GD Imunologia

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Suelen Ribeiro de Menezes
Ra: 154200026
GD II Imunologia P2
1 – Você precisa determinar a evolução da resposta imune em um paciente com infecção pelo HIV. Sabendo que a mesma está relacionada com a proporção de células CD4+/ CD8+ e com o numero absoluto destas células no soro dos pacientes infectados, qual método você utilizaria para acompanhar a evolução da infecção nos pacientes? Explique. 
O HIV ataca principalmente determinadas células do sangue, sobretudo os linfócitos T auxiliadores (ou células CD4) que comandam nosso sistema de defesa contra infecções. Pode-se então utilizar a Citometria de fluxo, uma técnica que permite analisar tamanho, complexidade, enzimas, DNA entre outros. O citometro capta e digitaliza a dispersão de fótons, possui componentes fluídos e de ótica. Neste caso a identificação é feita utilizando anticorpos marcados. Usa-se um Acanti CD4 com fluorescência 1, que se liga às células CD4+ e um Ac anti CD8 com fluorescência 2, que se liga à células CD8+, tornando possível a determinação do número absoluto dessas células.
2 – Monte um ensaio imunocromatográfico para detectar a presença de um antígeno Y no soro de pacientes. Descreva todos os reagentes e sua distribuição no cassete de ensaio.
Para detectar anticorpos específicos para uma proteína x poderia ser usado o método de ELISA direto, normalmente é feito em uma placa de poliestileno, que tem a capacidade de se ligar a proteínas em meio básico. Então ao colocar a proteína x em meio básico no poço ela se liga a este inespecificamente. Depois de um certo tempo, retira o liquido contendo a proteína x e o poço é lavado para remoção do que não se ligou. Depois é feito a etapa de bloqueio, para que o Ac não se ligue ao plástico, colocando no poço proteínas como a albumina ou leite desnatado que contem muita caseína, essa proteína em excesso cobre aonde não tem x ligado e não há mais onde o Ac se ligar se não em x. Depois disso se adiciona o soro do paciente e se houver Acanti x este se liga à x. Depois de adicionado o soro do paciente lava o poço novamente para retirar o que não se ligou. Coloca-se um segundo AcAnti-Ac marcado com uma enzima, se tiver Ac ligada à proteína x o anti – Ac se liga a ele. Lava novamente. E coloca agora o substrato dessa enzima, se tiver Ac contra x, a enzima reage com o substrato incolor, quando a enzima reage sobre ele muda de cor e a intensidade dessa cor é proporcional à quantidade de enzima, quanto mais enzima mais Ac contra proteína x maior a intensidade de absorbância.
3 – Descreva os princípios de funcionamento de um citometro de fluxo. O que é possível analisar com esta técnica? Quais informações podem ser obtidas em um gráfico de sidescatter (SSC) por Forwardscatter (FSC) originados a partir de uma amostra de sangue de um indivíduo normal?
O citometro de fluxo é um aparelho que permite analisar vários parâmetros celulares pois é capaz de captar e digitalizar a dispersão de fótons, provocada pela passagem de partículas em suspensão alinhadas uma a uma, num fluxo laminar, frente a um feixe de luz. O citometro é constituído por três partes: fluido, que contém a suspensão de partículas e o fluxo laminar, óptica, que contém a fonte de iluminação, captação da dispersão da luz e da fluorescência e filtração da dispersão e da fluorescência, e eletrônica, onde há conversão do sinal em valores e a aquisição, processamento, analise e armazenamento dos dados. Nesta técnica é possível analisar o tamanho das células, a complexidade, Ag celulares, presença de enzimas, citocinas, DNA, receptores e metabolitos. No gráfico de SSC (canal de dispersão lateral) é possível detectar a complexidade das células e no gráfico de FSC (canal de dispersão frontal) é possível detectar o tamanho das células. 
4 – O gráfico abaixo representa o curso de uma infecção viral e a resposta do sistema imunológico a esta infecção. P40 é uma proteína viral, presente no soro dos pacientes infectados. Com base nos dados abaixo, monte três testes diferentes para detecção do antígeno viral, de anticorpos IgM e IgG específicos para o Vírus. 
Descreva as etapas e os reagentes a serem utilizados. (Seu laboratório tem acesso a todos os reagentes e equipamentos).
Para a detecção de um Ag viral presente no soro pode ser feito um método de ELISA indireto, para isso é necessário haver dois Ac que se ligam a epitopos diferente do Ag y (Antiy-A e anti y-B), primeiro liga o Ac A em pH alcalino, poço é lavado, coloca a solução de bloqueio, lava, coloca o soro do indivíduo, que se houver o Ag y se ligará ao Ac A, lava novamente, e coloca agora o Ac B marcado com a enzima, lava-se novamente, e coloca-se o substrato. Se tiver Ag y a enzima reage com o substrato e revela cor, que tem intensidade proporcional à quantidade de y. 
Para detecção do IgM
No ensaio imunocromatográfico os materiais utilizados para a parte sólida do sistema são diferentes tipos de membrana (membrana de teste, do conjugado, absorvente e da amostra). Os reagentes utilizados são anticorpos ou antígenos de captura, partícula de detecção, detergente, estabilizadores. Assim monta-se a estrutura em cassete. Para detecção de antígenos podem ser utilizados anticorpos fixados na linha de captura e como conjugado um segundo anticorpo conjugado ao corante. A amostra percorre o caminho e chega na membrana que temo anticorpo marcado com ouro coloidal (róseo), como revelador da interação antígeno-anticorpo. Pode-se também utilizar prata coloidal (azul marinho). A amostra aplicada se liga ao conjugado colorido e após a migração por cromatografia a formação do imunocomplexo é revelada pelo depósito do corante coloidal na linha de captura. Para assegurar a qualidade dos reagentes e a realização adequada do procedimento, esses testes rápidos utilizam a linha controle. 
Para detecção do IgG
O teste de aglutinação é caracterizado pela formação de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos e partículas insolúveis que contém determinantes antigênicos na superfície. 
- Características:
Sensível, de fácil execução e baixo custo;
Boa especificidade, reprodutibilidade;
Baixa sensibilidade e pouca estabilidade Ag – Ac;
Diagnóstico de vírus, bactérias, protozoários e fungos; doenças autoimunes; detecção de hormônios e tipagem de grupos sanguíneos.
No teste para detectar anticorpos específicos utiliza-se o emprego de antígenos conhecidos, e para detectar antígenos específicos observamos sua reação com anticorpos conhecidos.
Partículas antigênicas insolúveis são utilizadas em sua forma íntegra ou fragmentada (Ex: bactérias, vírus, fungos e protozoários).
São realizadas diluições seriadas do anticorpo em relação a quantidade constante do antígeno. Após encubação, a aglutinação se completa e o resultado é geralmente expresso com a máxima diluição em que ocorre a aglutinação.