Roteiro 8 - Testes para detecção de carboidratos - aula

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Estrutura e função das biomoléculas 
ROTEIRO 8 
TESTES PARA IDENTIFICAR CARBOIDRATOS 
 
A. FUNDAMENTO TEÓRICO 
 
Os carboidratos perfazem a mais abundante classe de biomoléculas da face da Terra. Sua 
oxidação (processo de quebra – o catabolismo dos carboidratos) é o principal meio de abastecimento 
energético da maioria das células não fotossintéticas. Além do suprimento energético, os carboidratos 
atuam como elementos estruturais da parede celular e como sinalizadores no organismo. 
Carboidratos são poli-hidroxialdeídos ou poli-hidroxicetonas ou substâncias que liberam tais 
compostos por hidrólise. 
 
 
 
O termo sacarídeo é derivado do grego sakcharon que significa açúcar. Por isso, são assim 
denominados, embora nem todos apresentem sabor adocicado. O termo carboidratos denota hidratos 
de carbono, designação oriunda da fórmula geral (CH2O)n apresentada pela maioria dessas moléculas. 
Podem ser divididos em três classes principais de acordo com o número de ligações 
glicosídicas: monossacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. 
 
Os Monossacarídeos 
 
Quando a palavra “carboidrato” foi inventada, referia-se originalmente aos compostos com 
fórmula geral Cn(H2O)n. No entanto, somente os açúcares simples, ou monossacarídeos, encaixam-se 
exatamente nessa fórmula. Os outros tipos de carboidratos baseiam-se em unidades de 
monossacarídeos e apresentam fórmulas gerais ligeiramente diferentes contendo outros elementos 
químicos. 
Os monossacarídeos podem ser classificados de acordo com o número de carbonos que 
possuem. De acordo com essa classificação temos as trioses, tetroses, pentoses, hexoses, heptoses e 
assim por diante. Os monossacarídeos mais comuns são as pentoses, como é o caso da ribose e da 
desoxirribose encontradas nos ácidos nucleicos, e as hexoses, que podem ser representadas pela 
glicose, frutose e galactose. 
 
Os Oligossacarídeos 
 
Esses são formados pela união de 2 a 10 monossacarídeos. Quando ocorre a união de apenas 
dois monossacarídeos, recebem a denominação de dissacarídeo. Como principais exemplos, 
podemos citar a maltose (glicose + glicose), lactose (galactose + glicose) e sacarose (glicose + 
frutose). 
Os dissacarídeos, assim como os polissacarídeos, não atravessam a parede intestinal. Só são 
aproveitados como fonte de energia se previamente hidrolisados a monossacarídeos, que passam 
rapidamente do trato intestinal à corrente sanguínea. Os oligossacarídeos e os polissacarídeos não 
hidrolisados passam ao largo do intestino delgado até o intestino grosso, onde exercem um efeito 
benéfico (fibra). Os oligossacarídeos podem ser atacados pela microflora intestinal gerando produtos 
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metabólicos como os ácidos acético e láctico. Em grandes quantidades têm efeito laxante podendo 
causar diarreia. 
 
Os Polissacarídeos 
 
Açúcares contendo mais de 20 unidades são denominados polissacarídeos, os quais podem 
possuir milhares de monossacarídeos e são a forma predominante dos carboidratos na natureza. A 
diferenciação é dada pela unidade monomérica, comprimento e ramificação das cadeias. Quando os 
polissacarídeos contêm apenas um tipo de monossacarídeo, ele é denominado de 
homopolissacarídeo. Se estiverem presentes dois ou mais tipos de monossacarídeos, o resultado é 
um heteropolissacarídeo. 
 
 
 Homopolissacarídeos 
 
Amido e glicogênio encerram funções preponderantes de armazenamento energético, sendo o 
primeiro nas células vegetais e o segundo nas células animais. 
 
O amido é composto por dois tipos de polímeros de glicose: a amilose e a amilopectina. A 
diferença básica entre estes é a ramificação da cadeia. Ambos possuem cadeias nas quais as 
unidades de glicose se unem mediante ligações (α1→ 4). 
Por sua vez, a amilopectina apresenta pontos de ramificação com ligações glicosídicas (α1→ 6). 
Tais ramificações são encontradas de 24 a 30 unidades de glicose na cadeia principal. 
 
Amido e glicogênio são altamente hidratados devido à quantidade de hidroxilas que formam 
ligações de hidrogênio com a água. 
 
A estrutura do glicogênio é similar à amilopectina. A diferença é a frequência de ramificações, as 
quais aparecem de 8 a 12 unidades de glicose. 
A celulose, outro importante polissacarídeo, é encontrada na parede celular vegetal, perfazendo 
grande parte da massa da madeira e quase 100% da massa do algodão. 
A fixação do CO2 pelos vegetais leva quase exclusivamente à produção de celulose. A celulose 
é uma substância fibrosa, resistente e insolúvel em água, sendo formada por unidades de glicose 
conectadas mediante ligações (β1→ 4), que lhe impele propriedades estruturais características. Na 
celulose, as unidades de glicose formam cadeias retas e estendidas as quais se dispõem lado a lado, 
engendrando uma estrutura em fibras estabilizada por ligações de hidrogênio intra e intercadeias. Tal 
estrutura em fibras confere maior resistência à celulose. 
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 REAÇÕES PARA IDENTIFICAR CARBOIDRATOS 
 
REATIVO DE MOLISCH 
 
Os monossacarídeos mais importantes são os formados por cinco ou seis átomos de carbono 
(pentoses e hexoses, respectivamente). 
Por serem moléculas muito ricas em grupamentos hidroxila (-OH), os monossacarídeos podem 
ser facilmente desidratados por ação de ácidos fortes concentrados, como o ácido sulfúrico (H2SO4). 
O ácido rompe facilmente as ligações glicosídicas presentes em moléculas de polissacarídeos, 
quebrando-os e fornecendo seus monossacarídeos. 
Esses, por sua vez, são desidratados e podemos ter como produto: o furfural, quando o 
monossacarídeo desidratado for uma pentose, e o hidroximetilfurfural (HMF), quando for uma hexose. 
Tanto o furfural quanto o hidroximetilfurfural são substâncias incolores, impedindo que a reação 
seja visualizada. Para resolver esse problema, adiciona-se um composto fenólico ao meio (como o 
alfa-naftol, conhecido como reativo de Molisch). O fenol reage como os produtos incolores, e provoca 
o aparecimento de um anel de coloração lilás. 
 
 
 
REAÇÃO DE SELIWANOFF 
 
A reação de Seliwanoff só diferencia-se da reação de Molisch nos reagentes utilizados: o ácido 
que causará a desidratação do carboidrato é o ácido clorídrico (HCl) e o fenol que reage como o 
furfural e hidroximetilfurfural é o resorcinol. 
Esse teste permite diferenciar aldoses de cetoses porque a reação com a cetose é mais rápida e 
mais intensa. Isso porque a formação do furfural é mais fácil que a formação do hidroximetilfurfural. 
 
REAÇÃO DE BENEDICT 
 
Se observamos com mais atenção as 
moléculas de carboidratos podemos 
identificar que alguns carboidratos possuem 
um grupamento -OH (hidroxila) livre no 
carbono 1 de suas moléculas, enquanto 
outros não. 
 
Os açúcares que apresentam a 
hidroxila livre no C-1 são bons agentes 
redutores. Por esse motivo a 
extremidade que contém o (-OH) passa a 
ser chamada extremidade redutora e o 
açúcar, de AÇÚCAR REDUTOR. 
 
A capacidade que esses compostos apresentam de reduzir íons metálicos em soluções alcalinas 
é um bom método de identificação desses compostos. 
 
 
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A reação abaixo esquematiza o princípio da Reação de Benedict, baseada na redução de íons 
Cu2+ a Cu+, com formação de um precipitado vermelho ou amarelo: 
 
 
 
Nessa reação o aparecimento de um precipitado de coloração vermelho-tijolo indica que os íons 
Cu2+ do reagente de Benedict foram reduzidos a Cu+, indicando a presença de um açúcar redutor. 
 
* a reação é feita em meio básico porque, nessa condição, a porcentagem de enedióis é maior. 
 
 
REAÇÃO COM O IODO (reativo de Lugol) 
 
Polissacarídeos são moléculas de elevado peso molecular, cuja unidade fundamental são os 
monossacarídeos, principalmente a glicose. Como exemplos de polissacarídeos importantes na 
natureza sendo destaques o glicogênio, a celulose e o amido. 
O amido, polissacarídeo de extrema importância em alimentos, é produzido em grande 
quantidade nas folhas dos vegetais como forma de armazenamento dos produtos da fotossíntese, e é 
constituído por dois outros polissacarídeosestruturalmente diferentes: amilose e amilopectina. 
 
 
 
Essas moléculas de polissacarídeos com alto peso molecular podem sofrer reações de 
complexação, com formação de compostos coloridos. Um exemplo importante é a complexação da 
amilose e da amilopectina com o iodo, resultando em complexo azul e vermelho-violáceo, 
respectivamente. 
 
 
 
 
 
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Definição de açúcar redutor 
 
Alguns monossacarídeos são conhecidos como açúcares redutores (AR), pois em sua estrutura 
química possuem um grupo de aldeído ou cetona que ficam livres em solução aquosa e são capazes 
de reduzir o certos íons metálicos como o bromo (Br2) ou o Cobre (Cu
2+). 
Logo, os demais açúcares, como os dissacarídeos e os oligossacarídeos, são conhecidos como 
não redutores (ANR), pois não possuem aldeídos ou cetonas livres em soluções aquosas, as quais 
são capazes de reduzir íons metálicos. 
Nos carboidratos complexos (não redutores), deve ser realizada uma hidrólise prévia, conhecida 
também por inversão, para que seja possível realizar a titulação (quantificação) de oxirredução do 
método de Eynon-Lane. A hidrólise é a alteração de uma substância complexa, a qual é 
quebrada em moléculas menores, utilizando água juntamente com ácido ou enzima, como 
catalisadores. 
Nos carboidratos a hidrólise quebra moléculas complexas, na presença de água 
fortemente acidificada juntamente com calor, em moléculas simples de monossacarídeos. Esses 
monossacarídeos, caso estejam presentes na amostra, não se hidrolisam. 
Na hidrólise da sacarose, obtém-se glicose e frutose, dois monossacarídeos (redutores). 
 
Vários testes qualitativos são usados para detectar a presença de um açúcar redutor. Dois 
destes testes utilizam soluções de cobre: Reagente de Benedict (Cobre2+ em solução aquosa de 
citrato de sódio) e Solução de Fehling (Cobre2+ em solução aquosa de tartarato de sódio). Os 
açucares redutores reduzem os íons de cobre destas soluções, precipitando óxido de cobre +1. 
Açucares redutores também podem ser detectados com a adição do Reativo de Tollens (Ag+ em 
amônia aquosa), precipitando prata metálica, que é visível como um espelho prateado quando o teste 
é feito em um tubo de vidro transparente. 
O Ácido 3 5-dinitrosalicílico (3,5-DNS) é outro reagente, que permite detecção quantitativa. 
Reage com o açúcar formando ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, que pode ser medido com 
espectrofotometria, determinando assim, a quantidade de açúcar redutor presente. 
Açúcares com ligações acetal não são redutores, já que não possuem cadeia com aldeído livre. 
Mas, com a utilização de ácido clorídrico diluído, podem ser hidrolisados e passaram a reagir como 
redutores. 
 
A solução de Fehling durante muitos anos foi usada no diagnóstico de diabetes tipo I, onde a 
baixa produção de insulina eleva perigosamente os níveis de glicose no sangue, e diabetes tipo II, 
onde o indivíduo não responde à insulina. Medindo a quantidade de agente oxidante reduzida pela 
glicose no teste com a solução de Fehling, é possível determinar a concentração de glicose no sangue 
e na urina. 
 
Reação de Maillard: 
 
Os grupos carbonila dos açúcares redutores reagem com grupos amino dos aminoácidos na 
reação de Maillard, uma série de reações complexas que ocorrem quando cozinhamos. Os produtos 
dessas reações são diversos, podendo ser tanto benéficos para a saúde quanto tóxicos. Contudo, na 
maior parte dos casos, o efeito dessas reações é a perda do valor nutricional do alimento. Um 
exemplo de produto tóxico é a acrilamida, uma neurotoxina, possivelmente cancerígena que é formada 
a partir da aspargina livre e açucares redutores quando cozinhamos alimentos ricos em amido em 
temperaturas elevadas (acima de 120 °C). 
 
Qualidade do alimento: 
 
Os níveis de açúcares redutores nos vinhos, sucos e cana de açúcar são indicativos da 
qualidade desses produtos e o monitoramente destes níveis mostram efeitos positivos na qualidade de 
mercado. O método Lane-Enyon é tradicional para este monitoramento. Consiste em titular os 
açúcares redutores com cobre na solução de Fehling. Todavia, este método é muito sensível a 
impurezas, caro e impreciso. 
 
 
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B. OBJETIVOS 
 
Essa aula tem o objetivo de discutir e demonstrar a natureza dos carboidratos, reconhecer os 
carboidratos através da pesquisa das funções orgânicas presentes em suas moléculas e das 
características por elas proporcionadas. 
 
Apresentar reações de identificação de carboidratos que podem ser utilizados para determinar a 
quantidade de açúcares nas substancias orgânicas. 
 
 
 
C. MATERIAIS 
 
1. Tubos de ensaio 
2. Pipetas graduadas de 1, 2 e 5 mL 
3. Pipeta Pasteur 
4. Funil e papel de filtro 
5. Algodão 
 
6. Batatas 
7. Solução de NaOH 4% 
8. HCl concentrado 
9. Solução de ácido sulfúrico (H2SO4) 
 
 
 
 
Preparo do reativo de Molisch: 
- 5,0g de alfa-naftol em 100 ml de ácido acético (CH3COOH) concentrado (95%) 
 
Preparo do reagente de Seliwanoff: 
- dissolver 0,025 g de resorcinol em 50 mL de ácido clorídrico (HCl) concentrado. Completar o 
volume para 100 mL. 
 
Preparo do reagente de lugol 
- 5 g de iodo (I2) + 10 g de iodeto de potássio (KI). Completar o volume para 100 ml com água 
destilada. Diluir 1:10 no momento da utilização. 
 
 
Preparo do reativo de Benedict: 
 
- inicialmente, devem ser preparadas duas soluções, em separado, a saber: 
 
 
 
 
 
 
 
 
Para preparar o regente de Benedict, coloque a solução A em um balão volumétrico de 1000ml; 
em seguida, adicione a solução B sob agitação constante e complete o volume com água destilada. 
 
Observação: Para evitar que ocorra a reação do íon Cu2+ em solução alcalina, mascarando o 
teste para açúcares redutores, é adicionado o citrato de sódio, que mantém o Cu2+ em solução, 
através da formação de um complexo. 
 
 
10. Solução de frutose 1% 
11. Solução de glicose 1% 
12. Solução de sacarose 1% 
13. Solução de amido 1% 
14. Solução de caseína ou de albumina 1% 
 
15. Solução de lugol 
16. Solução de reativo de molisch 
17. Solução de Seliwanoff 
18. Reativo de Benedict 
 
19. Banho-maria em 100°C 
Solução A 
 
- 173g de citrato de sódio (Na3C6H5O7.2H2O) 
- 90g de carbonato de sódio (Na2CO3) 
 600 ml de água destilada quente (~80ºC) 
Dissolver com agitação, filtrar e completar o volume 
para 850ml com agua destilada 
Solução B 
 
- solução 17,3% de sulfato de cobre (CuSO4) 
em água destilada. 
 
Dissolver por agitação. 
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D. PROCEDIMENTO 
 
1) Experimento 1 – Reação de iodo (lugol) 
 
Utilizando uma batata faça a extração de amido para seguir com os experimentos: 
(Fazer previamente na aula) - Isolamento do Amido da batata: 
 
Homogeneizar uma batata de tamanho médio com 100mL de água destilada, em liquidificador. 
Separe os resíduos, espremendo a suspensão em gaze dobrada, coletando o líquido em um becker. 
Suspenda o resíduo em 50mL de água destilada e repita o processo. 
 
Deixe o amido depositar no fundo do becker durante 15minutos. Decante o sobrenadante 
cuidadosamente. 
 
A) Exame microscópico dos grânulos de amido 
 
Retire uma pequena amostra do amido com auxílio de uma pipeta Pasteur e deposite sobre uma 
lâmina, coloque a lamínula e observe ao microscópio. 
Repita o processo com outra lâmina, só que antes de colocar a lamínula, coloque uma gota de 
lugol sobre a gota de amido. Observe. 
 
B) Preparação da solução de amido 
 
Ao resíduo de amido, juntar lentamente, 250mL de água fervente em agitação. 
Resfrie e utilize na experiências seguintes. 
 
 
 
 
C) TESTE COM O IODO – REAGENTE LUGOL 
 
1. Em um tubo de ensaio colocar 2mL da solução de amido e acrescentar 20 gotas da solução de 
lugol. Colocar água destilada, com auxílio de uma pisseta, aproximadamente até o meio do 
tubo. 
2. Observar e anotar a cor. 
 
3. Aquecer o tubo da experiência anterior cuidadosamente (banho-maria fervente ou chama direta). 
4. Observar e anotar o resultado. 
 
5. Resfriar o tubo da experiência anterior. 
6. Observar e anotaro resultado. 
 
7. Adicione ao tubo 5 gotas de NaOH 4%. 
8. Observar e anotar o resultado. 
 
9. No mesmo tubo coloque algumas gotas de HCl concentrado e observe novamente. 
 
 
D) Precipitação do amido: 
 
1) Coloque em um tubo de ensaio 2mL da solução de amido, adicione 8mL de etanol. 
2) Observe a formação de precipitado na solução 
3) Filtre. 
4) Após o processo de filtração, coloque uma gota de lugol no precipitado retido no papel filtro e 
outra gota de lugol no filtrado. 
 
Observe e anote resultado. 
 
Essa solução de amido solubilizado pode ser usado para os testes com iodo (lugol), 
Benedict e Molisch 
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2) Experimento 2 – Reação de Molisch 
 
 
a) Preparar os tubos de ensaio contendo os seguintes reagentes: 
 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 Tubo 6 
2ml de água 
2ml de 
solução de 
caseína ou 
albumina 
2ml de glicose 
2ml de 
sacarose 
2ml de amido 
Pequena 
porção de 
algodão 
(celulose) 
 
Adicionar 2 gotas de reativo de molisch em cada tubo 
Adicionar em cada tubo 2 ml de H2SO4 concentrado lentamente pela parede do tubo 
Manter parado e ir observando 
 
 
b) Observar a reação e anotar o que aconteceu em cada tubo. 
 
 
* O surgimento de um anel de coloração lilás estável indica que houve formação de 
furfurais, revelando a presença de açúcares na amostra. 
 
 
 
 
 
 
3) Experimento 3 – Reação de Seliwanoff 
 
 
a) Preparar os tubos de ensaio contendo os seguintes reagentes: 
 
 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 
1ml de água 1ml de água 1ml de água 1ml de água 1ml de água 
 
5 gotas de 
glicose 
5 gotas de 
frutose 
5 gotas de 
sacarose 
5 gotas de 
amido 
 
Adicionar 5 ml do reativo de Seliwanoff em cada tubo 
Incubar em banho-maria fervente até aparecer a coloração 
IMPORTANTE - Anotar o tempo do aparecimento da cor nos tubos. 
 
b) Observar a reação e anotar o que aconteceu em cada tubo. 
 
*importante - a reação para cetoses é mais rápida e mais intensa do que para aldoses. 
 
 
 
 
 
 
 
 
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4) Experimento 4 – Reação de Benedict 
 
c) Preparar os tubos de ensaio contendo os seguintes reagentes: 
 
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5 
2ml de água 2ml de glicose 2ml frutose 2 ml de sacarose 2ml amido 
 
Adicionar 2,5 ml do reativo de Benedict em cada tubo 
Incubar em banho-maria fervente por 3 a 5 minutos 
 
d) Observar a reação e anotar o que aconteceu em cada tubo. 
 
 
 
Em outro tubo: 
 
Pipete 2mL da solução de sacarose a 4%, junte 2 gotas de HCl concentrado e aqueça 2 minutos 
em banho de água em ebulição. 
 
Deixe esfriar, junte 2mL do reagente de Benedict e aqueça novamente durante 5 minutos. Anote o 
resultado. 
 
 
 
* O desenvolvimento de um precipitado de coloração vermelho-tijolo indica que os íons Cu2+ 
do reagente de Benedict foram reduzidos a Cu+, indicando presença de açúcar redutor. 
 
 
 
 
 
Aqui pode ser feita a hidrolise acida do amido da batata e posteriormente o teste com o iodo 
(reagente lugol) ou o teste de Benedict