devem ser coletadas em frascos de vidro branco, boca larga, com tampa bem ajustada, capacidade de 100 ml, previamente esterilizados; b) as amostras devem ser etiquetadas (local e data); c) colocar uma tira de papel-alumínio entre a boca e a tampa do frasco; d) envolver a boca e tampa do frasco em papel-alumínio.
6. Ensaio presuntivo Caldo lactosado ou caldo lauriltriptose a) tomar uma bateria contendo 15 tubos de ensaio distribuídos em três séries de cinco tubos.
b) colocar nove ml do caldo lactosado ou caldo lauriltriptose em cada tubo de ensaio e inocular em cada tubo, com pipeta esterilizada, 1 ml da amostra a ser examinada.
c) homogeneizar; d) esterilizar a 121ºC em autoclave durante 15 minutos; e) esfriar; f) incubar a 35 + 0,5ºC durante 24/48 horas
	do grupo coliforme. Neste caso, fazer o teste confirmativo
	
g) se no final de 24/48 horas houver TURVAÇÃO DO MEIO E/OU FORMAÇÃO DE GÁS dentro do tubo de Durham, significa teste presuntivo POSITIVO para a presença de bactérias
Não havendo turvação do meio ou formação de gás durante o período de incubação, o exame termina nesta fase e o resultado do teste é considerado NEGATIVO.
7. Ensaio confirmativo para o grupo coliforme Caldo lactosado verde brilhante bile (C. L. V. B. B.) (Anexo 2).
a) tomar o número de tubos do ensaio presuntivo que deram positivos (turvação do meio ou formação de gás) na amostra direta e nas duas diluições; b) tomar igual número de tubos contendo o meio C. L. V. B. B a 2%; c) com a alça de platina, previamente flambada e fria, retirar de cada tubo positivo uma porção de amostra e inocular no tubo correspondente contendo o meio. Este procedimento chama-se repicagem; d) identificar os tubos; e) incubar durante 24/48 horas a 35 ± 0,5ºC; f) se no final do período de 24/48 horas houver a FORMAÇÃO DE GÁS dentro do tubo de Durham o teste é considerado POSITIVO para O GRUPO COLIFORME. Caso não haja formação de gás, o teste é considerado NEGATIVO; g) Anotar os resultados e calcular o NMP a partir dos dados obtidos.
8. Ensaio para diferenciação de coliformes termotolerantes Meio E. C.
a) tomar todos os tubos do ensaio presuntivo que deram positivos (turvação do meio e formação de gás) e todos os tubos negativos em que houve crescimento após 48 horas, na amostra direta e nas duas diluições; b) transferir, com alça de platina flambada e fria, uma porção para os tubos de ensaio contento o meio E.C.; c) homogeneizar e deixar todos os tubos em banho de água durante 30 minutos; d) incubar em banho-maria a 4,5 ± 0,2º C durante 24 ± 2 horas; e) se no final de 24 horas ou menos houver a formação de gás, está indicado a presença de coliformes de origem fecal; f) anotar os resultados e calcular o NMP a partir dos dados obtidos.
Após realizado o experimento, conforme descrito anteriormente, pode-se calcular o (NMP \ 100 ml):
A densidade de coliformes é expressa como NMP de coliformes por 100 ml, o qual é obtido através de tabelas, em que são dados os limites de confiança de 95% para cada valor de NMP determinado.
A tabela (anexo3) apresenta o NMP para várias combinações de resultados positivos e negativos, quando são inoculados 5 porções de 10ml, 5 porções de 1ml e 5 porções de 0,1ml da amostra. Para sua utilização, procuram-se os códigos formados por três algarismos correspondentes ao número de tubos com resultado positivo em três series consecutivas inoculadas. Para obtenção do NMP de coliformes totais, o código é composto a partir dos tubos com resultado positivo no meio C.L.V.B.B.(ensaio confirmativo). Para a determinação do NMP de coliformes termotolerantes, o código é composto a partir dos resultados obtidos no meio E.C.
Utilizando a tabela:
Quando são inoculadas 3 séries de 5 tubos, sendo utilizaos os volumes indicados na tabela( 10ml,1ml,0,1ml): neste caso o NMP é obtido diretamente a partir da tabela. Para isto, procura-se o codigo formado pelo número de tubos com resultados positivos obtidos nas três séries consecutivas inoculadas, verificando-se o NMP correspondente.
Quando são inoculados apenas trâs séries de 5 tubos, sendo utilizados volumes decimais diferentes daqueles indicados na tabela, neste caso procura-se o código formado pelo número de tubos com resultados positivos obtidos nas três sáries consecutivas inoculadas. Verificando –se o valor do NMP correspondente a ele através da seguinte fórmula:
NMP correspondente ao codigo x 10
Obtivemos tanto para o verde brilhante bile para coliforrnes totais, quanto para meio E.C. para termotolerantes os valores descrito na tabela abaixo:
Verde brilhante bile para coliforrnes totais meio E.C para termotolerantes
	Amostra Positivo
	Negativo Positivo Negativo
NMP correspondente ao codigo x 10
Logo conforme a tabela do NMP encontrou-se > 1600 coliformes totais e termotolerantes a cada 100 ml.
E ainda segundo a fórmula:
A partir dos resultados obtidos, concluímos que a amostra analisada encontra-se extremamente poluída, enquadrando-se apenas na classe 4 da RESOLUÇÃO CONAMA Nº 357, DE 17 DE MARÇO DE 2005, a qual pode ser destinada apenas à navegação e à harmonia paisagística.
Anexos Anexo 1:
Anexo 2:
Anexo 3: TABELA PARA DETERMINAÇÃO DO NMP .