DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS EM PAREDE CELULAR DE LEVEDURA PELO MÉTODO DE BIURETO

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
FACULDADE DE FARMÁCIA
determinação de proteínas em parede celular de levedura pelo método de biureto
Aluna: Marina Nunes de Abreu
Prof. Dr. Eduardo Ramirez Asquieri
Turma A01
Trabalho Nº5 como exigência 
da disciplina de Química 
e Bioquímica de Alimentos
Goiânia, 07 de junho de 2018
REVISÃO
Foram buscados estudos da parede celular de levedura, com foco na composição da amostra, em busca de valores de proteínas presente, e foram encontrados os seguintes estudos descritos abaixo:
Caballero-Córdoba, Pacheco e Sgarbieri (1997) em um estudo realizado em levedura de cerveja, submeteram a amostra a estudos analíticos para determinação de sua composição química e a ensaios biológicos em ratos para determinação de seu valor protéico, na forma de células integras e com as paredes celulares rompidas mecanicamente através de um moinho com esferas de vidro (CABALLERO-CÓRDOBA, PACHECO & SGARBIERI, 1997).
Em 1999, Sgarbieri e colaboradores realizaram um estudo com o objetivo de adaptar a metodologia de limpeza, adoçamento, autólise e fracionamento do autolisado de levedura de cerveja, utilizando a biomassa celular inteira e os derivados, para isso o material foi submetido a desidratação e a uma análise química para determinar a composição centesimal e o conteúdo de aminoácidos, ácidos graxos e minerais essenciais (SGARBIERI et al., 1999).
Pádua, Oliveira e Sgarbieri (2000) com o objetivo de estudar a influência da adição de 10% e 20% da fração parede celular de levedura (Saccharomyces sp.) a uma dieta hipercolesterolêmica em ratos Wistar, avaliaram os índices: digestibilidade, valor biológico e utilização líquida aparentes da proteína, quociente de eficiência alimentar e outros (PÁDUA, OLIVEIRA & SGARBIERI, 2000). 
Chaud (2004) apresenta em sua tese de doutorado o fracionamento e a caracterização química da parede celular de levedura obtida como subproduto do processo industrial da produção de etanol, visando avaliar as propriedades funcionais e fisiológicas da parede celular fracionada em glicoproteína, glicana mais manana, glicana insolúvel, glicana solúvel e manana, que foram caracterizadas quanto à composição centesimal, perfil de aminoácidos, minerais, ácidos graxos e quantificação de monossacarídeos (CHAUD, 2004).
E em 2006, em parceria com Sgarbieri, Chaud realizou um trabalho com o objetivo de fracionar, caracterizar quimicamente e fazer o estudo das propriedades funcionais (tecnológicas) da fração parede celular de leveduras da fermentação alcóolica e das subfrações glicana, manana e glicoproteína, sendo o fracionamento realizado por processos físico-químicos de extração, centrifugação e secagem em spray dryer, a caracterização química foi feita pela determinação da composição centesimal e as propriedades funcionais pelo uso de técnicas apropriadas (CHAUD & SGARBIERI, 2006).
Costa, Magnani e Castro-Gomez (2012), em um estudo, avaliaram a possibilidade da utilização da levedura Saccharomyces sp. descartada em cervejaria, para obtenção de extrato com manoproteínas, utilizando a metodologia de extração conduzida segundo delineamento fatorial incompleto, sendo utilizado Box-Behken 3 para temperaturas de 75, 85 e 95°C, com tempo de extração de 5,7 e 9h e concentração da suspensão de parede celular de 10, 15 e 20% (COSTA, MAGNANI & CASTRO-GOMEZ, 2012).
O objetivo da presente análise realizada em aula prática foi determinar a quantidade de proteína em uma amostra de parede celular de levedura, pelo método do biureto, e verificar se os valores encontrados enquadram-se no descrito nas bases de dados disponíveis.
MATERIAIS
MATERIAIS
VIDRARIAS E APARELHAGEM
Balança analítica;
Balão volumétrico;
Béquer;
Chapa elétrica;
Espectrofotômetro;
Funil;
Proveta;
Tubos de ensaio.
REAGENTES
Albumina bovina;
Carvão ativado;
Solução de NaOH (10g de NaOH completando o volume do balão para 100mL de água destilada);
Solução de NaOH 0,5N;
Sulfato cúprico;
Tartarato de sódio e potássio.
AMOSTRA
Parede celular de levedura.
PROCEDIMENTOS
REAGENTE BIURETO
Dissolveu-se 1,5g de sulfato cúprico e 6,0g de tartarato de sódio e potássio em 500mL de água destilada. Com agitação constante, adicionou-se 300mL de solução a 10% de NaOH e diluiu-se até 1000mL com água. O reagente foi guardado em garrafa de polietileno já que o vidro é atacado por substancias alcalinas. O reagente tem data de validade indefinida, porém deve ser descartado caso apareça precipitado preto-avermelhado.
CURVA PADRÃO
Pesou-se 0,5104g de caseína (padrão de proteína), transferiu-se para um béquer de 50mL, adicionou-se 20mL de água destilada e 1,0mL de NaOH 0,5N. Esquentou-se em chapa elétrica e ferveu por 2,5 minutos até completa dissolução da proteína, sem exceder o tempo pois um excesso de aquecimento poderia acarretar em hidrólise dos polipeptídios e possível diminuição da densidade óptica. Transferiu-se para um balão volumétrico de 50mL e completou-se com água. Filtrou-se para retirar a parte insolúvel. Adicionou-se em tubos de ensaio previamente enumerado alíquotas de 0,0 (Branco) - 0,2 – 0,4 – 0,6 – 0,8 – 1,0mL do filtrado de caseína. Adicionou-se, respectivamente 1,0 – 0,8 – 0,6 – 0,4 – 0,0mL de água destilada. Adicionou-se 4mL do reagente de Biureto em cada tubo e agitou-os bem. Deixou-se por 30 minutos em repouso e realizou a leitura em espectrofotômetro a 540nm.
AMOSTRA
Pesou-se 2,0006g de parede celular de levedura em um béquer, e adicionou-se 20mL de água destilada e 1mL de NaOH 0,5N. Dispersou-se bem o solido com o auxílio de um bastão de vidro. Aqueceu-se o béquer em chapa elétrica e a partir do momento de fervura aguardou-se 2,5 minutos para que a proteína fosse totalmente dissolvida. Colocou-se em balão volumétrico de 100mL e completou-se com água destilada. Agitou-se o balão e filtrou-se a amostra em algodão e o sobrenadante foi filtrado em papel filtro. Colocou em tubos de ensaio previamente enumerado alíquotas de 0,4 – 0,8 – 1,0mL de amostra filtrada e adicionou-se, respectivamente 0,6 – 0,2 – 0,0mL de água destilada. Adicionou-se 4,0mL de reagente de Biureto em todos os tubos e agitou-os bem. Deixou-se por 30 minutos em repouso e realizou a leitura em espectrofotômetro a 540nm.
RESULTADOS
A tabela 1 mostra os valores encontrados para as absorbâncias obtidas no espectrofotômetro para o padrão de caseína e para a amostra de parede celular de levedura.
Tabela1. Absorbâncias do padrão de caseína e da amostra.
	Tubo
	Alíquotas (mL)
	Quantidade de caseína nas alíquotas padrão (mg)
	Absorbâncias do padrão
	Absorbâncias da amostra
	1
	0,2
	2,0416
	0,093
	-
	2
	0,4
	4,0832
	0,182
	0,082
	3
	0,6
	6,1248
	0,271
	-
	4
	0,8
	8,1664
	0,356
	0,175
	5
	1,0
	10,2080
	0,443
	0,219
	
CÁLCULO DO PADRÃO DE CASEÍNA
Para calcular a concentração de caseína em cada tubo utiliza-se uma regra de três simples. Considera-se a massa de caseína pesada de 0,5104g ou 510,4mg.
Tubo 1 (0,2mL):
 
Tubo 2 (0,4mL):
 
Tubo 3 (0,6mL):
 
Tubo 4 (0,8mL):
 
Tubo 5 (1,0mL):
 
GRÁFICO – MÉTODO DO EXCEL
Foi construído, então, o gráfico da curva padrão de caseína, com os valores que se encontram na tabela 2 abaixo, no Excel, onde o eixo X representa a concentração de caseína e o eixo Y representa a absorbância do padrão.
Tabela 2. Concentração e absorbânciadas alíquotas de solução padrão de caseína.
	Tubo
	Alíquotas (mL)
	Concentração (mg/alíquota)
	Absorbâncias do padrão
	1
	0,2
	2,0416
	0,093
	2
	0,4
	4,0832
	0,182
	3
	0,6
	6,1248
	0,271
	4
	0,8
	8,1664
	0,356
	5
	1,0
	10,2080
	0,443
Figura 1. Gráfico da concentração do padrão de caseína versus absorbância.
A equação da reta obtida foi através da fórmula: 
Sendo:
y = absorbância;
x = concentração de caseína (mg).
Logo, a equação da reta da curva padrão de caseína é: 
E o coeficiente de linearidade obtido foi de 0,9999.
CÁLCULO DA AMOSTRA
Calculou-se a concentração de caseína em cada um dos tubos da amostra:
Tubo 2 (0,4mL):
 
Tubo 4 (0,8mL):
 
Tubo 5 (1,0mL):
 
O cálculo da amostra foi realizado escolhendo o ponto mais próximo do meio da curva, o valor de absorbância do meio da curva é, aproximadamente, 0,2697, sendo assim, a absorbância da amostra mais próxima a esse valor é 0,219, que equivale ao tubo 5, alíquota 1,0mL (tabela 1).
Para calcular a quantidade de proteínas presente na amostra utiliza-se a concentração da amostra na alíquota 1,0mL:
 
DISCUSSÃO
Segundo Caballero-Córdoba, Pacheco e Sgarbieri (1997), a composição centesimal da biomassa da levedura Saccharomyces sp., empregada em cervejaria, apresenta 48,51% de proteínas, 8,33% de cinzas, 3,44% de lipídios e 32,86% de carboidratos totais (CABALLERO-CÓRDOBA, PACHECO & SGARBIERI, 1997). E Sgarbieri e colaboradores (1999) relataram 48,74% de proteína, 8,55% de cinzas, 3,33% de lipídios e 35,00% de carboidratos para as células íntegras e 32,70% de proteínas, 4,43% de cinzas, 4,54% de lipídios e 56,50% de carboidratos para a parede celular (SGARBIERI et al., 1999).
Pádua, Oliveira e Sgarbieri (2000) encontraram que a composição centesimal da fração parede celular teve como principais componentes a fibra (55,05%) e a proteína (32,70%), além de outros valores menores de lipídios totais (4,50%) e cinzas (4,43%) (PÁDUA, OLIVEIRA & SGARBIERI, 2000).
Chaud (2004) encontrou que a fração parede celular bruta representa 36% dos sólidos totais da biomassa e contém, em base seca, 27% de proteína (CHAUD, 2004). E em 2006, Chaud e Sgarbieri encontraram que a composição centesimal da parede celular semi-purificadade levedura possui 18,80% de proteína, 77,80% de fibra alimentar total, 1,40% de cinzas e 2,00% de lipídios totais (CHAUD & SGARBIERI, 2006).
E em um estudo de Costa, Magnani e Castro-Gomez (2012), foi encontrado que a composição centesimal da parede celular com e sem etanol, expressas em base seca, é de 6,65% de cinzas, 16,95% de proteínas, 7,95% de lipídios e 68,43% de carboidratos na parede celular com etanol e de 1,62% de cinzas, 17,18% de proteínas, 7,94% de lipídios e 73,25% de carboidratos na parede celular sem etanol (COSTA, MAGNANI & CASTRO-GOMEZ, 2012).
Por fim, na presente análise realizada em aula prática, foi encontrado o valor de 24,78% de proteínas na parede celular de levedura, dado esse que corrobora com a literatura, visto que encontra-se dentro da faixa encontrada de 16,95% a 48,74%. De acordo com dados da literatura, a parede celular de levedura é formada principalmente por beta-glicana e manana, associadas a glicoproteínas, do tipo manoproteína (PÁDUA, OLIVEIRA & SGARBIERI, 2000), e foi essa porção de glicoproteínas que foi determinada em aula prática.
CONCLUSÃO
Foi uma aula tranquila e relativamente simples de ser realizado, todo o apoio e ensinamento foi transmitido de forma clara e paciente pela professora que nos auxiliou do início ao fim da análise. Não tenho reclamações quanto a aula e, pela primeira vez, também não encontrei muitas dificuldades em encontrar literatura para embasamento científico.
REFERÊNCIA
CABALLERO-CÓRDOBA, G.M.; PACHECO, M.T.B.; SGARBIERI, V.C. Composição química de biomassa de levedura integral (Saccharomyces cerevisiae) e determinação do valor nutritivo da proteína, em células íntegras ou rompidas mecanicamente. Ciência e Tecnologia de Alimentos, v.17, n. 2, p. 102-106, 1997.
CHAUD, S.G. Fracionamento e caracterização química da parede celular de levedura – propriedades funcionais e fisiológicas das frações. Tese apresentada para a obtenção do título de Doutor em Alimentos e Nutrição, Universidade Estadual de Campinas, SP, 2004.
CHAUD, S.G.; SGARBIERI, V.C. Propriedades funcionais (tecnológicas) da parede celular de leveduras da fermentação alcoólica e das frações glicana, manana e glicoproteína. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 26, n. 2, p. 369-379, 2006.
COSTA, A.G.; MAGNANI, M.; CASTRO-GOMEZ, R.J.H. Obtenção e caracterização de manoproteínas da parede celular de leveduras de descarte em cervejaria. Acta Scientiarum. Biological Sciences, v. 34, n. 1, p. 77-84, 2012.
PÁDUA, E.A.; OLIVEIRA, A.C.; SGARBIERI, V.C. Importância da parede celular de levedura (Saccharomyces sp.) como fonte de fibra a alimentação. Ciênc. Tecnol. Aliment., v. 20, n. 2, 2000. 
SGARBIERI, V.C.; ALVIM, I.D.; VILELA, E.S.D.; BALDINI, V.L.S.; BRAGANOLO, N. Produção piloto de derivados de levedura (Saccharomyces sp.) para uso como ingrediente na formulação de alimentos. Brazilian Journal of Food Technology, v. 2, n. ½, p. 119-125, 1999.