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FACULDADE DE MEDICINA DA BAHIA FMB-UFBA 2009.2 RESUMOS: Biologia Molecular e Celular Acadêmica de medicina – 2009.2 U N I V E R S I D A D E F E D E R A L D A B A H I A Índice de Resumos Processamento e Edição de RNA Processamento e Reciclagem do RNA Tradução do RNA em Proteína Recepção e Transdução de Sinais Estrutura e regulação da fluidez Microtúbulos Microfilamentos Filamentos intermediários Sistema de endomembranas: 1. Núcleo 2. Retículo Endoplasmático 3. Complexo de Golgi 4. Lisossomos Transporte e Endocitose Processamento e Edição de RNA 1-Caracterize as fases do ciclo celular em eucariot os. O ciclo celular em eucariotos é dividido em 4 fases distintas: A fase M do ciclo corresponde a mitose, é nessa fase que o material genético já duplicado é dividido igualmente entre as células filhas. Essa fase é seguida pela fase G1 , que corresponde ao intervalo entre a mitose e o inicio da duplicação do DNA. Durante a essa fase a célula está metabolicamente ativa e continua crescendo, só não duplica seu DNA. É seguida pela fase S , onde é feita a replicação do material genético. A conclusão da síntese do DNA é seguida pela fase G 2, durante a qual o crescimento celular continua e as proteínas são sintetizadas em preparação para a mitose. 2-O corpo humano é composto por de 200 tipos defere ntes de células, considerando a funcionalidade do ponto de restrição no controle do ciclo celular de células animais, por que alguns tipos celulares seguem reproduzindo-se c onforme a ordem dos eventos do ciclo celular e outras entram em um estado quiescen te G0? Apresente exemplos das duas situações. Algumas células do corpo seguem incessantemente reproduzindo-se seguindo a ordem dos eventos do ciclo celular estimuladas por fatores externos ou internos, enquanto algumas, cessam completamente a divisão e muitas outras se dividem apenas ocasionalmente, quando necessário para repor células que foram perdidas por ferimento ou morte celular. Estas células saem de G1 e entram em um estágio quiescente do ciclo chamado de G0, permanecendo metabolicamente ativas, mas não proliferam mais, a menos que sejam estimuladas por sinais de crescimento apropriados ou outros sinais extracelulares. Isso acontece, pois fatores de crescimento apropriados não estão presentes em G1, o ciclo celular para no ponto de restrição conhecido como START(leveduras) ou Ponto de Restrição(animais) e não segue para a fase S. Como exemplos das duas situações pode-se citar as células da mucosa bucal que estão seguindo constantemente o ciclo celular e reproduzindo-se para repor perdas, enquanto células como fibroblastos da pele ficam no estágio G0, até que sejam estimulados a se dividirem para reparar danos de um ferimento. 3- Identifique condições nas quais o ciclo celular pode ser interrompido durante a passagem pelos pontos de verificação, relacionando com o aparato protéico utilizado pelas células para a execução deste tipo de control e. A coordenação entre diferentes fases do ciclo celular é dependente de uma serie de pontos de verificação do ciclo celular que impedem a entrada para a próxima fase do ciclo até que eventos da fase anterior tenham sido completados. O principal fator que interfere na continuidade do ciclo celular é a presença de danos no DNA, assim como o não pareamento correto dos cromossomos na metáfase e replicação incorreta. O bloqueio do ciclo celular nos pontos de verificação G1, S e G2 é iniciado por um complexo de proteínas que se liga ao DNA danificado ou não-replicado. Essas proteínas são as sensoras do dano no DNA e servem para ativar uma via de sinalização que resulta não só no bloqueio do ciclo celular, mas também na ativação do reparo do DNA, e em alguns casos, na morte celular programada. 4- Analise o papel da família de proteínas MCM para o controle do ciclo celular e relacione com eventos durante a replicação do DNA. Uma vez que um segmento do DNA tenha sido replicado na fase S, devem existir mecanismos de controle para impedir o reinicio da replicação do DNA até que o ciclo celular tenha sido completado e a célula tenha sofrido mitose. O mecanismo molecular que restringe a replicação do DNA para uma vez por ciclo celular envolve a ação de uma família de proteínas(chamadas de proteínas MCM) que se ligam a origem de replicação juntamente com as proteínas do complexo de replicação(ORC). As proteínas MCM atuam como “fatores de licenciamento”, permitindo que a replicação seja iniciada. Suas ligações com o DNA são reguladas durante o ciclo celular de tal modo que as proteínas MCM sejam somente capazes de se ligarem à origem de replicação durante a fase G1. 5-Analise o funcionamento das ciclinas e de Cdks (q uinases dependentes de ciclinas) no controle do ciclo celular, considerando seus pontos de verificação e sinais que atuam em sua inibição. Os ciclos celulares de eucariotos superiores são controlados não somente por múltiplas ciclinas, mas também por múltiplas proteinoquinases, conhecidas como Cdk’s(quinases dependentes de ciclinas). Esses múltiplos membros da família Cdk associam-se com ciclinas específicas, impelindo o curso através de diferentes estágios do ciclo celular passando pelos pontos de verificação. As atividades das Cdk’s durante o curso do ciclo celular são reguladas por pelo menos quatro mecanismos moleculares. O primeiro nível de regulação envolve a associação de Cdk’s com suas ciclinas parceiras, a formação do complexo específico Cdk/ciclina é controlada pela síntese e degradação da ciclina. O segundo, a ativação do complexo Cdk/ciclina necessita da fosforilação de um resíduo de treonina conservado em Cdk em torno da posição 160 para ser ativado, enquanto a fosforilação da treonina 14 e 15 inibem sua ação. Além disso, suas atividades também podem ser controladas pela ligação de proteínas inibitórias(chamadas de inibidores de Cdk ou CKIs) para o complexo Cdk/ciclina. Na verdade essas proteínas podem desempenhar papeis diferentes: ativando ou inibindo a depender do estágio do ciclo celular. Os pontos de verificação estão envolvidos na passagem de G1 para S bem como de G2 para M. 6-Relacione a possibilidade do surgimento de câncer envolvendo alterações do funcionamento de proteínas com a ciclina D e Rb. A síntese da ciclina D é induzida em resposta à estimulação por fatores de crescimento, essa ciclina impele as células através do ponto de restrição de G1. Sem a presença de fatores de crescimento elas são rapidamente degradadas. A capacidade de indução e a rápida rotatividade das ciclinas do tipo D integram a sinalização através de fatores de crescimento e a maquinaria do ciclo celular, permitindo que a disponibilidade de fatores de crescimento extracelular controle o curso das células através de G1. Defeitos na regulação da ciclina D podem contribuir para a perda da regulação do crescimento, características de células cancerosas. A Rb é o protótipo de um gene supressor de tumor, que atua como um freio que diminui o curso do ciclo celular, sua inativação leva ao desenvolvimento do tumor. A atividade de Rb é regulada por mudanças em suas fosforilações conforme a célula prossegue através do ciclo. 7-Analise o envolvimento do MPF em eventos da mitos e A mitose envolve mudanças dramáticas em múltiplos componentes celulares, levando a uma reorganização importante na estrutura celular como um todo. Esses eventos são iniciados pela ativação da proteinoquinase MPF(Cdc2/ciclina B). Ela não somente atua como o regulador- mestre da transição da fase M, fosforilando e ativando outras cascatas de proteinoquinases, mas também atua diretamente na fosforilação das proteínas estruturais envolvidas na reorganização celular. Ela desencadeia reações como: condensaçãoda cromatina; ruptura do envelope nuclear; fragmentação do complexo de Golgi e do Retículo Endoplasmático e formação do fuso. 8- Descreva a ação do MPF no controle da meiose. Assim como na fase M das células somáticas a meiose dos oócitos é controlada pelo MPF, sendo que sua regulação é responsável pela progressão da Meiose I para a Meiose II e pelo bloqueio na metáfase II. A estimulação hormonal dos oóciots leva a ativação do MPF. A ativação do complexo de desenvolvimento da anáfase leva a um decréscimo na atividade do MPF. Após a citocinese a atividade MPF é novamente elevada permanecendo alta enquanto o ovulo está bloqueado na metáfase II. A ação do MPF na meiose é induzir a condensação cromossômica, a ruptura do envelope nuclear e a formação do fuso. 9-Discuta a proliferação celular no desenvolvimento , considerando a diferenciação celular. As células de animais adultos podem ser agrupadas em três categorias gerais. Primeiro, células diferenciadas que não são capazes de realizar diferenciação celular e não podem ser substituídas se forem perdidas devido a lesão ou morte celular. A exemplo tem-se as células do músculo cardíaco. Outros tipos de células diferenciadas retém a capacidade de proliferar e entram no estágio de G0, mas retornam a proliferação quando necessário, em caso de respostas devido a dano ou morte celular. A exemplo de fibroblastos da pele e células endoteliais que revestem os vasos sanguíneos. A maioria das células completamente diferenciadas entretanto não mais está apta para a divisão celular. Mas podem ser substituídas pela proliferação de células menos diferenciadas chamadas de células tronco, presentes nos tecidos dos animais adultos bem como em embriões. E são capazes de transformarem-se em quaisquer células do organismo, desempenhando papel importante na manutenção e desenvolvimento celulares. Processamento e Reciclagem do RNA Processamento do RNA Ribossomal: O processo básico de processamento de RNA ribossomal é similar em pró e eucariotos. São constituídos por 4 subunidades. Três dos quais(5,8S 18S e 28S) são derivados da clivagem de um único precursor longo(pré-RNAr) em eucariotos. O único que não sofre esse tipo de processamento é o 5S, transcrito de um gene separado. A subunidade menor(40S) é constituída de proteínas associadas ao 18S, e as demais associam-se a proteínas ribossomais para formar a subunidade maior(60S). O processamento ocorre através dos processos de clivagem do pré-RNAr na extremidade 5’ seguido da metilação de bases e açucares de nucleotídeos específicos. Processamento do RNA transportador: Os pré-RNAs transportadores sofrem também clivagem na sua extremidade 5’ por uma RNase P(ribosima) – complexo de enzimas e proteínas. Na extremidade 3’ ocorre a adição da terminação CCA também realizada por uma RNase. Essa sequência é o sítio de ligação do aminoácido, ela é codificada pelo DNA ou é adicionada posteriormente. Além disso ocorre a alteração de algumas bases da cadeia e splicing. Esse processo é similar em procariotos. Processamento do RNA mensageiro: Representa a maior diferença entre células procarióticas e eucarióticas. Em bactérias os ribossomos tem acesso imediato ao RNAm e a tradução se dá enquanto a transcrição ainda está em progresso. Já em eucariotos antes de ser exportado do núcleo para ser traduzido o RNAm passa por um estágio de processamento que se ocorre em paralelo a transcrição. O processamento inclui a modificação de ambas as extremidades do transcrito inicial(pré- RNAm). O primeiro passo é a adição de uma estrutura chamada cap de 7-metilguanosina(cap de 5’). As enzimas responsáveis pela colocação do cap de 5’ são recrutadas ao CTD fosforilado da Polimerase II imediatamente após o inicio da transcrição. O cap de 5’ estabiliza o RNA, assim como alinha os mRNAs durante a tradução. A extremidade 3’ é determinada pela clivagem do transcrito primário e adição de uma cauda de Poli-A(poliadenilação) pela poli-A Polimerase que também está associada com o CTD fosforilado. Tal clivagem e pliadenilação sinalizam o termino da transcrição. A cauda de poli-A regula tanto a tradução como a estabilidade do RNAm. Os sinais para que ocorra apoliadenilação são a presença de um exonucleotidio(AAUAAA) e um elemento em sequência rico em GU próximo a 3’.A modificação mais marcante dos pré-mRNA é a remoção dos íntros por splicing. OB: Óvulos não fertilizados tem poli-A curta que são alongadas após a fertilização. Processo de Splicing: Ocorre em duas etapas: primeiro o pré-mRNA é clivado no sítio 5’ de splicing sendo a extremidade 5’ do íntro unida a um nucleotídeo de adenina dentro do íntron perto de sua extremidade 3’ , nessa etapa é formada uma ligação entre a extremidade 5’ do íntro e o grupo 2’-hidroxila do nucleotídeo de adenina(ponte d erammificação), o intermediário resulta em um laço e com o íntro formando uma alça. Na segunda etapa ocorre dois eventos simultâneos, clivagem do sítio 3’ de splicing e a ligação dos dois éxons. Esses processos é realizado por um complexo chamado spliceossomo(proteínas + snRNAs – RNAs nucleares pequenos) que identificam as sequências concensso no pré-RNAm. Esses pequenos RNAs nucleares também catalisam diretamente a reação de splicing(autosplicing). Junto a isso os fatores protéicos de spling direcionam os spliceossomos para os sítios de splicing corretos e também estão associados com o CTD fosforilado, acoplando o splicing a transcrição. Splicing alternativo: É a possibilidade de juntar éxons em combinações variadas e formar diferentes mRNAs, fornecendo um importante mecanismo para regulação da expressão gênica durante o desenvolvimento e tecido específico. Edição de RNA: A edição do mRNA envolve mudanças em bases simples como resultado de reações de modificações. Incluem a desaminação da Citosina em Uridina e da Adenosina em Inosina(a forma mais comum). Degradação de RNA: A maioria das sequências transcritas em pré-RNAm(90% são íntros) é degradada no interior do núcleo logo depois do splicing. A degradação é realizada tanto por uma enzima que reconhece a ligação 2’-5’ característica formada no ponto de ramificação quanto por enzimas que reconhecem as extremidades 5’ e 3’, sendo capazes de degradar em ambas as direções. A extremidades dos mRNAs mensageiros são protegidas de degradação pelo cap de 5’ e pela poliadenilação( extremidade 3’), ao passo que as extremidades desprotegidas dos íntrons são identificadas e degradadas. As células possuem um sistema de controle de qualidade denominado decaimento do RNAm mediado pela falta de sentido que elimina as moléculas defeituosas e impede a síntese de proteínas anormais truncadas(não apresentam fases abertas de leitura). Os mRNAs ao contrário dos rRNAs e rRNAs(mais de 90% do RNA total) possuem uma meia vida pequena e o equilíbrio entre síntese e degradação corresponde a um nível adicional de controle da expressão gênica, isso ocorre no citoplasma. A degradação de muitos dos mRNAs eucarióticos é iniciada pelo encurtamento de suas caudas de poli-A, após ocorre a remoção do cap de 5’ e a degradação por nucleases atuando em ambas as extremidades. A estabilidade de alguns mRNAs também pode ser regulada em resposta a sinais extracelulares. Ex: A proteína transferrina e a presença ou ausência de ferro. Tradução do RNA em Proteína 1- Caracterize o código genético considerando a co linearidade entre genes e proteínas. Os genes são seqüências específicas do código genético capazes de transcreverem um RNA funcional(RNAt, RNAr, RNAm) usando diversas combinações entre os nucleotídeos dos quais são formados. Quando transcritos em RNAm essas moléculas são capazes de ordenar a traduçãode uma proteína pelo encaixe de RNAs transportadores em sua cadeia, pelo pareamento do seu anticódon com o códon do RNAm, tRNAs esses que trazem os aminoácidos que comporão a proteína que está se formando. Como o gene possui uma combinação de nucleotídeos que ditará a combinação do RNAm e esse por sua vez a ordem em que os aminoácidos irão se ligar na proteína, existe uma colinearidade entre gene e proteína. Nos eucariotos essa colinearidade é menor, pois os RNAs mensageiros produzidos pelos genes eucariotos frequentemente sofrem processamento antes de serem transcritos(splicing). Diminuindo a correspondência entre nucleotídeos do gene e aminoácidos da proteína. 2- Discuta a importância do amino-RNAt no processo de decodificação da informação genética. As enzimas RNAt amino sintetase são responsáveis pela ligação dos aminoácidos a RNA transportadores específicos. Primeiro, o aminoácido é ativado pela reação com ATP para formar um aminoacil AMP sintetase intermediária. O aminoácido ativado é então unido a extremidade 3’ do RNAt. O reconhecimento do RNAt correto pela RNAt aminoacil sintetase é altamente seletivo; a sintetase reconhece sequências de nucleotídeos específicas que identifica cada espécie de RNAt. Portanto essas enzimas são essenciais para que ocorra uma tradução correta nas células. Existe ainda uma revisão de leitura na qual aminoacil AMPs incorretas são hidrolisadas em vez de ser ligadas ao RNAt. OBs: alguns RNAts são capazes de reconhecer mais de um códon no RNAm, como resultado de um pareamento de bases átipico(oscilação) entre o anticódon do RNAt e a terceira posição de alguns códons complementares. 3- Analise os mecanismos que contribuem para a acur ácia do processo de tradução. A seleção correta do RNAt aminoacil para ser incorporado a uma cadeia polipeptídica em crescimento é a etapa critica que determina a precisão da síntese de proteínas. Essa precisão é fornecida por um “centro de decodificação”, localizado na subunidade ribossomial pequena, que identifica os pares de base corretos no códon-anticódon e discrimina os pares incorretos. A inserção correta de um aminoacil-RNAt em um sítio A desencadeia uma mudança de conformação que induz a hidrolise do GTP ligado ao EF-Tu e a liberação do fator de alongamento ligado ao GDP. Caso o pareamento códon-anticódon não esteja correto, antes da hidrolização, ocorre uma mau formação entre as trincas não ocorrendo a hidrólise e consequentemente havendo liberação do tRNA aminoacil. 4- Descreva o processo de tradução em procariotos e compare com os dos eucariotos considerando os elementos envolvidos. A tradução não se inicia exatamente na extremidade 5’ do RNAm; ela começa em sítios específicos de iniciação. Tanto em células procarióticas como em eucarióticas os RNAs mensageiros têm extremidades 5’ e 3’ que não são traduzidas(URT). Geralmente RNAm procariotos são policistrônicos, codificando múltiplos polipeptideos, ao passo de que os eucariotos são monocistrônicos. Mas ambos possuem sinais que identificam os códons de iniciação. Esses códons de iniciação em RNAs mensageiros bacterianos são precedidos por uma sequência específica que alinha o RNAm no ribossomo para a tradução pelo pareamento de bases com uma seqquência complementar próxima ao 3’ terminal do RNAr 16S, sequência essa conhecida como Shine-Delgarno. Essa interação pelo pareamento de bases permite que os ribossomos procarióticos iniciem a tradução não somente na extremidade 5’ de um mRNA, mas também nos sítios de iniciação internos de mensagens policistronicas. Em seres eucarióticos o RNAm é reconhecido pela ligação ao cap 7-metilguanosina em sua extremidade 5’(cap de 5’). Os ribossomos procuram a partir do cap de 5’ um códon de iniciação AUG(metionina). A tradução sempre inicia com o aminoácido metionina, nas bactérias geralmente essa metionina é modificada(N- formilmetionina). O processo de tradução é divido em três estágios: iniciação, alongamento e terminação. Tanto em procariotos como em eucariotos o primeiro passo da iniciação é a ligação de um iniciador específico de RNAt metionil e do RNAm à subunidade ribossomial pequena. Logo depois a subunidade grande se liga ao complexo formando um ribossomo funcional. Nesse processo são necessárias proteínas chamadas de Fatores de Iniciação. Quando o códon AUG é alcançado os fatores de iniciação são liberados e as duas subunidades ribossomiais se juntam e começa a fase de alongação. Essa fase é caracteriza pela ligação dos RNAst específicos nos sítios E(saída), P(peptidil) e A(aminoacil) do ribossomo. Os RNAt-aminoacil são ligados no sítio A, sendo acompanhados pelos fatores de alongamento complexados ao GTP(EF-Tu). Os aminoácidos trazidos pelos RNAts vão se ligando ao tempo em que translocações vão ocorrendo, fazendo o ribossomo se mover três nucleotídeos sobre o RNAm de cada vez. Etapa essa que também necessita de fatores de alongamento. Esse alongamento da cadeia polipeptídica continua até que um códon de parada (UAA, UAG e UGA) seja translocado no sítio A do ribossomo. Os fatores de liberação reconhecem esses sinais e terminam a síntese, estimulando a hidrólise da ligação entre o RNAt e a cadeia polipeptídica no sítio P, resultando na liberação do polipeptídio do ribossomo. 5- Considerando diferenças entre fatores durante o processo de tradução procariótico e eucariótico pesquise sobre a especificidade de anti bióticos. Inibição da tradução: São geralmente bastante seletivos. Correspondem a um dos principais grupos de agentes antimicrobianos, uma vez que a síntese protéica corresponde a processo altamente complexo, envolvend várias etapas e diversas moléculas e estruturas. estreptomicina e gentamicina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S, bloqueando-a e promovendo erros na leitura do mRNA. Interferem com a formação do complexo de iniciação. tetraciclina: Liga-se à subunidade ribossomal 30S (sítio A), impedindo a ligação do aminoacil- tRNA. cloranfenicol: Liga-se à subunidade ribossomal 50S e inibe a ligação do tRNA e da peptidil transferase, inibindo a elongação. eritromicina: Liga-se à subunidade ribossomal 50S e inibe a elongação. 6- Analise mecanismos de regulação da tradução, con siderando o envolvimento de proteínas repressoras, a modulação da atividade de fatores de iniciação e a poliadenilação do RNAm. Dentre os mecanismos regulatórios da tradução gênica podem ser destacados: A ligação de proteínas repressoras, que bloqueiam a tradução, a sequências específicas do RNAm. Na verdade a ligação da mesma proteína regulatória a diferentes sítios nas moléculas de RNAm pode, desta forma, ter efeitos distintos na expressão gênica, em um caso inibindo a tradução e em outro caso estabilizando o RNAm para aumentar a síntese protéica. Essas proteínas agem nos mRNAs dependentes de fatores como estágio de desenvolvimento das células específicas. A tradução pode ser também regula por RNAs não-codificadores que são homólogos a um seguimento da sequência de RNAm, e atuam desencadeando a degradação dos RNAms-alvo. Através de mecanismos de interferência de RNA. A modulação da atividade dos fatores de iniciação envolve efeitos globais na atividade de tradução total em vez da tradução de RNASm específicos. Essa regulação age inibindo a iniciação da tradução pela fosforilação de fatores específicos de iniciação(IF-2 e IF-2B). Os fatores de iniciação eucarióticos reconhecem tanto a extremidade 5’ como a 3’ dos RNAs mensageiros e o tRMA metionil, sendo responsáveis pelo efeito estimulatório da Poliadenilação na tradução, alongando a cauda poli-A para que mRNAs possam ser traduzidos(ocorre nos – oocitos). Recepção e Transdução de Sinais 1. Identifique modelos de sinalização célula-célula . A sinalização celular pode resultar tanto na interação de uma célula com uma célula vizinha ouda ação de moléculas sinalizadoras secretadas. A sinalização por interação direta célula-célula(ou célula-matriz) desempenha um papel crítico na regulação do comportamento das células nos tecidos animais, são moléculas sinalizadoras que regulam a proliferação e a sobrevivência celular em resposta aos contatos célula-célula e célula matriz. As múltiplas variedades de sinalização por moléculas secretadas são divididas em três categorias gerais, baseadas nas distâncias em que os sinais são transmitidos. Na sinalização endócrina as moléculas sinalizadoras(hormônios) são secretadas por células endócrinas especializadas e transportadas através da circulação para atuarem sobre células alvo localizadas em órgãos distantes. Na sinalização parácrina uma molécula liberada por uma célula atua sobre células alvo vizinhas(ex: neurotransmissores). E na sinalização autócrina algumas células respondem à sinalização de moléculas que elas mesmas produzem(ex: linfócito T e células cancerígenas). 2. Caracterize tipos de moléculas sinalizadoras. Todas as moléculas sinalizadoras atuam por meio da ligação a receptores expressos por suas células-alvo. Esses receptores são expressos na superfície das células-alvo, mas alguns receptores são proteínas intracelulares, as quais respondem a pequenas moléculas sinalizadoras hidrofóbicas capazes de se difundirem através da MP. Tipos: Hormônios Esteróides : são hidrofóbicos, por isso se difundem através da MP e ligam-se aos receptores nucleares, que são fatores de transcrição que contém domínios relacionados com ligação ao ligante, ligação ao DNA e ativação de transcrição. A ligação ao ligante regula suas funções como ativador ou repressor de genes alvo. De modo que esses hormônios e moléculas afins (hormônio da tireóide, vit D e ac. retinóico) regulam diretamente a expressão gênica. NO e CO: são gases simples com sinalização parácrina. O NO é importante no sistemas nervoso, imune e circulatório, atuando através da alteração de enzimas alvo intracelulares. É instável, possui meia-vida de somente alguns segundos e age na dilatação dos vasos sanguíneos. O CO tem ação semelhante e também atua na dilatação dos vasos. A síntese de ambos é estimulada por meio de neutransmissores. Neurotransmissores : são pequenas moléculas hidrofílicas que transportam sinais entre neurônios ou dos neurônios para células-alvo (ex. cel. musculares). Incapazes de atravessar a MP, consequentemente atuam por ligação a receptores da superfície celular. Muitos receptores são canais de íons abertos por ligantes, e outros são acoplados a proteínas G. São liberados em resposta a chegada de um potencial de ação. Alguns atuam como hormônios. Por exemplo, a adrenalina produzida pela glândula adrenal que sinaliza a degradação de glicogênio nas células musculares. Hormônios peptídios e fatores de crescimento : atuam através de receptores da superfície celular. Constituem a mais ampla variedade de moléculas sinalizadoras nos animais. Incluem hormon. peptídeos, neuropeptídeos e uma série de fatores de crescimento polipeptídeos. Os hormon. peptídeos (insulina e horm. produzidos pela hipófise). Neuropeptídeos são secretados por certos neurônios, podendo funcionar como neutransmissores e, alguns, também como neuro-hormônios (ex. encefalinas e endorfinas). Os fatores de cresc.. polipeptídeios incluem uma variedade de moléculas que controlam o cresc. e a diferenciação em células animais (ex. citocinas, que regulam o desenvolvimento e a diferenciação das células do sangue e controlam as atividades de Linfócitos durante a resposta imune. Anormalidades na sinalização dos fatores de crescimento são a base para uma variedade de doenças, incluindo muitos tipos de câncer. Eicosanóides : todos são formados a partir do ac. aracdônico (formado de fosfolipídeos) e agem por meio de ligação aos receptores na superfície da célula. São uma classe de lipídios que são rapidamente destruídas, por isso funcionam na sinalização parácrina e autócrina. Incluem as Prostaglandinas, Prostaciclina, Tromboxanos e Leucotrienos. Estimulam uma variedade de respostas em células alvo, incluindo agregação plaquetária, inflamação e contração do músculo liso. OBS: A primeira etapa na via que leva a síntese de prostaglandinas ou tromboxanos é a conversão do ac. aracdônico em prostaglandinas H2. Curiosamente, a enzima que catalisa essa reação (ciclooxigenase – COX) é o alvo da aspirina e outras drogas antiinflamatórias não esteróides. Por meio da inibição da síntese das prostaglandinas, a aspirina reduz a inflamação e a dor. Pela inibição da síntese do tromboxano, a aspirina também reduz a agragação plaquetária e a coagulação sanguínea. Fitormônios: regulam o crescimento e o desenvolvimento das plantas. 3. Descreva a ação dos receptores acoplados à prote ína G. A família mais ampla de receptores de superfície celular transmitem sinais para alvos intracelulares pela ação intermediária de proteínas de ligação ao nucleotídeo guanidina (proteína G). Os receptores acoplados à proteína G são estrutural e funcionalmente proteínas caracterizadas por sete alfa hélices transmembranas paralelas. A proteína G é composta por três subunidades, a saber, alfa, beta e gama (heterotrimétrica). A alfa liga nucleotídeos guanidina, os quais regulam a atividade da proteína G. Em repouso, alfa está ligado a GDP, em um complexo com beta e gama. A ligação de ligantes (hormônios) ao domínio extracelular desses receptores induz uma mudança de conformação que permite ao domínio citosólico do receptor ligar-se a uma proteína G associada com a face interna da MP. Esta interação estimula a liberação de GDP ligado a subunidade alfa e a sua posterior troca por GTP. Então a subunidade alfa-GTP ativada dissocia-se do complexo beta-gama. Assim, tanto a subunidade alfa como a beta-gama interagem com seus alvos para obter uma resposta intracelular. A atividade da subunidade alfa é terminada pela hidrólise do GTP ligado e, desta forma, a subunidade alfa inativa (agora ligado ao GDP), se associa novamente com o complexo beta-gama, pronta para iniciar o ciclo mais uma vez. Está interação entre a proteína G e a MP dissocia o receptor e transporta o sinal para um alvo intracelular que pode ser tanto uma enzima como um canal de íons. A família de receptores acoplados a proteína G incluem grande número de receptores que são responsáveis pelo olfato, visão e paladar. 4. Compare o processo de ativação de receptores pro teína-tirosina quinases com o de receptores de citocinas. Os dois receptores compartilham uma organização estrutural comum: um domínio N terminal estracelular de ligação ao ligante, uma única alfa-hélice transmembrana e um domínio citósolico C terminal. Os receptores de proteína-tirosina quinase estão ligados diretante a enzimas intracelulares e atuam fosforilando seus substratos protéicos nos resíduos de tirosina. Inclui os receptores para a maioria dos fatores de crescimento polipeptideos, e dessa forma estão envolvidos no mecanismo de sinalização no controle de crescimento e desenvolvimento de células animais. A ligação de ligantes aos domínios extracelulares ativa seus domínios citosólicos quinase, resultando tanto em fosforilação dos próprios receptores como das proteínas alvo intracelulares. Essa auto fosforilação(causada pela dimerização induzida pelo ligante) desempenha duas funções-chave. Primeiro, a fosforilação dos resíduos de tirosina dentro do domínio catalítico pode desempenhar uma função regulatória por aumento da atividade do receptor proteíno-quinase. Segundo, criar sítios de ligação específicos para proteínas adicionais que trasmitem a cascata de sinais intracelulares dos receptores ativados. Assim, a associação dessas proteínas com receptores autofosforilados representa a primeira etapa na transmissão intracelularde sinais. Já os domínios citosólicos dos receptores de citosina são desprovidos de qualquer atividade catalítica conhecida. Eles funcionam em associação com proteínas tirosinas quinases não receptoras, as quais são ativadas como resultado da ligação do ligante. A primeira etapa da sinalização é a dimerização do receptor induzida pelo ligante e a fosforilação cruzada das proteínas tirosina quinases não receptoras não associadas(Janus quinase ou JAK). Essas quinases ativadas então fosforilam o receptor providenciando sítios de ligação de fosfotirosina para o recrutamento da cascata de sinalização que contem domínios SH2. Essas combinações de receptores citocina mais proteínas tirosina quinases não-receptores associadas funcionam de forma análoga ao receptor proteína tirosina quinase. 5. Identifique e caracteriza receptores ligados a o utras atividades enzimáticas. Embora a imensa maioria dos receptores ligados a enzimas estimule a fosforilação da tirosina, alguns receptores estão associados a outras atividades enzimáticas. Dentre eles temos: As proteínas-tirosina fosfatases atuam removendo grupos fosfatos de resíduos fosfotirosina, contrabalanceando os efeitos de protínas tirosina quinase. A proteína serina/treonina quinase são proteinoquinases que fosforilam resíduos de serina ou treonina em vez de tirosina. Os receptores guanilil ciclases tem um domínio estracelular de ligação ao ligante, que estimula a atividade da ciclase, levando a formação de GMP cíclico( um segundo mensageiro intracelular). 6. A partir de exemplos, caracterize diferentes via s de transdução de sinal intracelular. A maioria dos receptores de superfície celular estimulam enzimas-alvo intracelulares que servem como elementos da cascata de sinalização que propaga e amplifica o sinal iniciado pela ligação do ligante. Na maioria dos casos, uma cadeia de reações transmite sinais da superfície da célula para uma variedade de alvos intracelulares(transdução de sinal intracelular ). Assim vias de sinalização intracelular conectam a superfície celular com o núcleo, levando a modificações na expressão gênica em resposta a estímulos extracelulares. Os alvos de tais vias de transcrição frequentemente incluem fatores de transcrição. A via do cAMP : A sinalização da degradação de glicogênio em células musculares assim como a regulação de canais de íons envolvidos no sentido do olfato é mediada pela via do cAMP. O cAMP é formado a partir do ATP pela ação da Adenil ciclase e é degradado à ATP a partir da ação da cAMP fosfodiesterase. Ele geralmete funciona como um segundo mensageiro(o primeiro mensageiro é o hormônio). A ligação de cAMP a proteína quinase A, nas subunidades regulatórias, induz uma mudança conformacional que leva a dissociação das subunidades catalíticas as quais, dessa forma, se tornam enzimaticamente ativas e aptas a fosforilar resíduos serina em suas proteínas-alvo. A via do GMP cíclico : O GMP cíclico(cGMP) também é um segundo mensageiro(sendo o primeiro óxido nítrico, monóxido de carbono, ligantes peptidios ou estimulo luminoso), é formado a partir de GTP pela guanil ciclase e degradado até GMP por uma fosfodiesterase. A função mais bem caracterizada de cGMP está nos olhos dos vertebrados, onde converte o sinal visual recebido na forma de luz em impulsos nervosos ( dados pelas mudanças nos níveis de cGMP nos bastonetes da retina). Frequentemente essa ação é dependente da ativação de uma proteinoquinase. Os níceis elevados de cGMP também medeiam respostas biológicas como a dilatação dos vasos sanguíneos, além de regular canais de íons. Fosfolipídios e Ca+² : essa via de sinalização está baseada no uso de segundos mensageiros derivados do fosfolipídio de membrana fosfatidilinositol 4,5 bifosfato(PIP2). Uma variedade de hormônios e fatores de crescimento estimula a hidrólise de PIP2 pela Fosfolipase C produzindo então dois segundos mensageiros, que são o diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato(IP3) . Então é disparada uma cascata dupla de sinalização intracelular. O diacilglicerol ativa a proteína serina treonina quinase(pertencente a família da proteína quinase C), promovendo o crescimento de tumores em animais. A IP3 atua para sinalizar a liberação de Ca+2 das reservas intracelulares participando da contração muscular. A Via da Ras, Raf e MAP Quinase: essa via refere-se a uma cascata de proteínas quinases. Os elementos centrais são uma família de proteína serina treonina quinase chamadas de MAP Quinase que são ativadas em resposta a uma variedade de fatores de crescimento e outras moléculas sinalizadoras. A ativação de Ras(proteína de ligação a GTP que é inativada quando ligada ao GDP) leva a ativação da proteína serina treonina quinase Raf que fosforila e ativa uma segunda proteína quinase chamada de MEK que por sua vez ativa membros da família ERK por fosforilar tanto resíduos de treonina como tirosina. Uma vez ativada ERK fosforila vários alvos incluindo outras proteínas quinases e fatores de transcrição. Alguns membros da família MAP Quinase como por exemplo ERK levam a principalmente a proliferação, sobrevivência e diferenciação celular, já outros como a via JNK e p38 MAP Quinase muitas vezes levam a inflamação e morte celular. A especificidade da sinalização da MAP Quinase é mantida pelo menos parcialmente pela organização dos componentes de cada cascata de MAP Quinase como complexos associados a proteínas andaimes. A Via JAK/STAT: essa via promove uma conexão muito mais imediata entre proteínas tirosina quinases e fatores de transcrição. Nela a fosforilação de tirosina afeta diretamente a localização e função do fator de transcrição. A estimulação de receptores de citocina leva ao recrutamento de proteínas STAT(família de fatores de transcrição) que contém domínio SH2, através desses domínios elas se ligam a sequencias que contém fosfotirosina nos domínios citoplasmáticos dos receptores de citocina. Após sua associação com receptores ativados as proteínas STAT são fosforiladas por membros da família JAK de proteína tirosina quinase não-receptora que estão associadas com receptores de citocina. A fosforilação da tirosina promove a dimerização de proteínas STAT que então translocam para o núcleo onde elas estimulam a transcrição de seus genes-alvo. 7. Relacione vias de transdução de sinal com altera ções do citoesqueleto. As funções da maioria das células também são afetadas diretamente por adesão celular e organização do citoesqueleto. Os fatores de crescimento atuam para induzir alterações no citoesqueleto, resultando em movimento celular com alterações na forma da célula. Assim, componentes do citoesqueleto atuam não só como receptores mas também como alvos em vias de sinalização celular, integrando forma celular e movimento com outras respostas celulares. Alterações na mobilidade celular, assim com na proliferação celular, induzidas por fator de crescimento, desempenham papéis críticos em processos como cicatrização de feridas e desenvolvimento embrionário. Estes aspectos de comportamento celular são controlados principalmente pelo citoesqueleto de actina. A remodelação do citoesqueleto representa o elemento chave da resposta de muitas células a fatores de crescimento e outros estímulos extracelulares. Membros da subfamília Rho, de pequenas proteínas de ligação ao GTP (incluindo Rho, Rac e Cdc 42) desempenham papéis centrais regulando a estabilização e a destruição dinâmica de filamentos de actina e, assim, controlam vários processos celulares que incluem mobilidade celular, adesão celular e citocinese, a partir do citoesqueleto de actina. 8. Analise a sinalização celular em processos de de senvolvimento e diferenciação. Três exemplos de vias de sinalização em processos de desenvolvimento e diferenciação serão aqui discutidos. A Via do receptorTirosina Quinase Ras/Raf/ERK : a sinalização por receptores tirosina quinase ativam está via. Por exemplo, a ativação do receptor do fator de crescimento nervoso(um receptor tirosina quinase) estimula a via e assim proporciona a diferenciação de neurônios em vertebrados. A sinalização por essa via desempenha ainda papel-chave em desenvolvimento em olho composto de drosophila. Hedgehog e wnt : desempenha função-chave na determinação do destino e padrão celular durante o desenvolvimento de embriões tanto em vertebrados como em invertebrados. Sinalização Notch : controla o destino celular por interação direta célula-célula durante o desenvolvimento animal. 9. Discuta o mecanismo de morte celular programada, considerando aspectos da sua regulação. A morte celular programada é um processo fisiológico e desempenha um papel-chave tanto na manutenção de tecidos adultos como na manutenção do desenvolvimento embrionário. Em adultos ela é responsável pelo balanceamento da proliferação celular e pela manutenção do número constante de células em tecidos que sofrem renovação celular. Esse processo proporciona ainda um mecanismo de defesa por meio do qual células lesadas ou potencialmente perigosas podem ser eliminadas. Outros tipos de lesões, tais como danos no DNA, também induzem a morte celular programada. Durante o desenvolvimento esse processo desempenha um papel-cheva na eliminação de células indesejáveis. A regulação de morte celular programada é mediada pela atividade integrada de varias vias de sinalização, algumas atuando para induzir a morte celular e outras para promover a sobrevivência celular. A morte celular programada é um processo ativo caracterizado por uma mudança morfológica distinta conhecida como apoptose. Durante a apoptose o DNA é fragmentado, a cromatina se condensa e o núcleo se dissolve em pequenos pedaços, finalmente a célula diminui de volume e dissolve-se em fragmentos inclusos em membranas chamados de corpos apoptóticos que serão eficientemente removidos do tecido. As caspases (proteases) são os efetores, ou executores derradeiros da morte celular programada causando os eventos de apoptose pela clivagem de varias proteínas-alvo celulares. Alvos- chaves das caspases incluem um inibidor de uma DNAse, além disso elas clivam lâminas nucleares e proteínas do citoesqueleto causando fragmentação celular. As caspases são reguladas por uma família de proteínas chamadas IAP que inibem-as. Uma das caspases iniciadoras essenciais as células dos mamíferos(caspase 9) é ativada pela formação de um complexo com o APF1. A formação desse complexo exige o citocromo C que é liberado pelas mitocôndrias a partir de estímulos(danos no DNA, carência de fator de crescimento, etc) que desencadeiam a apoptose. Tais estímulos levam a danos na mitocôndrias e liberação de citocromo C para o citosol, local onde ira se ligar a APF1 e formando assim o complexo APF1/Caspase 9 chamado de Apoptossomo no qual a caspase 9 é ativada. Membros da família Bcl-2 , que inibem a apoptose previnem a liberação do citocromo C ao passo que membros da mesma família provocam morte celular induzindo danos mitocondriais. Alguns polipeptideos secretados(fator de nacrose tumoral TNF ) ligam-se a membros da família de receptores TNF e sinalizam a morte celular programada por ativação de caspases. Muitas células são dependentes de sinais de sobrevivência a partir de fatores secretados ou de contato célula-célula que suprimem a apoptose. A via PIP3 Quinase/Akt é a principal via de sinalização responsável por promover a sobrevivência celular. Estrutura e regulação da fluidez 1. Analise propriedades dos fosfolipídeos que favor ecem a formação de bicamadas em meio aquoso. Os fosfolipídeos consistem em dois ácidos graxos ligados a um grupo polar. Portanto todos os fosfolipídeos tem caudas hidrofóbicas e grupos cabeça hidrofílicos que consistem no grupo fosfato e em seus anexos polares, consequentemente são moléculas anfipáticas. Essas propriedades dos fosfolipídeos é a base para a formação de membranas biológicas já que formam espontaneamente bicamadas em soluções aquosas com as caudas hidrofóbicas escondidas no interior da membrana, e os grupos cabeça polar expostos em ambos os lados em contato com a água. Tais bicamadas fosfolipídeas formam barreiras estáveis entre dois compartimentos aquosos. Representam a estrutura básica de todas as membranas biológicas. 2. Descreva a estrutura básica das membranas celula res, considerando a participação de lipídeos e proteínas. A estrutura básica das membranas é uma bicamada fosfolipídica, onde geralmente os lipídios correspondem a aproximadamente 50% da massa. As proteínas são os outros constituintes importantes das membranas celulares constituindo de 25 a 75% da massa da varias membranas da célula. Enquanto os fosfolipídios provem à organização estrutural básica das membranas as proteínas de membrana executam as funções específicas das diferentes membranas celulares incluindo o transporte seletivo de moléculas e o reconhecimento célula- célula. Os ácidos graxos da maioria dos fosfolipídios naturais apresentam uma ou mais ligações duplas que introduzem torções no interior da cadeia de hidrocarbonetos dificultando assim a associação destas, possibilitando o movimento livre no interior da membrana tornando-a maleável e flexível. 3. Identifique os quatro principais fosfolipídeos d e membrana, considerando sua distribuição assimétrica. Os quatro principais fosfolipídeos das membranas plasmáticas são: fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina e esfingomielina. Esses fosfolipídeos juntos constituem de 50 a 60% dos lipídeos totais da membrana. Esses fosfolipídios são assimetricamente distribuídos entre as duas metades da bicamada da membrana. A camada externa da membrana é constituída principalmente por fosfatidilcolina e esfingomielina, enquanto a fosfatidiletanolamina e fosfatidilserina são os fosfolipídios predominantes na camada interna. 4. Discuta o papel do colesterol na regulação da fl uidez da membrana plasmática de células animais. Pela sua estrutura de anel de hidrocarbono o colesterol tem um papel distinto na determinação da fluidez da membrana. Moléculas de colesterol inserem-se na membrana com seus grupos hidroxil polares próximo aos grupos cabeça hidrofílicos dos fosfolipídeos, os anéis hidrocarbono rígidos do colesterol interagem assim com as regiões das cadeias de ácidos graxos que são adjacentes aos grupos cabeça dos fosfolipídeos. Essa interação diminui a mobilidade das porções externas das cadeias de ácidos graxos tornando essa parte da membrana mais rígida. Por outro lado a inserção do colesterol interfere nas interações entre as cadeias de ácidos graxos mantendo assim a fluidez das membranas a baixas temperaturas. Dependendo da temperatura o colesterol interfere de maneiras diferentes na fluidez da membrana. Em altas temperaturas o colesterol interfere no movimento de cadeias fosfolipídicas de ácidos graxos, o que acarreta uma diminuição na fluidez na camada externa da membrana, reduzindo assim a sua permeabilidade para pequenas moléculas. Em baixas temperaturas, no entanto, o colesterol a medida que interfere na interação entre cadeias de ácidos graxos ele protege as membranas contra o congelamento e mantêm a sua fluidez. O colesterol está distribuído por ambas as camadas. 5. Analise a ocorrência de “balsas lipídicas” na me mbrana plasmática. Não são todos os lipídios que se difundem livremente na M.P.. Na verdade, domínios específicos de membrana parece ter maior concentração de colesterol e de esfingolipídeos(esfingomielina e glicolipídeos) que parecem então forma “balsas ” que se movem lateralmente no interior da M. P. e podemassociar-se com proteínas específicas de membrana, podendo desempenhar funções importantes em processos como a sinalização celular e a internalização de moléculas extracelulares através da endocitose. 6. Caracterize as duas classes de proteínas associa das à membrana, identificadas por Singer e Nicolson. O modelo aceito atualmente de estrutura de membrana proposto por Singer e Nicolson vê as membranas como mosaicos fluidos com estrutura bidimensional, nos quais as proteínas estão inseridas na bicamada lipídica. Essas proteínas estão divididas em duas classes gerais baseada na natureza de sua associação com a membrana. As proteínas integrais de membrana em sua maior parte são proteínas transmembranas, estão embebidas diretamente dentro da bicamada lipídica e a cruzam, com porções expostas em ambos os lados da membrana. Essas proteínas só podem ser dissociadas com reagentes(ex: detergentes) que rompam as interações hidrofóbicas da bicamada fosfolipídica. As proteínas periféricas de membrana não estão inseridas na bicamada lipídica, mas sim associadas com a membrana indiretamente, em geral por interações com proteínas integrais de membrana que frequentemente envolve ligações iônicas que são rompidas pelo pH extremo ou por altas concentrações de sais, mas que não dissociam a bicamada lipídica. Podendo ser encontradas nas faces extramembrana ou citosólica. Modificações distintas nos lipídios ancoram proteínas as faces citosólica e extracelular das membranas plasmáticas. As protepinas podem estar ancoradas a face citosólica pela adição de um ácido graxo ao seu terminal amino ou ainda um grupo prenil as cadeias laterais dos resíduos de cisteína. Alternativamente as proteínas podem estar ancoradas a face extracelular da membrana plasmática pela adição de glicolipídios ao seu carboxi terminal. 7. Discuta os resultados dos experimentos de fusão celular realizados por Frye e Edidin. Em 1970 Frye e Edidin em seu experimento fusionaram células humanas com células de camundongo em cultura e produziram celular híbridas de humano-camundongo. Utilizando anticorpos marcados com diferentes corantes fluorescentes que reconheciam especificamente proteínas humanas e de camundongos, identificaram que logo após a fusão as proteínas humanas e de camundongos estavam localizadas em duas diferentes metades das células híbridas. No entanto, após um pequeno período de incubação a 37graus Celsius as proteínas humanas e de camundongos estavam completamente mescladas por toda a superfície celular indicando que elas podiam mover-se livremente através da membrana plasmática e assim fornecendo subsídios para o modelo de mosaico fluido de Singer e Nicolson. Contudo nem todas as proteínas são capazes de difundirem-se livremente pela membrana, devido a suas associações com o citoesqueleto, com outras proteínas de membrana, com proteínas de superfície de células adjacentes ou com a matriz extracelular. 8. Discuta a distribuição heterogênea de proteínas na membrana de células polarizadas. As células epiteliais são polarizadas quando estão organizadas em tecidos, com partes diferentes das células sendo responsáveis por funções diferentes. Consequentemente a M. P. de varias células epiteliais é dividida em domínios diferentes: o domínio apical e o domínio baselateral, que se diferenciam em função e composição protéica. Por exemplo, a superfície apical das células do intestino delgado que está voltada para o lúmen do intestino, é coberta por microvilosidades contendo proteínas(proteína apical) especializadas para a absorção de nutrientes. Já a superfície basolateral que está voltada para o tecido conjuntivo e para as ramificações sanguíneas, é especializada para mediar à transferência dos nutrientes absorvidos para a circulação por meio de, dentre outros fatores, a presença de proteínas(proteína basolateral) especializadas. Com a intenção de manter essas funções distintas, a mobilidade das proteínas da M. P. precisa ser restrita a domínios apropriados da superfície celular. Parte dos mecanismos para manter tais condições envolve a formação de junções compactas entre células adjacentes do epitélio que selão o espaço entre elas e funcionam como barreiras para o movimento de lipídios e proteínas de membrana. Como resultado as proteínas são capazes de difundir-se através dos domínios, mas não são capazes de passar de um domínio para o outro. 9. Caracterize o glicocálix quanto a sua composição e suas funções. O glicocálix é uma camada de carboidratos que recobre a superfície da célula, é formado por glicoproteínas transmembrana, glicolipídios e oligossacarídeos. Dentre suas funções pode-se citar a proteger a superfície celular e o funcionamento como marcador para uma variedade de interações célula-célula. MICROTÚBULOS 1. Caracterize a estrutura e a instabilidade dinâmi ca dos microtúbulos. São constituídos por cilindros ocos, dinâmicos, em constante processo de arranjo e desorganização dentro das células. Agem definindo a forma celular e estão envolvidos com uma variedade de movimentos celulares, inclusive algumas formas de locomoção, transporte intracelular de organelas e separação dos microtúbulos durante a mitose. São compostos por um único tipo de proteína , chamada tubulina. O dímero de tubulina polimeriza-se para formar os microtúbulos, que geralmente são constituídos por 13 protofilamentos lineares organizados em torno do centro do orifício do túbulo. Os protofilamentos, que são compostos por dímeros de tubulina orientados cabeça com cauda, estão arranjados em paralelo. São (assim com os filamentos de actina) estruturas polares com duas extremidades distintas: a positiva (de crescimento rápido) e a negativa (de crescimento lento). Esta polaridade é importante, pois interfere na determinação da direção do movimento através do microtúbulo. A instabilidade dinâmica resulta em um processo contínuo e rápido de renovação da maioria dos microtúbulos, que têm meia-vida de apenas alguns minutos no interior da célula. Essa rápida renovação é particularmente importante para a remodelagem do citoesqueleto que ocorre durante a mitose. Tanto alfa como beta tubulina ligam-se ao GTP, promovendo a regulação da polimerização. O GTP ligado a beta tubulina é hidrolisado em GDP durante, ou logo após, a polimerização. Essa hidrólise do GTP enfraquece a afinidade da ligação da tubulina às moléculas adjacentes, favorecendo assim a despolimerização e resultando no comportamento dinâmico dos microtúbulos. Os microtúbulos também realizam treadmilling (alongamento), onde moléculas de tubulina ligadas ao GDP são continuamente perdidas da extremidade negativa e moléculas de tubulina ligadas ao GTP são adicionadas à extremidade positiva do mesmo microtúbulo. Nos microtúbulos, a hidrólise do GTP também resulta em um comportamento denominado instabilidade dinâmica, onde microtúbulos individuais alternam ciclos de crescimento e encolhimento. O crescimento ou encolhimento de um microtúbulo é determinado, em parte, pela relação da taxa de adição de tubulina em relação à taxa de hidrólise de GTP. Drogas que afetam o arranjo dos microtúbulos ou os estabilizam estão envolvidos no bloqueio da mitose (colchicina e colcemida) e no tratamento contra câncer (vincristina e vimblastina). 2. Analise a participação do centrossomo na organiz ação dos microtúbulos. Nas células animais, o principal centro organizador de microtúbulos é o centrossomo, que se localiza junto ao núcleo, próximo ao centro de interfase. O centrossomo funciona como um sítio de iniciação para o arranjo dos microtúbulos, que crescem partindo do centrossomo em direção à região periférica da célula. A iniciação do crescimento dos microtúbulos a partir dos centrossomo estabelece a polaridadedeles entre as células. Eles crescem pela adição de tubulina as suas extremidades positivas. O centrossomo da maioria das células contém um par de centríolos orientados perpendicularmente em direção ao outro, circundados pelo material pericentriolar, que é amorfo. Os microtúbulos que partem do centrosso termina no material pericentriolar e não nos centríolos, e é esse material que inicia o arranjo dos microtúbulos. A proteína-chave no centrossomo que faz nucleação e que promove o arranjo dos microtúbulos é a gama tubulina, a menor espécie de tubulinas. Complexos dessa proteína formam uma estrutura anelar, esse anel de gama tubulina funciona como uma região a partir da qual os microtúbulos serão arranjados e com o qual podem ficar ligados através de suas extremidades negativas. 3. Analise o envolvimento de proteínas na instabili dade de microtúbulos e polaridade celular. Em razão de sua inerente instabilidade dinâmica, a maioria dos microtúbulos está frequentemente desorganizada dentro da célula. Esse comportamento dinâmico pode, no entanto, ser modificado pelas interações dos microtúbulos com outras proteínas. Algumas proteínas celulares agem desorganizando os microtúbulos, outras proteínas (chamadas de proteínas associadas aos microtúbulos ou MAPs), ligam-se aos microtúbulos e modificam a sua estabilidade. Uma classe de MAPs é constituídas pelas chamadas proteínas rastreadoras de extremidades positivas, pois se ligam a tubulina/GTP, e pensa-se que rastreiam microtúbulos em crescimento na direção de localizações celulares específicas. Outras MAPs cobrem as extremidades negativas (ou positivas) e conferem às células microtúbulos estáveis em regiões particulares, e viabilizam importantes mecanismos que definem a polaridade e a forma celular. Um bom exemplo do papel da estabilidade dos microtúbulos na determinação da polaridade celular é dado pelas células nervosas, e consistem em dois tipos distintos de processo (axônios e dendritos), estendendo-se a partir do corpo celular. Nos axônios, os microtúbulos estão todos orientados para o lado contrário do corpo celular, similarmente à orientação dos microtúbulos geralmente encontrados em outros tipos celulares. As extremidades negativas da maioria dos microtúbulos nos axônios, no entanto, não estão ancoradas no centrossomo; em vez disso, tanto as extremidades positivas como as negativas desses microtúbulos terminam no citoplasma do axônio. Nos dendritos, os microtúbulos estão orientados para ambas as direções, algumas extremidades positivas estão direcionadas para o corpo celular e outras para a periferia. OBS: MAP 1, 2 e ETAU em células neuronais e MAP 4 em demais células. 4. Relacione microtúbulos e movimentos intracelular es. Os microtúbulos são responsáveis por uma variedade de movimentos celulares, incluindo transporte intracelular, o posicionamento de vesículas envoltas por membrana e organelas, a separação de cromossomos na mitose e o batimento de cílios e flagelos. O movimento ao longo dos microtúbulos é baseado na ação de proteínas motoras que utilizam energia derivada da hidrólise do ATP para produzir força e movimento, similarmente a actina. Membros de duas grandes famílias de proteínas motoras – a cinesinas (a maioria desloca-se em direção à extremidade positiva) e as dineínas (move-se em direção a extremidade negativa) – são responsáveis por impulsionar a ampla variedade de movimentos dos quais participam os microtúbulos. 5. Descreva a organização e a base molecular do mov imento de cílios e flagelos. São projeções da membrana plasmática, baseadas em microtúbulos, que são responsáveis pelo movimento de diversas células eucarióticas. Os cílios batem em um movimento de vai-e- vem coordenado. Os flagelos são maiores e diferenciam em seu movimento ondulatório ou batimento. A estrutura fundamental de ambos é o axônema, que é composto por microtúbulos e suas proteínas associadas. Os microtúbulos estão arranjados em uma forma característica de “9 + 2”, onde o par central de microtúbulos é circundado por nove duplas externas de microtúbulos. Os dois microtúbulos fusionados, de cada dupla externa, são distintos: um deles (denominado túbulo A) é um microtúbulo completo constituídos de treze protofilamentos; o outro (túbulo B) é incompleto, contendo somente dez ou onze protofilamentos fusionados ao túbulo A. Os pares de microtúbulos externos são conectados ao central por traves radiais interligadas por uma proteína denominada nexina. Além disso, dois braços de dineína estão aderidos a cada túbulo A por suas bases, enquanto os grupamentos da cabeça ligam-se ao túbulo B do par adjacente, e é a atividade motora dessas dineínas axonemais que dirigem os batimentos dos cílios e flagelos. As extremidades negativas dos microtúbulos dos cílios e flagelos estão ancoradas no corpo basal, que é uma estrutura similar aos centríolos. Esses corpos basais, assim, servem para iniciar o crescimento dos microtúbulos do axonema, assim como para ancorar os cílios e flagelos à superfície celular. MICROFILAMENTOS 6. Descreva a dinâmica de polimerização e despolime rização dos filamentos de actina, analisando os efeitos da cofilina, profilina e Arp 2/3. A primeira fase da polimerização de actina(nucleação) consiste na agregação de três monômeros de actina sendo que os filamentos de actina podem crescer reversivelmente pela adição de monômeros em ambas as extremidades, porém a extremidade positiva cresce de 5 a 10 vezes mais rápido que a extremidade negativa. Embora ATP não seja necessário para que ocorra a polimerização os monômeros de actina que se ligam ao ATP polimerizam-se mais facilmente do que aqueles que ficam ligados ao ADP(e despo.limerizam-se com menor facilidade), sendo que o ATP é hidrolisado gerando ADT após o rearranjo do filamento. Essa diferença pode resultar em um fenômeno chamado de treadmilling(alongamento), onde a extremidade negativa cresce mais lentamente do que a positiva, está diferença na taxa de crescimento é refletida em uma diferença na concentração crítica para a adição de monômeros nas duas extremidades. Os filamentos podem despolimerizar-se pela dissociação das subunidades de actina, sendo que existe um equilíbrio aparente entre os monômeros e os filamentos de actina o qual é dependente da concentração de monômeros livres, de modo que existe uma concentração crítica de monômeros de actina na qual sua taxa de polimerização em filamentos é idêntica a taxa de despolimerização(equilíbrio aparente). O complexo Arp 2/3 se liga a actina/ATP nas extremidades positivas provocando uma ramificação do filamento. O fator ADF cofilina liga-se aos filamentos de actina e aumenta a velocidade de dissociação dos monômeros de actina/ADP, a partir da extremidade negativa e permanece ligado aos monômeros de actina/ADP, impedindo seu reagrupamento. A ADF cofilina também pode separar os filamentos de actina, gerando mais extremidades positivas e acelerando posteriormente o arranjo dos filamentos. A profilina estimula a incorporação dos monômeros de actina, através da estimulação do ADP ligado pelo ATP resultado na formação de monômeros de actina ATP que se dissociam da cofilina e tornam-se então disponíveis. Essas três proteínas podem agir conjuntamente para promover a rápida renovação dos filamento de actina e o remodelamento do citoesqueleto de actina necessário para vários movimentos celulares e modificações na forma celular. 7. Caracterize a organização dos filamentos de acti na em feixes e redes, considerando a funcionalidade dessas estruturas. Nos feixes os filamentos estão estreitamente interligados em agrupamentos paralelos, nas redes estão interligados em um arranjo ortogonal que gera uma malha tridimensional com propriedades de géis semi-sólidos. Todas as proteínas que se associam a actina contem pelo menosdois domínios de ligação a actina possibilitando que essas interliguem dois filamentos diferentes de actina. As proteínas que ligam a actina em forma de feixe(protepinas empacotadoras de actina, ex: fimbrina e α-actinina) geralmente são proteínas pequenas e rígidas. Contrariamente as proteínas que organizam os filamentos de actina em redes(ex: filaminas) são geralmente proteínas flexíveis e podem interligar filamentos perpendiculares. Os feixes de actina podem agir dando dando suporte a projeções da membrana plasmática como microvilosidades e alguns são capazes de realizar contração, como nos anéis contráteis que dividem a célula após a mitose. Algumas redes localizam-se na região subjacente a membrana plasmática e dão sustentação a superfície das células. 8. A partir de exemplos, analise a funcionalidade da associação de filamentos de actina com a membrana plasmática. Os filamentos de actina estão preferencialmente concentrados na região periférica da célula, onde formam uma rede tridimensional junto à membrana plasmática. Essa rede de filamentos de actina e as proteínas associadas à actina(denominada de córtex celular ) determinam a forma celular e estão envolvidas com uma variedade de atividades da superfície celular, incluindo o movimento. A associação do citoesqueleto de actina com a M.P. é fundamental para a manutenção da estrutura e função celular. Os eritrócitos humanos perderam seus outros componentes do citoesqueleto (microtubulos e filamentos intemediarios), de tal forma que o citoesqueleto cortical é o principal determinante de suas distintas formas de discos bicôncavos. Uma mutação na proteína distrofina que liga filamentos de actina a proteínas transmembrana da M.P. de células musculares é responsável por dois tipos de distrofia muscular. O citoesqueleto de actina nas junções de adesão ligam uma célula epitelial a outra através de filamentos de actina associados a M.P. de ambas. 9. Caracterize a associação actina-miosina em funçõ es contráteis. A miosina é um protótipo de uma molécula motora – que é uma proteína que converte energia química em forma de ATP em energia motora, gerando assim força e movimento. A atividade motora da miosina movimenta seus domínios globulares por sobre os filamentos de actina além de ligar-se a actina as regiões globulares da miosina ligam-se e hidrolisam o ATP que fornece energia para a realização do deslizamento do filamento. Essa transformação da energia química em movimento é mediada por mudanças na forma da miosina resultante da ligação com o ATP. Durante cada ciclo acontecem mudanças conformativas na miosina que resultam no movimento das regiões globulares da miosina através dos filamentos de actina. O ciclo inicia-se com a miosina(na ausência de ATP) ligada fortemente a actina. A ligação do ATP dissocia o complexo miosina-actina e a hidrólise do ATD então induz alterações conformacionais na miosina. Os produtos da hidrólise (ADP e Pi) continuam ligados a região globular da miosina a qual encontra-se numa posição chamada de “engatilhada”. A região globular da miosina retorna a posição original sobra os filamento de actina resultando na liberação da ADP e Pi, disparando um golpe potente ou “movimento de potencia” no qual q região globular da miosina retorna a sua conformação inicial, produzindo o deslizamento do filamento de actina em direção a linha M do sarcômero. O Ca++ atua no complexo troponina/tropomiosina que é responsável por esconder o sítio de ligação da actina com a miosina. Quando a célula está em repouso o complexo esconde o sítio de ligação da actina com a miosina para a célula não contrair. Em altas concentrações a ligação do Ca++ a Troponina C alterna o posicionamento do complexo deixando de fazer inibição e permitindo que a contração se realize. FILAMENTOS INTERMEDIÁRIOS 10. Caracterize a estrutura dos filamentos intermed iários, considerando seus diferentes tipos. Ao contrário dos filamentos de actina e dos microtúbulos, os filamentos intermediários não estão diretamente envolvidos com o movimento celular e parecem desempenhar basicamente um papel estrutural. Conferindo resistência mecânica as células e aos tecidos. Eles são compostos por uma variedade de proteínas que são expressas em diferentes tipos celulares e classificadas em 6 grupos com base na sua semelhança entre suas sequências de aminoácidos. Todas as proteínas dos filamentos intermediários apresentam um domínio central com um bastão α-hélice, esse domínio central é flanqueado por domínios amino e carboxi terminais que variam em tamanho e estrutura secundária. Os tipos I e II são constituídos por proteínas queratinas e estão presentes em células epiteliais formando estruturas como cabelo, unhas e chifres(queratina de alta massa molecular). O tipo III inclui a vimentina (fibroblastos, glóbulos sanguíneos brancos), desminas (células musculares), periferina (neurônios periféricos), proteínas ácidas do filamento glial (células gliais). As proteínas do tipo IV são as proteínas dos neurofilamentos e α-internexinas nos neurônios. Tipo V, laminas nucleares presentes nas lâminas nucleares de todas as células. Tipo VI, nestina que se expressam em células pluripotentes do SNC. 11. Descreva a organização intracelular dos filamen tos intermediários e sua participação em junções celulares. Os filamentos intermediários formam uma rede elaborada no citoplasma das células estendendo-se em forma de malha desde o núcleo até a membrana plasmática. Eles fornecem uma integração entre os componentes do citoesqueleto e organizam a estrutura interna das células. As junções celulares dos tipos desmossomos e hemidesmossomos ancoram os filamentos intermediários a regiões de contato célula-célula ou célula-substrado respectivamente. Sendo assim,tais filamentos servem de ligação mecânica conferindo uma estabilidade mecânica a todo o tecido. Os filamentos intermediários da maioria dos neurônios maduros(neurofilamentos) conferem suporte e estabilidade mecânica para vários elementos do citoesqueleto dos axônios dos neurônios motores. 12. Analise o envolvimento de filamentos intermediá rios em doenças de pele e do sistema nervoso. Os filamentos intermediários são necessários para a manutenção da resistência do citoesqueleto das células em tecidos de organismos multicelulares, onde estes são submetidos a uma variedade de estresses mecânicos. Mutações nos genes de filamentos intermediários da queratina interferem no arranjo normal dos filamentos de queratina das células epiteliais causando a doença conhecida como Epidermólise Bolhosa Simples (EBS), onde as células tornam-se menos resitentes a estresses mecânicos e desenvolvem lesões de pele por lise celular após traumas mínimos. A Doença conhecida como Esclerose Aminiotrófica Lateral (ALS) que leva a atrofia muscular, paralisia e eventual morte e outros tipos de doenças dos neurônios motores são caracterizadas pelo acúmulo e arranjo anormal dos neurofilamentos. 13. Analise a participação de filamentos intermediá rios na desestruturação e reestruturação do envelope nuclear. A desmontagem do envelope nuclear envolve envolve mudanças em todos os seus três componentes: as membranas nucleares são fragmentadas em vesículas, os complexos de poro dissociam-se e a lâmina nuclear despolimeriza-se. A desmontagem da lâmina nuclear se dá através da fosforilação dos filamentos intermediários de lamina que a compõe. Tal fosforilação é catalisada pela proteinoquinase Cdc2, que fosforila todos os diferentes tipos de laminas. A lamina tipo B permanece ligada as vesículas oriundas da dissolução da lâmina nuclear e as laminas A e C dissociam-se da membrana nuclear e são liberados como dímeros no citosol. A nova junção do envelope nuclearparece ser sinalizadas pela inativação da Cdc2, que leva a desfosforilação das proteínas que foram fosforiladas no início da mitose. SISTEMA DE ENDOMEMBRANAS Núcleo 1. Descreva a estrutura do envelope nuclear conside rando a presença da lâmina nuclear e dos complexos de poro. O envelope nuclear tem uma estrutura complexa, constituindo em duas membranas nucleares, a lâmina que envolve o núcleo, e os complexos de poros nucleares. O núcleo é circundado por um complexo de duas membranas concêntricas, chamadas de internas e externas. A membrana nuclear externa é contínua ao retículo endoplasmático, de modo que os espaços entre as duas membranas nucleares membranas é diretamente conectado a ele. Além disso, a membrana nuclear externa é funcionalmente similar às membranas do retículo endoplasmático e tem ribossomos ligados a sua superfície citoplasmática. A membrana nuclear interna transporta proteínas singulares que são específicas para o núcleo. Subjacente a membrana nuclear interna está à lâmina nuclear, uma rede fibrosa que fornece suporte estrutural para o núcleo. Ela é composta de uma ou mais proteínas relacionadas chamadas laminas . Essas laminas se associam para formarem filamento e além de desempenhar outras funções elas ligam-se as proteínas da membrana nuclear interna, que podem auxiliar a organização dos filamentos de laminas em uma rede e mediar suas ligações à membrana. As membranas nucleares interna e externa são unidas nos complexos de poros nucleares , os únicos canais através dos quais pequenas moléculas polares, íons e macromoléculas(proteínas e RNA) são capazes de passar através do envelope nuclear. 2. Discuta os experimentos que levaram à identifica ção de sinais de localização nuclear em proteínas. O primeiro sinal de localização nuclear a ser mapeado em detalhes foi caracterizado por Alan Smith e seus colegas em 1984. Esses pesquisadores estudaram o antígeno T do vírus símio 40(SV40), uma proteína codificada que inicia a replicação do DNA viral em células infectadas.Como esperado para uma proteína de replicação, o antígeno T geralmente está localizado no núcleo. O sinal responsável por sua localização nuclear foi identificado primeiro pelo achado de que a mutação de um único resíduo de lisina evita a exportação nuclear, resultando no acumulo do antígeno no citoplasma. Estudos subsequentes definiram o sinal de localização nuclear do antígeno T como uma sequência de sete aminoácidos. Essa sequência não foi somente necessária para o transporte para o núcleo do antígenoT, mas sua adição a outras proteínas, normalmente citoplasmáticas, também foi suficiente para direcionar sua acumulação no núcleo. Sinais de localização nuclear foram identificados em muitas outras proteínas. A maioria dessas sequências são pequenas regiões ricas em resíduos de aminoácidos básicos(lisina e arginina). 3. Analise o transporte seletivo de proteínas atrav és dos complexos de poro nuclear, considerando a participação de importinas, exportin as e da proteína Ran. A importação protéica através do complexo de poros nucleares pode ser operacionalmente dividida em dois passos distintos pela necessidade ou não de energia, as proteínas que contém sinais de localização nuclear se ligam aos complexos de poros nucleares, mas não passam através deles. Nesse passo inicial, os sinais de localização nuclear são reconhecidos por uma proteína citosólica receptora, e o complexo receptor-substrato liga-se ao poro nuclear. O receptor protótipo, chamado de importina, consiste em duas subunidades. Uma subunidade(α) liga-se aos sinais de localização nuclear ricos em aminoácidos básicos de proteínas tais como o antígeno T e a nucleoplasmina. A segunda subunidade da importina(β) liga-se aos filamentos citoplasmáticos dos complexos de poros nucleares, conduzindo a proteína alvo ao poro nuclear. O segundo passo da importação nuclear, a translocação através do complexo de poros nucleares, é um processo dependente de energia que requer a hidrólise de GTP. Um componente chave no processo de translocação é uma pequena proteína ligada ao GTP, chamada de Ran(relacionada as proteínas Ras). A conformação e a atividade da Ran são reguladas pela ligação e hidrólise de GTP, assim como a Ras ou vários outros fatores de tradução envolvidos na síntese protéica. As enzimas que estimulam a ligação da Ran ao GTP estão localizadas no lado nuclear do envelope nuclear, enquanto as enzimas que estimulam a hidrólise da GTP estão localizadas no lado citoplasmáticos. Consequentemente existe um gradiente de Ran/GTP através do envelope nuclear, com uma alta concentração de Ran/GTP no núcleo e uma alta concentração de Ran/GDP no citoplasma. Acredita-se que esse gradiente de Ran/GTP determine a direção do transporte nuclear e que a hidrólise de GTP pela Ran seja responsável pela maioria(se não por toda) da energia necessária para importação nuclear. A proteína beta forma um complexo com a proteína alfa e com sua proteína-alvo associada no lado citoplasmático do complexo de poros nucleares na presença de alta concentração de Ran/GDP. Desta forma, esse complexo é transportado através do poro nuclear para o núcleo, onde uma alta concentração de Ran/GTP está presente. No lado nuclear do poro a Ran/GTP liga-se a importina beta, deslocando a importina alfa e a proteína-alvo. Como resultado a proteína-alvo é liberada dentro do núcleo. Assim, o complexo Ran/GTP-impotina beta é exportado para o citosol, onde a GTP ligada é hidrolisada a GDP, liberando a importina beta para participar de outro ciclo de importação nuclear. Algumas proteínas permanecem dentro do núcleo após sua importação do citoplasma, mas muitas movem-se em vai-vem entre ele e o núcleo. Algumas dessas proteínas agem como carreadoras no transporte de outras moléculas, tais como RNAs; outras coordenam funções nucleares e citoplasmáticas. As proteínas são marcadas para a exportação a partir do núcleo por sequencias especificas de aminoácidos, chamadas de sinais de exportação nuclear. São reconhecidos por receptores dentro do núcleo que direcionam o transporte protéico através do complexo de poros nucleares para o citoplasma. Interessantemente, os receptores de exportação nuclear(exportinas) são relacionados a importina beta. Elas também ligam-se a Ran que é necessária tanto para a importação como para a exportação nuclear. Entretanto, Ran/GTP promove a formação de complexos estáveis entre exportinas e suas proteínas-alvo, enquanto dissocia os complexos entre importinas e seus alvos. Esse efeito de Ran/GTP ligando-se as exportinas impõe o movimento de proteínas contendo sinal de exportação nuclear do núcleo para o citoplasma. Desta forma, as exportinas formam complexos estáveis com suas proteínas-alvo em associação com Ran/GTP dentro do núcleo. Após o transporte para o lado citosólico do envelope nuclear, a hidrolise da GTP leva à dissociação da proteína- alvo, que é liberada dentro do citoplasma. 4. Caracterize duas estratégias de regulação do pro cesso de importação de fatores de transcrição para o núcleo. Um aspecto intrigante do transporte de proteínas para dentro do núcleo é que ele é um outro nível no qual as atividades das proteínas nucleares podem ser controladas. Fatores de transcrição, por exemplo, são funcionais somente quando estão presentes no núcleo, de modo que a regulação de sua importação para o núcleo é uma nova maneira de controlar sua expressão gênica. Em um mecanismo de regulação, os fatores de transcrição(ou outras proteínas) associam-se com proteínas citoplasmáticas que mascaram seus sinais de localização nuclear; como esses sinais não são reconhecíveis, essas proteínas permanecem no citoplasma. A importação nuclear de outros fatores de transcrição é regulada diretamente por sua fosforilação, em vez da associação com
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