Relatório sobre a determinação colorimétrica de proteínas pela reação de biureto

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UNIVERISADE FEDERAL DE GOIÁS
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CÂMPUS SAMAMBAIA 
DISCIPLINA DE BIOQUÍMICA
	 
	
	
	
	
	
	
RELATÓRIO SOBRE A DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA DE PROTEÍNAS PELA REAÇÃO DE BIURETO
Goiânia
2019
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
RELATÓRIO SOBRE A SOBRE A DETERMINAÇÃO COLORIMÉTRICA PELA REAÇÃO DE BIURETO
Relatório da segunda aula prática da disciplina de Bioquímica ministrada pela Prof. Dra. Vanessa Rafaela Milhomem Cruz Leite, realizada no laboratório 9 do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás.
Goiânia, GO
2019
Sumário
1 Introdução...................................................................................................4
2 Materiais.....................................................................................................5
3 Métodos......................................................................................................6
4 Resultados..................................................................................................7
4.1 Reagente de Biureto e sua relação com proteinas....................................7
4.2 Procedimentos...........................................................................................8
4.3 Valores de Absorbância.............................................................................8
4.4 Reativos e Absorbância..............................................................................9
4.5 Curva padrão da dosagem de caseína.....................................................10
5 Conclusão....................................................................................................11
6 Referências Bibliográficas...........................................................................11 
Introdução
 	As proteínas são consideradas umas das substâncias mais importantes para o organismo, pois são as macromoléculas mais abundantes nas células e realizam diversas funções, como a manutenção dos órgãos e também agem na parte estrutural do organismo.
	Elas são polímeros naturais formadas por aminoácidos que em sua estrutura apresentam um grupo amino, uma cadeia lateral R e um grupo carboxílico. Para que sejam feitas as proteínas ocorrem ligações químicas entre os aminoácidos (apenas 20 são usados na formação de proteínas) no grupo carboxílico de um e no grupo amino do outro, formando uma amida, e eles estarão formando cadeias e serão conectados entre si através de ligações peptídicas.
 	 Em diversos experimentos, as proteínas reagem com alguns reagentes devido as ligações peptídicas. Um teste muito usado é a determinação colorimétrica pela reação de biureto, que tem o intuito de detectar se há ligações peptídicas na solução. Sendo assim, os compostos quando são submetidos numa solução diluída de sulfato de cobre em meio alcalino apresentam uma coloração violeta, indicando que possuem as ligações da proteína.
2. Materiais
5 Tubos de Ensaio pequenos
Caseína 1%
Glicina 1%
NaOH 1,0 mol/L
Reativo de Biureto (sulfato de cobre 0,5%)
Espectofotômetro
Agitador de tubos (vórtex)
Água destilada
Pipetas Graduadas de 1 e de 10ml
Figura1.1: Na figura acima estão representados os materiais utilizados no experimento. Da esquerda para a direita estão: NaOH 1,0 mol/L, Glicina 1%, Caseína 1% e o reativo de biureto.
Figura 1.2: Água destilada
Figuras 1.3 e 1.4 estão conjugadas acima. Estão representando as pipetas graduadas, à esquerda está a pipeta de 1ml e à direita está a pipeta de 10ml 
Figura 1.5: Está representando o Agitador de tubos (vórtex)
3. Métodos
Inicialmente foram pegos cinco tubos de ensaio, o primeiro foi denominado de tubo branco, o segundo de glicina e os restantes foram numerados de 1 a 3. Foi adicionado 1mL de água destilada no tubo branco, no tubo glicina foi adicionado 1mL de glicina. Já nos tubos 1,2 e 3 foram adicionados caseína, mas em volumes diferentes.
No tubo 1 foi adicionado 0,2 mL de caseína, no tubo 2 adicionado 0,6 mL de caseína e no tubo 3 adicionado 1mL de caseína.
Depois desse estágio, os tubos 1 e 2 foram completados com 1mL de água destilada. Consequentemente foram adicionados 3mL de NaOH 1,0 mol/L em todos os tubos e posteriormente foi adicionado 0,4 mL de Biureto em todos os tubos.
	Esperou-se a reação se processar por 15 minutos.
Figura 1.6: a Imagem acima mostra a coloração obtida em cada tubo, depois de realizados os procedimentos citados anteriormente.
Resultados
 Reagente de biureto e sua relação com proteínas
Constituído de Sulfato de Cobre (CuSO4) e Hidróxido de Sódio (NaOH), o biureto tem como uma de suas funções estabilizar o cobre em solução com o auxílio de um complexante, sendo que o tartarato de sódio é o mais utilizado. Em ambiente alcalino, o cobre reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. Normalmente, o espectrofotômetro é calibrado na banda de absorção de 270 nm ou em 530 nm. No experimento realizado, foi utilizada a banda de 530 nm, uma vez que a utilização desta é a mais adequada para fins analíticos, já que diversas substâncias absorvem na banda de 270 nm, ocasionando diversas interferências no método.
4.2 Procedimentos
Inicialmente, identificou-se 5 tubos de ensaio: Branco (B), Glicina (G), 1, 2 e 3. Posteriormente, foi adicionado 1 mL de água destilada no tubo B, 1 mL de glicina no tubo G. Além disso, foi inserido 0,2 mL, 0,6 mL e 1 mL de caseína nos tubos 1, 2 e 3, respectivamente. Nos tubos 1 e 2 foi adicionado água destilada até completar 1 mL.
Para alcalinizar o meio, foi colocado 3 ml de NaOH 1 mol/L em todos os tubos. O reagente de biureto também foi adicionado em todos os tubos, no volume de 0,4 ml. A tabela 1 contém uma melhor descrição da quantidade dos materiais: 
	Reativos
	B
	G
	1
	2
	3
	Água destilada (mL)
	1,0
	--
	--
	--
	--
	Solução de glicina (mL)
	--
	1,0
	--
	--
	--
	Solução de caseína 1% (mL)
	--
	--
	0,2
	0,6
	1,0
	 Água destilada (mL)
	--
	--
	0,8
	0,4
	--
	 NaOH
	3,0
	3,0
	3,0
	3,0
	3,0
	Biureto (mL)
	0,4
	0,4
	0,4
	0,4
	0,4
 
 Tabela 1
4.3 Valores de absorbância
Após agitar os tubos, para homogeneizá-los, esperou-se 15 minutos para que a reação fosse processada. 
Antes dos tubos serem colocados no espectrofotômetro, o aparelho foi calibrado/zerado no comprimento de onda de 530 nanômetro (nm) com o tubo B (branco) que apresenta 0 de absorbância para aquele comprimento de onda.
Verificou-se a absorbância das soluções B, G, 1, 2 e 3 no espectrofotômetro, sendo anotados os valores presentes na tabela 2:
	Tubos
	Absorbância
	B
	0,000
	G
	0,020
	1
	0,097
	2
	0,735
	3
	0,035
 
 
 Tabela 2
4.4 Reativos e a absorbância
O método do biureto é baseado na reação do sulfato de cobre em meio alcalino com proteínas e peptídeos. No processo foi utilizado o NaOH 1mol/L para alcalinizar o meio, a fim de que as ligações peptídicas das proteínas (-CONH-) reajam com os íons cúpricos e formem um complexo de coloração violeta que é proporcional ao teor das proteínas no meio, como é mostrado na figura 1.6. Um esquema dessa reação é apresentado na figura 1:
 Figura 1 Fonte: Bioquímica – LCB 208 Roteiro De Aulas Práticas
	
	
Como é mostrado na figura 1, a glicina que foi adicionada no tubo G, não pode se complexar com os íons cúpricos. Essa circunstância é explicada pelo fato de a glicina ser um aminoácido livre e esses íons só reagem com proteínas e peptídeos de pelo menos duas ligações peptídicas. Por esse motivo, a absorbância do tubo G foi muito inferior às encontradas nos tubos 1, 2 e 3. 
Portanto, quanto
maior a concentração de caseína na amostra, mais intensa é a coloração observada e maior a absorbância encontrada. No entanto, possivelmente por um erro na pipetagem dos reativos, o valor de absorbância encontrado para a solução do tubo 3 foi inferior ao esperado, de forma que a proporcionalidade entre volume de caseína (proteína) e absorbância não foi obedecida. Esse fato é mostrado na tabela 3:
	Tubos
	Solução de caseína 1% (ml)
	Absorbância
	B
	--
	0,000
	G
	--
	0,020
	1
	0,2
	0,097
	2
	0,6
	0,735
	3
	1,0
	0,035
 
 Tabela 3
 Curva padrão de dosagem da caseína
A partir dos dados da tabela 3, foi possível construir a curva padrão de dosagem da caseína: 
Gráfico 1 – curva padrão de dosagem de caseína
A curva padrão de dosagem de caseína deveria ser uma reta/linear, como é mostrado na linha de tendência do gráfico (linha pontilhada), devido à proporcionalidade que há entre o volume de proteínas (ml) e a absorbância. Contudo, devido ao erro mencionado anteriormente, o gráfico 1 não segue no esperado. 
Conclusão
A análise dos dados mostra que o método do biureto permite a identificação de proteínas e peptídeos com mais de duas ligações peptídicas, bem como a relação diretamente proporcional entre o volume destas e a absorbância de uma amostra.
Também foi possível concluir que a glicina, por ser um aminoácido livre, não se complexa com os íons cúpricos, já que estes só reagem com moléculas (proteínas e peptídeos) a partir de duas ligações peptídicas. Portanto, a solução não muda de cor e a absorbância encontrada é muito inferior às soluções com caseína (proteína).
A ocorrência do erro durante a preparação da amostra não impossibilitou a análise do procedimento realizado, uma vez que os tubos B, G, 1 e 2 permitiram a constatação da proporcionalidade, através dos volumes de solução de caseína e suas respectivas absorbâncias. Além disso, a averiguação das cores das amostras, corroborou essa evidência, já que quanto maior o volume de proteínas, mais arroxeada é a solução.
6. Referências Bibliográficas
LEHNINGER, A. L.; NELSON, D. L.; COX, M. M. Princípios de bioquímica. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2006.
http://www.scielo.br/pdf/qn/v21n6/2914 - Determinação De Proteínas Totais Via Espectrofotometria: Vantagens E Desvantagens Dos Métodos Existentes. Acesso em: 15/11/2019
https://edisciplinas.usp.br/pluginfile.php/3935666/mod_resource/content/1/Apostila%20Bioquimica%202014_LCB%20208.pdf - Bioquímica – LCB 208 Roteiro De Aulas Práticas. Acesso em: 15/11/2019