Seminário Determinação de Vitaminas Lipossolúveis por Métodos Análiticos

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA 
 Departamento de Tecnologia 
 Análise Físico-Química de Alimentos - TEC 322 
Docente: Luiz Severo da Silva Junior 
 
DETERMINAÇÃO DE VITAMINAS 
LIPOSSOLÚVEIS POR MÉTODOS ANALÍTICOS 
Hellen Carolina dos Santos Mota 
Ivana Carvalho Leite 
 
VITAMINAS 
 Moléculas orgânicas contendo carbono 
 
 Funcionam principalmente como catalisadores para reações 
dentro do organismo 
 
 Classificadas como hidrossolúveis ou 
 lipossolúveis 
 
Fonte: Google imagens FOOD INGREDIENTS BRASIL Nº 29 – 2014. 
2 
VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS 
 Compostos constituídos de isopreno 
 
 Solúveis em gordura 
 
 Desempenham papéis essenciais no metabolismo 
ou na fisiologia dos animais 
 
Fonte: Google imagens BITENCOURT, 2013 
3 
Fonte: Educar Saúde 
VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS 
Carotenóides, pró-vitamina A 
 
Amplamente distribuídos nos vegetais e animais 
 
Grupo de pigmentos naturais lipossolúveis com tonalidades que variam 
do amarelo ao vermelho 
 
Principais formas encontradas na natureza são a vitamina D2 e a 
vitamina D3 
 
Poucos alimentos contêm quantidades expressivas 
 
 Fontes alimentares apenas 10 a 20% da vitamina necessária para os 
seres humanos 
 
4 
Fonte: Educar Saúde 
VITAMINAS LIPOSSOLÚVEIS 
Encontra-se em alimentos animais e vegetais, com a maior 
concentração em folhas verde escura 
 
 Constitui importante marcador biológico da atividade osteoblástica 
Age como antioxidante na estabilização de lipídios insaturados 
 
Inclui 8 compostos e duas classes: tocoferóis e tocotrienóis com 
diferentes atividades biológicas 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
 Realizar os ensaios de validação necessários à acreditação de um 
método analítico para determinação da vitamina D em matrizes 
alimentares. 
 
 Determinar o teor de vitamina D em vários produtos alimentares. 
Objetivos 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Fonte: Parreira, 2013. 
Diagrama 1 - Componentes de um cromatógrafo de HPLC. 
7 
Fonte: Parreira, 2013. 
Figura 1 - Equipamento de HPLC analítico. 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Fonte: Parreira, 2013. 
Tabela 1 – Amostras em estudo. 
“ Cada amostra analisada foi composta a partir de três lotes diferentes do produto, em quantidades iguais, 
exceto as papas infantis que já se encontravam disponíveis no INSA em sacos 
próprios e selados a vácuo. 
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PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Fluxograma 1 – Etapas para doseamento da Vitamina D em gêneros alimentícios 
Fonte: As autoras. 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Saponificação 
 
2 g papas infantis 
 
Adicionou-se : 
- 100 mL de 
etanol absoluto 
 
- 1 g de ácido 
ascórbico 
 
Adição do PI 
 
Amostra contendo 
D3 
 
 0,2 mL de solução 
de padrão de 
trabalho de 
vitamina D2 
. 
 7,5 mL da 
solução de 
hidróxido de 
potássio a 
60% a cada 
uma das 
amostras 
Banho de água 
termostatizado a 
100 ºC 
Saponificação 45 
minutos 
Resfriamento com 
gelo 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Extração 
 
 
Às soluções 
resultantes da 
saponificação 
adicionou-se 100 mL 
de água purificada 
 
 
 
Solução de éter de 
petróleo e éter 
dietilico (80:20) 
Transferências 
das soluções 
para uma 
ampola de 
decantação de 
500 mL 
Volume total de 
75 mL (3 x 25 mL) 
Fases etéreas 
recolhidas em 
ampolas de 
decantação de 
1000 mL 
Lavagem das fases 
com água 
purificada de grau 2 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Extração 
Reconstituição dos 
resíduos, pós 
evaporação,em 8 
mL de n-heptano 
(qualidade HPLC) 
Balões do 
evaporador 
rotativo em 
forma de pêra 
de 250 mL 
 
T= 40 ºC 
P= 300 mbar 
 > 20 mbar 
Filtração através 
de filtros de PVDF 
de 0,45 μm com o 
auxílio de 
seringas de 5 mL 
Filtração das fases 
com um filtro de 
papel de 185 mm de 
qualidade 2, 
contendo sulfato de 
sódio anidro 
Colocadas em 
frasquinhos (vials) 
adequados para o 
sistema de HPLC 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
HPLC 
semi-preparativa 
Injeção da solução 
padrão da mistura de 
vitaminas D2 e D3 
 
Identificar o intervalo 
de tempo para a 
recolher a fração 
contendo a vitamina D 
nos extratos das 
amostras. 
Fluxo: 1 mL/min 
 
 
Fase móvel: n-
heptano/isopropanol 
(97:3) 
 modo isocrático 
 
 
 
V de injeção: 200 
μL 
 
T da amostra: 15 ºC 
 
T da coluna: 37 ºC 
 
t de corrida: 10 min 
Fase 
estacionária: 
 
LiChrosorb Si 60 
com 5 μm de 
porosidade e 25 
cm de 
comprimento por 
4 mm de diâmetro 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
HPLC 
semi-preparativa 
Evaporação do 
solvente T= 40 ºC e 
P= 70 mbar 
 
 
Injeção dos extratos 
das amostras no 
sistema de HPLC 
duas vezes 
Recolhimento das 
frações de 
interesse para o 
mesmo balão de 
evaporador 
Reconstituição dos 
resíduos com 0,5 
mL de metanol de 
qualidade HPLC e 
colocados em 
frasquinhos (vials ) 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
HPLC analítica 
V de injeção: 100 μL 
 
 T da amostra: 15 ºC 
 T da coluna: 37 ºC 
 t de corrida: 25 ou 
60 min 
 
Depende da matriz 
da amostra a 
analisar 
Fluxo: 0,8 mL/min 
 
 
Fase móvel: 
metanol/água(95:5) 
 
 
 
 
Fase estacionária: 
 
 Kromasil 100 C18 
com 5 μm de 
porosidade e 25 
cm de 
comprimento por 
4 mm de diâmetro 
 
 
Identificação e 
quantificação das 
vitaminas D2 e D3 
nos extratos das 
amostras 
 
Comparação com os 
tempos de retenção 
dos padrões e por 
equações 
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MÉTODOS ANÁLITICOS 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Quantificação 
Identificada por 
comparação de 
tempos de retenção 
 
 
Método do padrão 
interno para quant. 
com base na área 
dos picos. 
 
Cálculo do fator 
de resposta (FR) 
da vitamina D3 
quando utilizada a 
vitamina D2 como 
padrão interno e 
vice-versa. 
 
 Teor em vitamina D2 ou D3: 
software EMPOWER® 
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VALIDAÇÃO DO MÉTODO DE ANÁLISE 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
 Gama de trabalho e Linearidade 
 
 Limites analíticos 
 
 Recuperação 
 
 Precisão e Repetibilidade 
 
 Exatidão 
 
 Especificidade e Seletividade 
 
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GAMA DE TRABALHO E LINEARIDADE 
 Linearidade entre 0,1 µg/mL e 3,5 µg/mL para a vitamina D3 
 Volumes de solução padrão mãe (10 µg/mL) utilizados para cada analito 
para construir as curvas, com posterior diluição de 1/10 de forma a obter 
os teores desejados. 
Tabela 2 – Teores de vitamina D e volumes de solução mãe (10 µg/mL) para construir as 
curvas 
Fonte: Parreira, 2013. 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
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GAMA DE TRABALHO E LINEARIDADE 
 A linearidade da reta obtida foi confirmada através da análise do coeficiente de 
determinação (𝑅2 ), 0,998. 
 Figura 2 – Reta de calibração para a análise da vitamina D3 
Fonte: Parreira, 2013. 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
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LIMITE DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO 
 Os limites analíticos do método foram determinados com base na razão 
sinal/ruído. 
 
 Escolheram-se três teores de vitamina D, 0,1, 0,15 e 0,5 µg/mL para o limite de 
quantificação. 
 
 A razão sinal/ruído foi determinada com base no quociente entre a altura do pico 
de vitamina D a uma determinada concentração e a altura da linha de base do 
cromatograma (ruído). 
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LIMITE DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO 
 Os resultados obtidos para os três teores: 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Tabela 3 – Razão sinal/ruído para os teores de 0,1, 0,15 e 0,5 µg/mL em vitamina D 
Fonte: Parreira, 2013. 
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LIMITE DE DETECÇÃO E QUANTIFICAÇÃO 
 Os valores da taxa de recuperação (%) para os limites de quantificação: 
 
 
Tabela 4 – Recuperação no LQ e presença do pico no LD para a vitamina D2 e D3 
Fonte: Parreira, 2013. 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
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PRECISÃO 
 Os parâmetros de precisão (repetibilidade e precisão intermédia) foram 
avaliados com as três amostras de papas infantis, A, B e C. 
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REPETIBILIDADE E PRECISÃO INTERMÉDIA 
 A repetibilidade pode exprimir-se através do coeficiente de variação (CVr) 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Tabela 5 – Coeficiente de variação da repetibilidade 
Fonte: Parreira, 2013. 
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REPETIBILIDADE E PRECISÃO INTERMÉDIA 
 Tal como a repetibilidade, a precisão intermédia é expressa através do 
coeficiente de variação 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Tabela 6 – Coeficiente de variação da precisão intermédia 
Fonte: Parreira, 2013. 
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RECUPERAÇÃO 
 
 Utilizando a equação abaixo, determinou-se a recuperação para as três amostras 
e respetivos duplicados (tabela 7). 
 
 Recuperação (%) = 
𝑪𝟏 −𝑪𝟐
𝑪𝟑
 x 100 
 em que, 
 C1 - concentração determinada na amostra adicionada, 
 C2 - concentração determinada na amostra não adicionada, 
 C3 - concentração adicionada. 
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RECUPERAÇÃO 
 Os valores de recuperação devem estar entre 80 e 120%, nos ensaios realizados há 
uma amostra de papa infantil se encontra fora desse intervalo. 
 Tabela 7 – Recuperação de vitamina D2 em papas infantis 
Fonte: Parreira, 2013. 
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EXATIDÃO 
 A exatidão do método foi avaliada através do cálculo do z-score: 
 z = 
𝑿𝒍𝒂𝒃 −𝑿𝒗
𝒔
 
em que, 
 
 Xlab - valor obtido pelo laboratório; 
 Xv - valor aceito como verdadeiro (valor certificado do MRC ou valor aceite como verdadeiro num 
ensaio interlaboratorial); 
 s - desvio-padrão dos ensaios realizados (em todos os laboratórios, no caso de ensaios Inter 
laboratoriais). 
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ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE 
 Para comprovar que o método é especifico e seletivo para as duas formas de vitamina D, as 
figuras 3 e 4 apresentam, respetivamente, os cromatogramas obtidos para a solução padrão de 
trabalho da vitamina D2 e D3. 
 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta resolução (HPLC) para doseamento da vitamina 
D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Figura 3 – Cromatograma dos padrões de vitamina D3 e D2, 1 – Vitamina D2 (TR: 20,423 minutos) e 2 
– Vitamina D3 (TR: 21,673 minutos) 
Fonte: Parreira, 2013. 
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ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE 
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D em géneros alimentícios. Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. 
Figura 4 – Cromatograma da amostra de papaA, 1 – Vitamina D2 (TR: 20,517 minutos) e 2 – Vitamina D3 
(TR: 21,730 minutos) 
Fonte: Parreira, 2013. 
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REFERÊNCIAS 
 BITENCOURT, A. P. G. Papel das Vitaminas Lipossolúveis no Metabolismo. 
Seminário de pós graduação. Universidade Federal do Rio Grande do Sul, 2013. 
Disponível em:<https://www.ufrgs.br/lacvet/site/wp-
content/uploads/2013/10/vitam_lipoAna.pdf>. Acesso em: 22 ago. 2019. 
 COSMÉTICOS E PERFUMES. Vitaminas em formulações cosmética. Disponível 
em:<http://insumos.com.br/cosmeticoseperfumes/pdf/Vitaminas.pdf>. Acesso em: 22 
ago. 2019. 
 FOOD INGREDIENTS BRASIL Nº 29 – 2014. Dossiê Vitaminas. Disponível 
em:<http://www.revista-fi.com/materias/378.pdf>. Acesso em: 22 ago. 2019. 
 INSTITUTO ADOLFO LUTZ, Normas Analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v. 1: Métodos 
químicos e físicos para análise de alimentos. 3. ed. São Paulo: IMESP, p. 381-382, 
1985. 
 
 
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REFERÊNCIAS 
PARREIRA, D.I.S. Validação de um método de cromatografia líquida de alta 
resolução (HPLC) para doseamento da vitamina D em géneros alimentícios. 
Aplicação do método em diferentes matrizes alimentares. 2013. Disponível em: < 
http://repositorio.insa.pt/bitstream/10400.18/2335/1/17%20-
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LC%29%20para%20doseamento%20da%20vitamina%20D%20em%20g%C3%A9neros
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