PRÁTICA 1 AVALIAÇÃO DE FATORES EXTERNOS SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA POLIFENOLOXIDASE (PPO)

Prévia do material em texto

UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ – UFC
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA DE ALIMENTOS
BIOQUÍMICA DE ALIMENTOS
PROF.ª LUCIANA SIQUEIRA
MARYANA MELO FROTA
PRÁTICA 1
AVALIAÇÃO DE FATORES EXTERNOS SOBRE A ATIVIDADE ENZIMÁTICA DA POLIFENOLOXIDASE (PPO)
FORTALEZA-CE 
2018
OBJETIVOS
	Reconhecer a ação de fatores externos, como a temperatura e substâncias químicas, bem como inibidores ou ativadores, sobre a atividade enzimática da Polifenoloxidase. 
RESULTADOS E DISCUSSÃO
EXPERIMENTO 1 – Ação de ativadores e inibidores na atividade enzimática
FIGURA 1 – Aplicação de água, Catecol, Ácido Ascórbico e Sulfato de Cobre em bananas.
	No primeiro tubo, da esquerda para a direita, a banana cortada foi adicionada a 2 mL de água destilada. Pode-se observar que a coloração, após um pequeno intervalo de tempo, não foi modificada pelo fato do teor de atividade de água da fruta ter aumentado. Esse fator foi um inativador da enzima, já que os aminoácidos hidrofílicos do exterior da cadeia da enzima podem ter se ligado ao alto teor de água presente, ou até mesmo a água ter diluído o meio diminuindo a formação do complexo enzima-substrato, ou seja, diminuindo a velocidade da reação.
	O segundo tubo contém 2mL de Catecol, um substrato para a enzima, e 0,5 mL de Ácido Ascórbico. A quantidade menor de AA adicionado foi suficiente para inibir a enzima, mesmo com a adição substrato. A explicação se dá por conta da diminuição brusca do pH advinda do inibidor que, dessa forma, desestabilizou a enzima. A Polifenoloxidase é inativada em valores de pH inferiores a 4,0. Melo e Boas (2006) utilizaram um tratamento químico semelhante, porém com soluções contendo variados agentes químicos para inibir o escurecimento enzimático em bananas maçã minimamente processadas, e o tratamento contendo ácido ascórbico, cloreto de cálcio e cisteína foi o mais efetivo na prevenção da coloração das bananas maçã minimamente processada.
	O sulfato de cobre foi adicionado ao terceiro tubo. Algumas enzimas necessitam de moléculas inorgânicas (metais como o cálcio, o zinco ou o magnésio) para auxiliarem no processo catalítico de reações, isto é, diminuir a energia de ativação da quebra de ligações químicas. Tais moléculas são conhecidas como cofatores. O Sulfato de Cobre serviu como cofator da Polifenoloxidase, uma vez que essa enzima é uma metaloenzima. Diante disso, é possível afirmar que a banana sofreu escurecimento enzimático, pois o reagente foi um ativador da reação. Diniz et al. (2009) analisaram a qualidade de sementes de alface quando enriquecidas com micronutrientes e reguladores de crescimento durante o armazenamento, porém utilizaram dois tipos de fertilizantes com tipos e concentrações variadas de micronutrientes em sua composição, como zinco, manganês, cobre, entre outros. Eles concluíram que o revestimento das sementes à base de micronutrientes e reguladores de crescimento provoca redução na sua qualidade. Logo, constata-se que a afirmação acima é verdadeira, metais aceleram a atividade enzimática.
 	Por fim, no último tubo o reagente adicionado foi o Catecol, que serviu como substrato para a enzima por ser um composto fenólico. O processo acontece graças aos monofenóis presentes na cadeia dos compostos fenólicos, onde são oxidados pela PPO e transformados em difenóis, estes são oxidados em o-quinonas. As quinonas são condensadas e geram pigmentos escuros, as melanoidinas. Logo, sem nenhum interferente e na presença de oxigênio o escurecimento enzimático ocorreu. Para reafirmar, Santos (2009), ao analisar o escurecimento enzimático em frutos, comprovou que a PPO apresentou maior especificidade para o 4-metil catecol comparativamente a outros substratos comumente utilizados nos estudos de polifenoloxidases de vegetais.
EXPERIMENTO 2 – Eficiência de reagentes químicos para a inativação da PPO. 
FIGURA 2 – Maçã processada e submetida a diferentes reagentes químicos.
1- fatia imersa em ácido acético; 2- fatia imersa em ácido cítrico; 3- fatia imersa em ácido ascórbico; 4- fatia imersa em água morna; 5- fatia controle.
FIGURA 3 - Maçã processada e submetida a diferentes reagentes químicos e adição de Catecol.
1- fatia imersa em ácido acético; 2- fatia imersa em ácido cítrico; 3- fatia imersa em ácido ascórbico; 4- fatia imersa em água morna; 5- fatia controle.
	As Figuras 3 e 4 mostram os resultados para os diferentes tratamentos químicos nos tempos de 7 minutos e, após adicionar uma gota de Catecol, 3 minutos das fatias submersas nas soluções e da fatia controle. Enquanto as frutas permaneceram submersas nas soluções, elas não escureceram, porém ao serem retiradas das soluções e adicionado o Catecol em gotas, foi possível observar que o escurecimento ocorreu, ou seja, os reagentes ácidos (ácido cítrico, acético e ascórbico) impediram o escurecimento por mecanismos de atuação somente na PPO, a enzima Peroxidase, também presente nos frutos e responsável pelo escurecimento enzimático, pode não ter sido inativada. 
	A forma de avaliação para esse teste é observar qual tratamento ácido foi mais eficiente. A porção nº 3 da maçã foi imersa na solução de ácido ascórbico e é detectável que foi a fatia que menos sofreu escurecimento ao longo do tempo. A razão, além da possível permanência da peroxidase, para que não tenha sido evitado o escurecimento é a baixa concentração de ácido ascórbico, uma vez que foi diluído. Com relação ao trabalho desenvolvido por Santos (2009) o resultado se assemelha, pois dos acidulantes testados como inibidores da atividade da PPO, o ácido ascórbico demonstrou grande destaque em relação ao ácido cítrico. A mesma verificação foi feita por Nogueira (1973), em que o tratamento com Ácido Ascórbico foi superior ao do tratamento com Dióxido de Enxofre em maçãs (Ohio Beauty) conservadas por congelação e liofilização. 	A fatia nº 5 é a controle, não passou por nenhum tratamento térmico, sabe-se que o escurecimento enzimático ocorreu já que houve condições favoráveis para a catálise enzimática, com o Catecol e o oxigênio como substratos, além dos compostos fenólicos da composição da maçã. 
 	A fatia nº 4 foi submetida à água morna por 7 minutos. O ideal para inativar irreversivelmente a enzima era temperaturas maiores que 30ºC para que houvesse o branqueamento da fruta, porém o binômio tempo-temperatura não foi suficiente. Assim sendo, com a adição de Catecol o escurecimento ocorreu sem interferente nenhum.
EXPERIMENTO 3 – Eficiência da aplicação de calor na inativação da PPO.
	Curva de absorbância:
			ABS = 0,00058x + 0,09653
Peso das maçãs e absorbância: 
In natura – 1,0401g; 0,02 d.o
Tratada – 1,0608 g; 0,130 d.o
	ATIVIDADE ENZIMÁTICA - In natura
 →
 = 0,0006 d.o/min
 → 
 = → 
	
 
ATIVIDADE ENZIMÁTICA - Tratada
 →
 = 0,0043 d.o/min
 → 
 = → 
	
 
	O controle da atividade da Polifenoloxidase é de suma importância para a tecnologia de alimentos, pois é responsável pelo escurecimento em frutas e vegetais e seus produtos processados. O tratamento térmico é utilizado atualmente como uma forma eficaz de ativar a PPO em frutas e vegetais. Neste experimento, foram utilizadas cubetas com extrato enzimático de maçãs tratada e in natura com adição de catecol para verificar a atividade enzimática em relação à densidade ótica obtida pelo espectrofotômetro. Diante dos valores obtidos a partir dos cálculos realizados, observa-se que, após tratamentos térmicos, a atividade enzimática da PPO obteve um aumento. No entanto, a maçã tratada deveria ter sido submetida a uma temperatura de 30ºC por 30 min, e não foi o que aconteceu, talvez por uma temperatura abaixo. De acordo com Santos (2009), a temperatura ótima de atividade da PPO para se ligar ao catecol para catalisar a reação de escurecimento enzimático em atemóia foi de 28°C. Por meio dessa informação, acredita-se que como a temperatura não foi alta o suficiente para inativar a enzima, ela, porsua vez, favoreceu a atividade catalítica da PPO, fazendo com que a mesma se ligasse com uma maior quantidade de substrato em relação as enzimas da maçã in natura. 
CONCLUSÃO
	Mediante os experimentos 1 e 2 ficou comprovado a eficácia dos tratamentos térmicos e químicos como inativadores da Polifenoloxidase, enzima responsável pelo escurecimento enzimático em frutas após longos períodos de tempo, cortes, injúrias, entre outros fatores. Na presença de ativadores, como cofatores ou substratos, a PPO reagiu de forma positiva e apresentou resultados satisfatórios, devido as favoráveis condições que ela foi exposta.
 	Vale ressaltar que o binômio tempo-temperatura é bastante importante para efetivar o tratamento térmico como forma de controle para o escurecimento enzimático, pois o resultado alcançado no experimento 3 não se adequou ao objetivo exigido. 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
DINIZ, Kênia Almeida et al. Qualidade de sementes de alface enriquecidas com micronutrientes e reguladores de crescimento durante o armazenamento. 2009. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-31222009000100026&lang=pt>. Acesso em: 08 abr. 2018.
MELO, Ânderson Adriano Martins; BOAS, Eduardo Valério de Barros Vilas. Inibição do escurecimento enzimático de banana maçã minimamente processada. 2006. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0101-20612006000100019&lang=pt>. Acesso em: 08 abr. 2018.
NOGUEIRA, João Nunes. INFLUÊNCIA DE ALGUNS MÉTODOS DE CONTROLE DO ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO NAS PROPRIEDADES ORGANOLÉTICAS DA MAÇÃ OHIO BEAUTY CONSERVADA POR CONGELAÇÃO Ε LIOFILIZAÇÃO. 1973. Disponível em: <http://www.scielo.br/pdf/aesalq/v30/19.pdf>. Acesso em: 08 abr. 2018.
SANTOS, Izabella Rodrigues Chaves dos. ESCURECIMENTO ENZIMÁTICO EM FRUTOS: POLIFENOLOXIDASE DE ATEMÓIA (Annona cherimola Mill. X Annona squamosa L.). 2009. Disponível em: <http://www2.fcfar.unesp.br/Home/Pos-graduacao/AlimentoseNutricao/IzabellaChavesME.pdf>. Acesso em: 08 abr. 2018.
TROIANI, Estela de Pieri; TROPIANI, Clariza Tomé; CLEMENTE, Edmar. Peroxidase (POD) and polyphenoloxidase (PPO) in grape (Vitis vinifera L.). 2003. Disponível em: <http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1413-70542003000300019&lang=pt>. Acesso em: 09 abr. 2018.