proteases

Prévia do material em texto

Bioquímica de Alimentos
Proteases
PROF. DRA. ADRIANA DANTAS
CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE ALIMENTOS
CAXIAS DO SUL, RS
Introdução Proteinases
 Principal função é a hidrólise de proteínas;
Envolvidas no processo de digestão, ativação de enzimas e no transporte de 
proteínas pelas membranas;
A posição da ligação da cadeia polipetidica e o tamanho da cadeia 
influenciam na sua atividade;
Apresentam grau de especificidade em relação aos aminoácidos envolvidos
na ligação e na sua posição na molécula.
 As enzimas são proteínas, cadeias de 
aminoácidos. 
 Enzimas que catalisam a quebra das 
ligações peptídicas em proteínas através da 
utilização de água são chamadas hidrolases. 
Hidrólise das proteína
 Favorece a digestão e absorção pelo organismo
 Formação de compostos responsáveis pelo aroma e textura
especificos;
 Proteases (EC 3.4) são enzimas que pertencem ao grupo das 
hidrolases
 Catalisam a reação de hidrólise das ligações peptídicas das 
proteínas
 Atividades também nas ligações éster e amida.
Especificidade das Proteases
Diferentes proteases 
resultam em 
diferentes produtos 
de hidrolises
Enzimas proteases produzidas em escala comercial
75% são hidrolases;
Destas, 60% são proteases
25% proteases alcalinas
10% quimiosina
3% tripsina
21% outras;
Modo de ação
 As proteases são classificadas pelo modo de ação pelo
seu sítio catalítico:
 Exopeptidases
atuam nas extremidade da cadeia polipeptidica
 Endopeptidases
agem nas ligações no interior da cadeia proteica
Exopeptidases
 1. Aminopeptidases
 Proteases que agem na
extremidade N-terminal 
da cadeia polietitidaica
 Liberam aminoacidos
livres, dipeptidios ou 
tripepetidios
 Geralmente são metalo-
proteases
Exopeptidases
 2. Carboxipeptidases
 Proteases que agem na extremidade C-terminal da cadeia
polipeptidica
 Liberam aminoacidos livres ou dipeptidios;
 São as serina-proteases, metalo-proteases ou cisteina-proteases
 Classificadas pela natureza quimica de seu sitio ativo.
Carboxipeptidase
 A carboxipeptidase é uma enzima digestiva.
 A hidrólise completa de uma proteína leva à separação dos 
resíduos dos aminoácidos componentes dessa proteína. 
Serina-proteases (EC 3.4.21)
Presença do aminoácido serina no sitio ativo
 Inibidas irreversivelmente:
 3,4-dicloroiscocumarina (3,4-DCI)
Disopropilfluorofosfato (DFP)
Fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF)
Serina-proteases
 Ativas em pH neutro e alcalino. Principais exemplos: tripsina, 
quimiotripsina e subtilisina.
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio
Ativo
Serina-Protease Quimitripsina
Substilisina
His57, Asp102, Ser195
His32, His64 Ser221
Histidina, Ácido aspártico, Serina.
Cisteína-proteases ou proteases sulfidrilicas
(EC 3.4.22)
 Apresentam em seu sitio ativo cisteina conjugada com histidine
 Mais ativas em meios de pH neutron do que ácido
 Ativadas na presença de agentes oxidantes e substância
 reagem com grupo sulfidril, p-cloromercuriobenzoato (PCMB)
 Bromelina, ficina e papaina são as principais cisteina-proteases
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo
Cisteína-Protease Papaína Cys25, His159,Asp158
Císteina, Histidina, Ácido aspártico
Proteases aspárticas ou acidas
(EC 3.4.23)
 Contém ácido aspartico em seu sitio ativo; 
 Inibidas por 1,2-epoxy-3-p-nitrofenoxipropano (EPNP) na presencça de íons cobre;
 Maior atividade em valores de pH ácido e maior afinidade por ligações que envolvem
aminoacidos apolares e aromáticos
 Pepsina e a renina
 Proteases microbianas fungicas
 gêneros Aspergillus, Penicillium, Rhizopus, Neurospora, Endothia e Rhizomucor
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio Ativo
Protease aspártica Pepsina de Peniciluim sp. Asp33 , Asp213
 O mecanismo geral de base-ácido para a hidrólise do polipeptidio catalisado por proteases aspárticas (Figura), 
 Requer um resíduo Asp, a fim de ser protonado, enquanto o segundo não é ionizado;
 Os dois aspartatos compartilhar um protões a um pH fisiológico; 
 A ligação amida sofre ataque por uma molécula de água que é ativado pelo resíduo de ácido aspártico 
catalítico desprotonado.
Metalo-Proteases
 Dependem de íons metálicos divalentes para sua atividade;
 Inibidas por agentes quelantes, como ácido etilinodiaminotetracético (EDTA)
Classe Exemplo Aminoácidos do Sítio
Ativo
Metalo-protease Carboxipeptidase Zn , Glu270, Try248
Neutras: colagenases de Costridium bystoliticum
elastases de Pseudomonas aeruginosa
Termolisina - protease neutra comercial de alta termoresistência
Alcalinas: 
gêneros Serratia e Myxobacter, com atividade pH 7,0 a 9,0
Proteases Vegetais
Mais empregadas na indústria de 
alimentos
Consideradas seguras para consumo
humano
Papaina, bromelina e ficina
Papaina (EC. 3.4.22.2)
 É uma cisteína-protease extraída do látex dos frutos do mamoeiro
(Carica papaya)
 Comercializada a forma de extrato bruto que contem:
 Papainas (QP-A)
 Quimopapaina (QP-B) 
 Apresenta atividade proteolítica em valores de pH 5,0 a 9,0
 Enzima permanece estável até 90º C
 Apresenta atividade sobre ligação éster e amida e boa atuação na síntese de 
peptídeos
Bromelina (EC. 3.4.22.4)
 É uma cisteina-protease extraída do pendúnculo
do fruto do abacaxizeiro (Ananas comusus)
 Atividade ótima pH 6,0 a 8,0
 Perda atividade > 70º C
Ficina
 Extraída do látex de diversas espécies 
do gênero Ficus
 Apresenta maior atividade: pH 6,0 a 8,0
 Temperatura estável até 60º C
 Baixa especificidade de substrato e 
hidrolisa ligações que envolve diversos 
aminoácidos
Proteases microbianas
 São excelentes fontes de enzimas 
em razão da grande diversidade e 
produção em escala
 Representam 40% do total utilizado 
no mercado de enzimas
Origem bacterianas
 Gênero Bacillus e Geobacillus
 Proteases neutras:
 Ativas pH 5,0 a 8,0
 Baixa estabilidade térmica
 Preferência ligações hidrofóbicas
 Proteases alcalinas:
 pH 8,0 a 11,0 – temperatura 50 a 60º C
 Baixa especificidade de substrato mais utilizadas na 
indústria de detergentes
Origem fúngica
 Aspergillus oryzae produz três proteases extracelulares
 Extrato é obtido por fermentação
 Atividade proteolítica pH 4,0 a 11,0
 Temperatura ótima 40º C
 Inativas a 50º C
Clarificação de cerveja
 Após fermentação alcóolica a cerveja passa por um período de 
maturação (cerca de C)
 A duração da maturação depende do tipo de cerveja
 Varia de poucos dias a varias semanas
 Finalidade é a destruição de diacetil (substância de sabor 
desagradável que se acumula durante a fermentação)
 O diacetil é transformado em acetoína pela adição de enzimas 
como acetolactato-descaboxilases e diacetil-redutases
Turvação da cerveja
 Interação de compostos fenólicos e polipeptídios provenientes do malte e de 
cerais não-maltados, que insolubilizam em temperatura baixa;
 A simples filtração não garante nova precipitação portanto é necessário 
tratamento com proteases;
 As proteases hidrolisam os peptídeos e impedem que eles se insolubilizem, 
evitando a turvação;
 Em geral é usado papaínas pois tem baixa especificidade e hidrolisam peptídeos 
de diferentes fontes e tem baixo preço no mercado;
Uso de proteases na cerveja
 Seu uso é permitido em alimentos
 Apresenta alta estabilidade térmica 
permanecendo ativa após a operação e 
pausterização e ao longo de vida ativa ao 
longo da vida de prateleira
 Chamado, no qual o uso de papaína vem 
sendo substituído pela aplicação de proteases 
microbianasFormação de espuma na cerveja
 A presença de proteínas é vital a 
formação de espuma em cervejas com 
alta massa molécula.
 A adição de papaina não afeta a 
formação de espuma, pois as 
substâncias envolvidas nesse processo 
são moléculas complexas formada por 
resíduos de polipeptideos e polifenóis e 
carboidratos, além de fosfato, não 
constituindo substrato para a papaina.
Panificação
 As farinhas de trigo para uso industrial são classificadas de acordo com seu conteúdo 
de proteínas
 Variam de 5 a 20%
 Essa variação deve-se a fatores genéticos. Ambientais e de manejo do trigo
 Fração proteica do trigo: chamada glúten
 A força do glúten é uma função da concentração dessas proteínas e da sua composição
 Formada por dois constituintes básicos: 
 Glutelina – proteína fibrilar se dispõem em forma de rede
 Gliadina – proteína globular que interage com a glutelina
Essas proteínas são a farinha a propriedade de formar uma 
massa visco elástica com capacidade de reter o ar.
GLÚTEN
 A rede de glúten é formada por ligações do tipo de 
dissulfeto e quanto maior o numero dessas ligações 
mais difícil será trabalhar a massa;
 A quantidade de proteína na farinha e a proporção 
de seus constituintes determinam as características 
de extensibilidade e de elasticidade da massa e do 
produto final;
 Uma massa de pão que contem pouco glúten gerará 
um produto pouco macio incapaz de se expandir 
pela ação do gás produzido pelo fermento químico.
Com glúten
Sem glúten
Modificação do GLUTEN
 As propriedade do glúten e redução da força pela 
adição de metabissulfito de sódio que torna a farinha 
mais adequada a finalidade desejada (produção de 
bolos, biscoitos, etc)
 A utilização deste produto é regulamentada por 
legislação especifica para cada pais
 Uma alternativa é utilizar proteases
Uso das proteases na panificação
 As proteases modificam a rede proteica pela quebra das ligações 
peptídicas
 A extensão da quebra depende do tipo de protease utilizada, sua 
concentração e do tempo de reação
 Fornece produto mais macio
 Menor densidade
 Aparência agradável
 Eliminina o sabor (after taste) provocado pelo metabissulfito
Uso de proteases na panificação
 Na etapa de maceração mecânica a finalidade é o rompimento das 
cadeias polipeptídicas do glúten para que essa rede formada por 
essas proteases não impeçam o crescimento da massa;
 As protease hidrolisa os constituintes do glúten reduz o tempo de 
trabalho mecânico em até 30%
 As proteases utilizadas Aspergillus oryzae e A. ninger
 Consideradas seguras para o consumo;
 Apresentam baixa especificidade
 São menos ativas que as protease vegetais o que garante a 
integridade do glúten
A aplicação das proteases é feita durante a fase de 
fermentação para que haja tempo para sua ação, 
uma vez que são inativas na temperatura do forno.
Cheiro e sabor de pão
 A hidrólise enzimática permite a liberação de grupos –NH2 e –COOH
 pelo rompimento da ligação peptídica entre eles;
 Esses grupos reagem com o açúcar usando da formulação ou o 
produzido pelo por -amilase
 responsável é o desenvolvimento do sabor e da cor característico do pão 
(reação de Maillard)
 Utilizado a papaína ou bromelina, sendo a ultima mais efetiva, e 
proteases neutra de Bacillus subtilis
Valor proteico das farinhas
 Uso de proteases em farinhas com alto teor proteico, dará 
origem a produtos com valor nutricional 
 Em biscoitos do tipo cracker o uso de proteases de A. oryzae permite 
a abertura homogênea da massa e evita deformação do pão no 
formo
 Produção de bolos e waffers, que exigem farinhas com baixo 
conteúdo de proteínas o uso de proteases vegetais pode substituir a 
aplicação de metabissulfito de sódio