determinaçao de acúcares redutores

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE - FURG 
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS - EQA 
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL 
 
 
 
 
 
 
 
Prática 1: 
DETERMINAÇÃO DE AÇÚCARES REDUTORES PELO MÉTODO 
ESPECTROFOTOMÉTRICO DO 3,5 DINITROSALICÍLICO (DNS) 
 
 
 
Júlia Gonzalez - 86756 
Lisliane Kickofel - 71591 
Simone Soares - 47475 
 
 
 
Profª.: ​Márcia Luvielmo 
 
 
 
 
 
Rio Grande 
 2018 
 
 
 
1. INTRODUÇÃO 
Os açúcares estão presentes em praticamente todos os alimentos, podendo 
ser encontrados na forma de monossacarídeos e polissacarídeos (DORNEMANN et 
al., 2016). Os açúcares redutores são carboidratos que possuem seu grupo 
carbonílico e cetônico livres, capazes de se oxidar na presença de agentes 
oxidantes em solução alcalina. Essa oxidação ocorre apenas com os 
monossacarídeos (glicose, frutose, etc) em sua forma lineares – que estão em 
equilíbrio com sua estrutura cíclica. Assim, o carbono carbonílico, denominado 
anomérico quando na estrutura cíclica, é oxidado a um grupo carboxílico. Por outro 
lado, os carboidratos cujos carbonos anoméricos estão envolvidos em ligações 
glicosídicas, sendo incapazes de assumirem a sua forma linear e, portanto, de se 
oxidarem em solução alcalina, são denominados açúcares não redutores, como 
exemplo, a sacarose (SILVA et al., 2003; NELSON, COX et al., 2014; DOS SANTOS 
et al., 2016). Na Figura 1 é possível observar as estruturas da glicose e sacarose. 
 
 
Figura 1. Estrutura da glicose e da sacarose 
 
Segundo Silva et al. (2003), existem vários métodos químicos não seletivos 
que fornecem resultados, com alto grau de confiabilidade, quando aplicados 
corretamente, também há outros métodos mais seletivos que vêm sendo utilizados e 
estudados como a cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Porém os 
métodos mais clássicos e conhecidos para a análise de açúcares redutores são na 
sua maioria pela redução de íons cobre em soluções alcalinas (solução de Fehling), 
assim como aqueles que utilizam a desidratação dos açúcares, pelo uso de ácidos 
concentrados, com uma posterior coloração com compostos orgânicos, além da 
simples redução de compostos orgânicos, formando outros compostos de coloração 
na região do visível. Sendo eles, a refratometria em escala Brix (método 
refratométrico), Somogyi-Nelson, fenol-sulfúrico (métodos espectrofotométricos) e 
Lane-Eynon (método titulométrico). 
O método de DNS foi inicialmente empregado em 1921 para medir açúcares 
no sangue e na urina, onde a amostra era misturado com DNS e NaOH, que é o 
redutor da ação da glicose sobre o ácido 3,5-dinitrosalicílico, mas Sumner em 1924 
apresentou modificações ao método decorrente de um estudo de 3 anos, as quais 
ele introduziu tartarato de duplo de sódio e potássio (ou sal de Rochelle), o que 
possibilitou a prevenção da destruição de parte das moléculas de açúcar pelo 
oxigênio que é dissolvido durante o processo de aquecimento, assim como o 
aumento da quantidade de cor gerada, proporcionando melhor detecção de 
pequenas quantidades de glicose. Lopo após, Sumner propôs a adição do fenol e 
pequenas quantidades de bissulfito de sódio, visando aumentar a quantidade de cor 
gerada pela glicose (SUMNER, 1921; SUMNER; SISLER, 1944; GONÇALVES et al., 
2010; TEIXEIRA et al., 2012; VASCONCELOS et al., 2013). Mais tarde, Miller 
(1959) aperfeiçoou o ensaio, de modo que seu protocolo foi o mais empregado por 
muitos anos, com diversos fins, e o mais citado na literatura. O ácido 
3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente no reativo DNS), sob condições 
alcalinas, reage com o carbono carbonílico de açúcares redutores e se reduz a ácido 
3-amino-5-nitrosalicílico (Figura 2), um composto corado cuja absorção máxima de 
luz se dá a 540 nm (GONÇALVES et al., 2010; NEGRULESCU et al., 2012). 
 
 
Figura 2. Reação de redução do ácido DNS (DORNEMANN et al., 2016) 
 
Uma desvantagem desse método é que a equivalência entre o ácido 
3-amino-5-nitrosalicílico produzido e a quantidade de açúcares redutores não é 
exata (DORNEMANN et al., 2016). 
 
2. OBJETIVO 
Empregar a técnica de quantificação através da curva padrão e determinar os 
açúcares redutores totais na amostra. 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
3.1 Materiais 
● HCl 2 M; 
● NaOH 2 M; 
● Solução padrão de glicose 1 
mg/mL; 
● Solução de sacarose 1 mg/mL; 
● Solução de amido 5 mg/mL. 
● Pêra de sucção; 
● Pipeta de 10 mL; 
● Pipeta de 5 mL; 
● Pipeta de 1 mL; 
● Tubos de ensaio; 
● Béqueres de 50 mL; 
● Espectrofotômetro; 
● 3,5-dinitrosalicílico preparado 
conforme o procedimento abaixo: 
➔ solução A: 13,5 g de NaOH em 
300 mL de água destilada; 
➔ solução B: 8,8 g de 3,5 DNS; 
255 g de tartarato de sódio e 
potássio em 800 mL de água 
destilada (o reagente DNS foi 
dissolvido em 400 mL de água, 
depois adicionou-se o 
tartarato); 
➔ solução C: misturou-se A e B; 
➔ solução D: 2,2 g de NaOH; 10 
g de fenol em 100 mL de água 
destilada. 
 
3.2 Métodos 
3.2.1 Curva padrão da glicose 
Enumerou-se 7 tubos de ensaio em duplicatas e procedeu-se conforme com a 
Tabela 1. 
 
Tubo Glicose (mL) 
Água 
(mL) 
DNS 
(mL) 
Banho maria 
100º C (min) 
Banho de 
Gelo (min) 
Água 
(mL) 
Branco 0,0 3,0 1 5 1 6,0 
1 0,2 2,8 1 5 1 6,0 
2 0,4 2,6 1 5 1 6,0 
3 0,6 2,4 1 5 1 6,0 
4 0,8 2,2 1 5 1 6,0 
5 1,0 2,0 1 5 1 6,0 
6 1,8 1,5 1 5 1 6,0 
Tabela 1. Procedimento para a execução da curva padrão da glicose. 
 
Adicionou-se a glicose, exceto no tudo do branco, com variadas mL de 
solução, adicionou-se 1 mL do reagente 3,5 DNS e deixou-se durante 5 minutos em 
banho maria a 100ºC e esfriou-se a solução em banho de gelo, logo após 
adicionou-se 6 mL de água destilada e realizou-se a leitura a 546nm. 
 
3.2.2 Determinação de açúcares redutores totais 
Enumerou-se 6 tubos de ensaio em duplicata (A, B, C, D, E e F). Tomou-se 1 
mL de solução de sacarose 1 mg/mL ou 1 mL de solução de amido 5 mg/mL e 
procedeu-se de acordo com a Tabela 2 apresentada. 
 
Tubo Amostra (mL) 
Água 
(mL) 
HCl 
(mL) 
Banho 
100º C 
(min) 
NaOH 
(mL) DNS 
Banho 
100º C 
(min) 
Banho 
de Gelo 
(min) 
Água 
(mL) 
A 
(branco) 0,0 1,0 1,0 0 1,0 1,0 5 1 6,0 
B 1,0 0,0 1,0 0 1,0 1,0 5 1 6,0 
C 1,0 0,0 1,0 2 1,0 1,0 5 1 6,0 
D 1,0 0,0 1,0 5 1,0 1,0 5 1 6,0 
E 1,0 0,0 1,0 10 1,0 1,0 5 1 6,0 
F 1,0 0,0 1,0 15 1,0 1,0 5 1 6,0 
Tabela 2. Procedimento para execução da determinação nas amostras. 
 
Adicionou-se a solução de sacarose ou amido, solução ácida e aqueceu-se, 
após a solução básica, 1 mL de reagente 3,5 DNS. Deixou-se por 5 minutos em 
banho maria 100º C, resfriou-se a solução banho de gelo em torno de 1 minuto. 
Adicionou-se 6 mL de água destilada e realizou-se a leitura a 546 nm. 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
Absorbâncias obtidas através da análise pelo método de espectrofotométrico 
utilizando 3,5 DNS na região de 546 nm, mostrados na Tabela 3. A amostra de 
calibração (branco) é utilizada para zerar a absorbância do equipamento. 
 
Tubo 1. Absorbância 
2. 
Absorbância Média 
Absorbância 
(descontando o branco) 
Branco 0,091 0,090 0,0905 - 
1 0,100 0,094 0,097 0,0065 
2 0,216 0,199 0,2075 0,117 
3 0,352 0,349 0,3505 0,26 
4 0,485 0,474 0,4795 0,389 
5 0,652 0,597 0,6245 0,534 
6 1,765 1,573 1,669 1,5785 
Tabela 3. Absorbâncias obtidas na curva padrão pelo espectrofotômetrona região 
de 546 nm. 
 
Com o coeficiente de determinação (R²) é possível ver a alta linearidade da 
curva padrão da glicose (Gráfico 1), que está acima de 0,99, de acordo com o guia 
de validação de métodos determinado pela ANVISA (2017) e acima de 0,90, de 
acordo com o INMETRO (2016). Lembrando que, para possuir essa linearidade, foi 
retirado o último ponto. 
 
Gráfico 1. Curva padrão da glicose 
 
Devido a sacarose não ser um açúcar redutor, ela foi hidrolisada pela 
presença do ácido e do calor (VASCONCELOS et al., 2016), para se tornar açúcar 
redutor, gerando glicose e frutose. A reação pode ser observada na Figura 3. 
 
Figura 3. Hidrólise da sacarose 
 
A maioria dos métodos conhecidos para a análise de açúcares redutores são 
baseados na redução de íons em solução alcalina, outros fundamentos na 
desidratação dos açúcares através de ácidos concentrados com posterior coloração 
com compostos orgânicos, além da redução de um composto orgânico formando 
compostos de coloração mensurável na região visível (SILVA et al, 2003). Conforme 
Imagem 1. 
 
 
Imagem 1. Foto retirada da prática experimental. 
 
Tubo Média das absorbâncias 
Absorbância 
(descontando 
o branco) 
a 
(branco) 0,076 - 
b 0,085 0,009 
c 0,1725 0,0965 
d 0,162 0,086 
e 0,0845 0,0085 
f 0,0845 0,0085 
Tabela 4. Média das absorbâncias obtidas para as amostra 
 
O cálculo da concentração de glicose obtida a partir da hidrólise da sacarose 
foi realizado a partir da equação da curva padrão de glicose (Gráfico 1), sendo: 
 y = 6,635x - 0,1368 
 
Onde: y é a absorbância e x é a concentração da glicose. 
 
Tubo Concentração (mg/mL) 
b 0,0219 
c 0,0351 
d 0,0335 
e 0,0218 
f 0,0218 
Tabela 5. Concentração obtida nas amostras 
 
Testou-se diferentes tempos de aquecimento, para a verificação de qual seria 
o melhor tempo para a total hidrólise da sacarose, que poderia ser visto com a 
absorbância que aumentaria de acordo com a maior concentração da glicose, porém 
devido a alguns erros, como erros do analista, a vidraria que não estava limpa o 
suficiente, ocorrendo assim a presença de precipitado e turbidez na solução 
causando grandes diferenças nas absorbâncias, como pode ser visto no Gráfico 2. 
 
 
Gráfico 2. Diferentes tempos de aquecimento para a reação de hidrólise da sacarose 
 
É possível verificar pela concentração que o tempo de 2 minutos é suficiente 
para a hidrólise total da sacarose. Em 5 minutos obteve-se uma concentração 
parecida, porém um pouco menor e as últimas concentrações diminuíram. Um dos 
possíveis erros para explicar esse comportamento do Gráfico 2, pode-se ser devido 
a má homogeneização da amostra, após o preparo; problemas com os reagentes ou 
até mesmo, a temperatura de aquecimento, onde pode ter ocorrido perda de calor. 
5. CONCLUSÃO 
 
Com a realização da prática foi possível observar que a determinação de 
açúcares redutores pelo método espectrofotométrico do 3,5 DNS se mostrou rápido 
e eficaz, mesmo com possíveis erros, possuindo o melhor tempo de hidrólise da 
sacarose de 2 minutos. 
 
6. REFERÊNCIAS 
1. DORNEMANN, Guilherme Moraes. ​Comparação de métodos para 
determinação de açúcares redutores e não-redutores​. 2016. 
2. GONÇALVES, C.; RODRIGUEZ-JASSO, R. M.; GOMES, N.; TEIXEIRA, J. A.; 
BELO, I. ​Adaptation of dinitrosalicylic acid method to microtiter plates​. 
Analytical Methods, London, v. 2, p. 2046-2048, 2010. 
3. DOS SANTOS, Gabriela Lima; GEMMER, Ruan Ezequiel; OLIVEIRA, Eniz 
Conceição. ​Análise de açúcares totais, redutores e não-redutores em 
refrigerantes pelo método titulométrico de Eynon-Lane​. Revista 
Destaques Acadêmicos, v. 8, n. 4, 2016. 
4. VASCONCELOS, N. M.; PINTO, G. A. S.; DE ARAGAO, F. A. S. 
Determinação de açúçares redutores pelo ácido 3, 5-dinitrosalicílico: 
histórico do desenvolvimento do método e estabelecimento de um 
protocolo para o laboratório de bioprocessos​. Embrapa Agroindústria 
Tropical-Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento (INFOTECA-E), 2013. 
5. SILVA, R. N.; MONTEIRO, V. N.; ALCANFOR, J. A. X.; ASSIS, E. M.; 
ASQUIERI, E. R. ​Comparação de métodos para a determinação de 
açúcares redutores e totais em mel. Ciência e Tecnologia de Alimentos​, 
Campinas, v. 23, n. 3, p. 337-341, 2003. 
6. NELSON, D. L.; COX, M. M. ​Princípios de bioquímica de Lehninger​. Porto 
Alegre: Artmed, 2014. 
7. NEGRULESCU, A.; PATRULEA, V.; MINCEA, M. M.; IONASCU, C.; 
VLAD-OROS, B. A.; OSTAFE, V. ​Adapting the reducing sugars method 
with dinitrosalicylic acid to microtiter plates and microwave heating​. 
Journal of the Brazilian Chemical Society, São Paulo, v. 23, n. 12, p. 
2176-2182, 2012. 
8. AGÊNCIA NACIONAL DE VIGILÂNCIA SANITÁRIA – ANVISA. Resolução – 
RDC Nº 166, de 24 de julho de 2017. 
9. INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA, NORMALIZAÇÃO E 
QUALIDADE INDUSTRIAL (INMETRO). Orientação sobre validação de 
métodos analíticos. DOQ-CGCRE-008 – Revisão 05 – Ago/2016