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ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM POSITIVAS � Isolamento � In vitro em meios de cultura que lhes forneçam todas as condições nutricionais e ambientais necessárias ao seu crescimento. � Semeadura dos materiais clínicos em meios sólidos distribuídos em placa de Petri, em tubos de ensaio ou em outros tipos de frascos. � Incubados em temperatura e atmosfera adequadas. � O período de incubação varia de acordo com a velocidade de crescimento da bactéria 24 a 48 horas. � Material para colheita e isolamento: Abaixador de língua "Swab" e Ágar sangue � Identificação - Estreptococos � As espécies de maior interesse clínico são: Streptococcus pyogenes, Streptococcus agalactiae, Streptococcus pneumoniae. � Os Streptococcus são identificados de acordo com: beta-hemolíticos: lisam completamente as hemácias liberando hemoglobina e formando uma zona clara ao redor da colônia. alfa-hemolíticos: quando causam lise incompleta das hemáceas com liberação de pigmento verde (redução da hemoglobina) promovendo uma zona esverdeada ao redor da colônia. Gama-hemolítico: ausência de atividade hemolítica. � São utilizados testes com antimicrobianos para diferenciação de Streptococcus alfa, beta e gama hemolíticos. � Os estreptococos alfa-hemolíticos elaboram carboidratos que são utilizados em reações de precipitação com anti-soro específico, que possibilita a separação dos grupos. � Teste optoquina – Estreptococos alfa-hemolíticos � A optoquina é um farmaco solúvel em água que se difunde rapidamente em meio de cultura sólido. Faz a leitura do halo de inibição do crescimento bacteriano � Teste da Bacitracina - Estreptococos β-hemolíticos � O teste tem a finalidade de diferenciar S. pyogenes de outras cepas do grupo A de outros grupos de Streptococcus βhemolíticos. � Teste de Camp � O teste visa a identificação de linhagens de S. agalactiae (grupo B). � A formação de uma seta ou meia-lua convergindo para o S.aureus na intersecção do crescimento das duas bactérias indica que o teste é positivo e indicativo de S.agalactiae; � Se não houver formação de seta ou meia-lua, o teste é negativo. � Identificação – Estrafilococos � As três espécies de maior interesse clínico são: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus. � Identificação e diferenciação a)Atividade enzimática: Prova da coagulase - se há formação de coágulo. O Staphylococcus aureus é produtor de coagulase. Staphylococcus epidermidis, não produtor de coagulase, é usualmente considerado não patogênico mas pode estar envolvido em certas situações clínicas: endocardite bacteriana, em cirurgia com prótese, em transplante de medula e em cateterismo venoso. b) Sensibilidade a novobiocina - verificar a formação de um halo de inibição. Esse teste diferencia o S. saprophyticus (resistente ao farmacoa) do S. epidermidis (sensível a droga). O S. saprophyticus é causa relativamente freqüente de infecção do trato urinário em pacientes jovens. c) Teste de Fermentação do Manitol - Verificar se o microrganismo tem a capacidade de fermentar o manitol. Formação de halo amarelo ao redor das colônias, identifica Staphylococcus aureus. d) Teste da Catalase - O teste da catalase é utilizado para diferenciar os estafilococos (catalase positiva) dos estreptococos (catalase negativa). Procedimento: Colocar uma gota de peróxido de hidrogênio (água oxigenada) sobre uma lâmina; Com auxílio de fio bacteriológico, agregar a colônia em estudo na gota de peróxido de hidrogênio. Positivo: Presença imediata de bolhas - a produção de efervescência indica a conversão do H2O2 em água e oxigênio gasoso. Negativo: Ausência de bolhas ou efervescência. ANTIBIOGRAMA: TÉCNICAS DE PREPARAÇÃO E INTERPRETAÇÃO Determinar a sensibilidade e a resistência de determinado microrganismo a antimicrobianos. A identificação de bactérias isoladas de espécimens clínicas necessita de teste complementar para determinar o perfil de sensibilidade daquela espécie frente a quimioterápicos antimicrobianos (Antibiograma). As drogas disponíveis no combate àquela infecção, são estudadas por grupos e em concentrações padronizadas. Um segundo tipo de teste de sensibilidade é realizado utilizando-se espécies não patogênicos, quando se deseja estudar mecanismos de ação das drogas ou modelos de resistência antimicrobiana ou ainda para marcar uma população. Neste caso, são determinados os grupos de drogas e a concentração mínima inibitória (CMI) por método quantitativo. Método de difusão com disco (Técnica Kirby Bauer): Difusão da droga, sob forma de disco ou comprimido na superfície do meio sólido. 1. Padronização do inóculo bacteriano 2. Semeio 3. Leitura: Observar halo de inibição em torno do disco de antimicrobiano. O diâmetro deste halo é medido em mm (halômetro) e comparado com a tabela recomendada pelo C LS I . Para cada agente antimicrobiano, o diâmetro do halo poderá ser interpretado como sensível (S), resistente (R) ou intermediário (I). 4. Utilização de Drogas de baixa difusão: Halo pequeno 5. Drogas de alta difusão: Halos maiores. E-test: Teste epsilométrico, método de difusão mais avançado que permite estimar a concentração mínima inibitória (CMI), a mais baixa concentração de antibiótico que impede o crescimento bacteriano. Uma tira revestida de plástico contendo um gradiente de concentração do antimicrobiano, e a CMI pode ser lida em uma escala impressa na tira. ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS GRAM NEGATIVAS As bactérias gram-negativas incluem vários gêneros de bacilos fermentadores de carboidratos ou não fermentadores. A identificação das bactérias Gram-negativas baseiam-se principalmente em reações bioquímicas que ocorrem nos meios de cultura, resultantes do metabolismo bacteriano. ISOLAMENTO: Para o isolamento dos bacilos gram-negativos são utilizados principalmente meios seletivos diferenciais. IDENTIFICAÇÃO (Provas bioquímicas) : � Fermentação de carboidratos: Nos sistemas de provas bacteriológicas o processo de fermentação é detectado por observação visual das mudanças de cor dos indicadores de pH do meio quando os produtos ácidos são formados pelas bactérias. Os testes de fermentação de carboidratos determinam a capacidade de um microrganismo em hidrolizar determinado açúcar em meio base de vermelho de fenol, produzindo ácidos com ou sem gás. Indicador de pH: Vermelho de fenol Ácido (cor amarela) - pH < 6,8 Alcalino(cor vermelha)-pH >8,4 Neutro (cor laranja) - pH = 7,4. Resultado: POSITIVO: cor amarela -- presença de ácido (carboidrato fermentado) NEGATIVO: cor vermelha -- ausência de ácido (Carboidrato não fermentado) � Teste TSI No meio TSI distribuído em tubos de ensaio observa-se a fermentação ou não dos açúcares pelas bactérias Gram-negativas, com produção ou não de gás CO2. Também pode se observar a formação de H2S (gás sulfídrico ou sulfeto de hidrogênio) pela sua reação com o sulfato ferroso (presente no meio TSI), resultando num precipitado de sulfeto ferroso que se manifesta por uma reação visível de cor negra. Resultado e interpretação: O resultado é obtido pela visualização da mudança de cor no pico (superfície inclinada) e no fundo (profundidade) do tubo de ensaio contendo o ágar TSI: Pico alcalino/fundo alcalino - Ausência de fermentação dos açucares. Pseudomonas aeruginosa Pico alcalino/fundo ácido - Fermentação apenas da glicose. Shigella. Pico alcalino/fundo ácido e negro - Fermentação da glicose e produção de H2S. Salmonella, Proteus, Citrobacter. Pico ácido/fundo ácido - Fermentação dos três açucares. Ex: Escherichia coli, Klebsiella, � Teste de motilidade Meio SIM. A motilidade bacteriana é detectada pelo exame macroscópico do meio para se observar uma zona de crescimento difuso (turbidez) que parte da linha de inoculaçãofeita com a agulha de platina. � Teste do citrato Determinar se um microrganismo é capaz de utilizar o citrato como única fonte de carbono para seu metabolismo e crescimento. Se o citrato for utilizado, o nitrogênio (do fosfato de amônia) presente no meio também será, havendo liberação da amônia com a conseqüente alcalinização do meio. POSITIVO: meio azul (alcalino) - Utilização do citrato NEGATIVO: meio verde (neutro) - Não utilização do citrato. � Teste da lisina Determinar a habilidade enzimática de uma determinada bactéria em descarboxilar o aminoácido lisina, com a subsequente alcalinização do meio devido a formação de amina alcalina (cadaverina). POSITIVO: meio púrpura (alcalino) - Ocorreu a descarboxilação da lisina e conseqüente formação de aminas. NEGATIVO: meio amarelo (ácido) - Não ocorreu a descarboxilação da lisina. A acidificação do meio ocorre porque a bactéria fermenta uma pequena quantidade de glicose presente no meio. � Teste Indol Determinar a habilidade do organismo em produzir o indol (benzil pirrol) a partir da molécula de triptofano ou outros aminoácido presentes no meio SIM. Este teste é útil para diferenciar a E.coli (indol positiva) de outras enterobactérias. O desenvolvimento de uma cor vermelha na superfície do meio após a adição do reativo indica a presença de indol e uma prova positiva. � Teste Urease Determinar a habilidade de um microrganismo em degradar enzimaticamente a uréia pela urease com a formação de duas moléculas de amônia (NH3), resultando na alcalinização do meio. POSITIVO: meio rosa (alcalino) - Presença de urease NEGATIVO: meio amarelo (neutro) - Ausência de urease
