Prática Propriedades Protéicas Unidade 3 Prát Cinética Enzimática Unidade 4 Prát

Prévia do material em texto

BIOQUÍMICA - SDE4452
Semana Aula: 5
Prática: Propriedades Protéicas (Unidade 3 Prát.) / Cinética Enzimática (Unidade 4 Prát.)
Tema
Prática: Propriedades Protéicas (Unidade 3 Prát.) / Cinética Enzimática (Unidade 4 Prát.)
Palavras-chave
cinética enzimática
Objetivos
O aluno deverá ser capaz de:


 Conhecer o comportamento molecular das proteínas frente à variações de 
temperatura (desnaturação térmica), pH (desnaturação por adição de ácidos) e 
de concentração de sal (efeitos ?salting in? e ?salting out? ? precipitação 
protéica);


 Observar os principais fatores interferentes em uma reação enzimática, como 
variação na concentração do substrato, de temperatura e de pH.
Estrutura de Conteúdo
Plano de Ensino
Introdução teórica dos assuntos propostos e dos cuidados no manuseio dos reagentes.
 
Unidade III - PROPRIEDADES DAS PROTEÍNAS.
3.1. Desnaturação protéica (térmica e ácida)
Avaliar o processo de desnaturação da preteína da clara do ovo (perda da natureza solúvel e da 
estrutura física, devido à perda das interações químicas pelo calor excessivo ou por excesso de 
variação de pH).
3.2. Precipitação protéica (salting out)
Avaliar o processo de precipitação e separação das proteínas solúveis, por adição de solução 
saturada de sal divalente, por exemplo, sulfato de amônio saturado.
3.3. Solubilização protéica (salting in)
Observar e analisar a possibilidade de renaturação da proteína após desnaturação térmica e 
ácida e após precipitação por ?salting out?.
 
Unidade IV - ENZIMAS
4.1. Fatores que interferem na atividade enzimática (pH, temperatura e concentração do 
substrato) 
Analisar a atividade enzimática em diferentes condições, como em diferentes faixas de pH (3,5; 
7,4 e 10,5), em diferentes temperaturas (4; 37 e 75 graus) e em diferentes concentrações de 
substrato (diluição seriado do substrato).
Estratégias de Aprendizagem
Indicação de Leitura Específica
Aplicação: articulação teoria e prática
Utilizar roteito de aula prática, previamente preparado.
Sugestão de roteiro:
 
1. DESNATURAÇÃO TÉRMICA
Em tubo de ensaio, colocar 2,0 ml da solução de proteínas. Aquecer até fervura (ou no máximo 
até 8 minutos). Observar se ocorreu alguma modificação. Centrifugar por 3min. Separar o 
sobrenadante (se houver), retirando-o com pipeta pasteur e transferindo a um novo tubo limpo. 
Adicionar salina (2,0 ml) ao precipitado (se houver) e agitar. Adicionar 1,0mL de biureto no 
sobrenadante e agite. Anote o que observou.
2. DESNATURAÇÃO ÁCIDA
Em tubo de centrífuga, coloque 2,0 ml da solução de proteínas. Adicione 1,0 ml de ácido 
tricloroacético (TCA) a 10% (CUIDADO! Este ácido é apresenta poder corrosivo). Agite e observe 
o que ocorre. Centrifuge por 3 min, separe o sobrenadante em novo tubo. Faça a reação do 
biureto no sobrenadante (como no item 2), nesta fração. Ao precipitado, adicione salina (2,0 ml) 
e anote sua observações.
3. PRECIPITAÇÃO PELO SULFATO DE AMÔNEO SATURADO (SALTING OUT)
Em tubo de centrífuga, 2,0 ml de solução de proteínas e adicionar 2,0 ml da solução saturada de 
sulfato de amônio (SAS). Separe o sobrenadante cuidadosamente. Ao precipitado, adicionar 4,0 
ml de água destilidada e agitar. Anote as observações. Caso não ocorra solubilização, lave 
novamente com salina, descarte o sobrenadante e adicione novamente 4,0 ml de salina ao 
precipitado. Ao sobrenadante, faça o teste do biureto. Anote sua observações.
COMPARAR OS RESULTADOS ENTRE OS TRÊS PROCESSOS.
Considerações Adicionais