ok controle pratica 06.10.11

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Alexandra Woods
Controle M. e físico-químico de P de origem animal
06/10/2011 - Prática
Clostridium perfringens
Possui uma importância muito grande na microbiologia de alimentos. Existem diversos trabalhos relacionados a presença do Clostridium perfringens em produtos de origem animal e isso faz com que se torne um perigo a saúde publica.
Essa bactéria é gram +, é um bacilo. É sulfito redutor.
Qualquer Clostridium, independente da espécie, vai ser sulfito redutor, ou seja, tem a capacidade de reduzir o sulfito em sulfeto. Por isso são chamados de sulfitos redutores.
Eles são anaeróbios facultativos, o significa ser isso: para condição ótima de crescimento para eles, é a condição de anaerobiose, ou seja, a ausência de oxigênio. Porem se eles estiverem em um ambiente onde exista oxigênio e essa concentração esteja baixa ele consegue se multiplicar. 
Então ele não é aquele microrganismo que só vai crescer em condição de anaerobiose, ele pode crescer também em baixas concentrações de oxigênio.
São esporulados, daí são um grande problema porque os esporos são resistentes ao tratamento térmico usual. Então com o tratamento térmico usual nós conferimos destruir a bactéria porem os esporos serão ativados.
São classificados como termófilos, sendo que em alguns livros eles trazem como a classificação como o Clostridium perfringens sendo psicotrópicos. Porque existe essa diferença: a temperatura ótima de crescimento do Clostridium perfringens é a temperatura de 40 a 45°C, porém, eles apresentam o crescimento numa faixa de temperatura que vai variar de 15 a 51°C. 
Alguns autores consideram que o fato deles apresentarem o crescimento a partir de 15°C, ele seria considerado psicotrópicos. Porem a professora não concorda porque 15°C ainda não é aquela temperatura de refrigeração considerada para crescimento dos psicotrópicos, que seria a temperatura de a partir de 7°C, então vcs podem encontrar em alguns livros como psicotrópicos.
	O pH ótimo de crescimento é o pH próximo da neutralidade, é o pH em torno de 6-7. Sendo que o pH limite para o crescimento do Clostridium perfringens é o pH=5. Quando eu falo pH limite, significa que o pH inferior a 5 ele não consegue se desenvolver. É uma espécie extremamente sensível a mudanças de pH. 
Produtos de origem animal em geral tendem a ter um pH superior a 5, por isso que são considerados alimentos propícios ao desenvolvimento do Clostridium perfringens.
	Concentrações salinas de 7-8% impedem a multiplicação desse grupo.
	Como habitat nós temos o TGI.
Eles não possuem tantas características de resistência como o Staphylococcus, a única característica de resistência que eles possuem é o fato de produzir os esporos. O restante são características que não vão ser determinantes para eles existirem. O fato deles serem extremamente sensíveis ao pH é um fator intrínseco do alimento que vai poder colaborar para a inibição do MO. Então o pH também pode ser utilizado pela industria como uma fonte, como um obstáculo no alimento. A industria pode modificar o pH do alimento para justamente inibir o crescimento desse grupo.
Existem 2 cepas do Clostridium perfringens que são as 2 cepas que tem importância na microbiologia de alimentos.
Clostridium perfringens cepa do tipo A
Clostridium perfringens cepa do tipo C
Vão provocar diferentes sintomas, vão agir de diferentes formas no nosso organismo.
Clostridium perfringens cepa do tipo A
	A cepa do tipo A é a cepa mais comum, porém é a menos agressiva. 
Vai provocar a infecção alimentar na forma clássica e vai ser do tipo infecção, ou seja, o indivíduo vai manifestar os sintomas pela ingestão do MO no alimento, por isso que é tipo infecção. (Tipo infecção é quando vc ingere o alimento com o MO ou com o esporo, mas aqui no caso da cepa do tipo A vai ser através da ingestão do MO).
Vai haver a ingestão do alimento contaminado com o MO, o MO vai aderir a mucosa intestinal, vai se multiplicar nessa mucosa e a partir daí vai resultar os sintomas.
Vai ocorrer a ingestão do alimento contaminado com o MO, a adesão à mucosa intestinal, vai ocorrer a multiplicação nessa mucosa, levando a uma reação inflamatória. 
A partir daí os indivíduos terão uma diarréia sem sangue (porque não tem destruição de vasos), vai ter febre, cólicas, e podem apresentar vômitos. 
Uma coisa importante é que: toda vez que qualquer MO que provoque sintomas pela ingestão de toxinas o individuo nunca vai apresentar febre. O individuo só vai apresentar febre quando a doença for provocada pela ingestão de MO ou pela ingestão dos esporos. 
A febre só vai ser provocada quando a doença tiver sido causada pela ingestão de esporos ou do microrganismo. Quando a doença, os sintomas forem provocados pela ingestão de toxina, nunca o individuo vai apresentar febre. 
Por causa desses sintomas que falamos que vai apresentar uma intoxicação na forma clássica. Sintomas clássicos, a cepa A não produz nenhum mecanismo diferente, por isso é considerado a forma clássica.
O período de incubação (período que vai ser o momento da ingestão do alimento até a manifestação dos sintomas) pode variar de 8 a 12 horas. Enquanto que a duração dos sintomas deve durar de 12 a 24 horas.
A refeição mais envolvida em surtos por Clostridium perfringens cepa do tipo A, é a carne assada. Porque a carne assada ela tem um preparo específico e alem disso pelo seu corte. Como o Clostridium perfringens é preferencialmente anaeróbio, ele tende a crescer de dentro para fora da carne. A carne assada vai ser assada inteira, então por dentro daquela carne é o local que vai fornecer as melhores condições para multiplicação do Clostridium perfringens.Alem disso, quando nós fazemos a carne assada, a tendência é que vc prepare o alimento durante a manha ou durante a tarde, e a carne fica ali em cima do fogão, e é nesse momento que pode haver a multiplicação e se os esporos já estiverem sido formados, quando eu for aquecer essa carne assada para comer eu vou ter a ativação dos esporos.
Então a carne assada ela também vai ter outro fator importante: o molho. O molho geralmente de qualquer alimento é uma fonte de microrganismos. Então tem o problema do corte e ainda tenho o problema de ser um pedaço inteiro e no centro geométrico eu posso não atingir a temperatura de 60°C, que é a temperatura que vai destruir os MO. As vezes na superfície da minha carne eu consigo atingir essa temperatura, porem no seu interior não chega a atingir essa temperatura.
Uma coisa importante também é que o tempo de geração do Clostridium perfringens, é muito curto, é de 8 minutos. Esse tempo de geração é o tempo que a bactéria demora para se reproduzir, para produzir as células filhas. Imagina, nós não temos uma única unidade de Clostridium perfringens no alimento, eu tenho muito mais do que isso. Então como esse tempo de geração é muito curto, em pouquíssimo espaço de tempo vai atingir a dose infectante e vai provocar a doença. 
Então toda vez que estivermos nos referindo a cepa do tipo A, devemos lembrar que vai ser do tipo infecção e tem que associar ao consumo da carne assada. 
Clostridium perfringens cepa do tipo C
	É uma cepa mais agressiva porém é mais rara.
	Ela pode ser classificada dependendo da forma que for provocar a doença em tipo infecção ou em tipo intoxicação.
Tanto o tipo intoxicação quanto o tipo infecção da cepa do tipo C, vai provocar a doença chamada “Enterite Necrótica”.
	Quando for tipo infecção, no caso da cepa do tipo C, vai ter ocorrido a ingestão do MO ou a ingestão do esporo. Quando ocorre a ingestão do esporo o que vai acontecer: pela ação da tripsina. Os esporos quando ingeridos vão esporular e vão formar a forma vegetativa. 
Vou ingerir o esporo com o alimento, ao chegar no meu estomago a tripsina vai agir nesse alimento e com isso os esporos vão esporular, originando a forma vegetativa. A forma vegetativa ela vai se multiplicar na mucosa intestinal. 
Caso eu ingira o meu alimento com o MO, o que vai acontecer: esse MO vai aderir a mucosa intestinal e vai se multiplicar. 
Como essa cepa vai originar adoença Enterite necrótica, vai provocar uma diarréia com sangue, a pessoa vai apresentar uma cólica intensa e muita dor, e um mal estar muito grande. 
Essa diarréia com sangue e essa cólica intensa ela vai ser provocada pelo o que: no momento que ocorre a multiplicação tanto pela ingestão do MO quanto pela ingestão do esporo que vai ser ativado, esse MO vai ter a capacidade de produzir uma toxina que é necrosante, por isso que vou ter uma diarréia com sangue. Vai haver a destruição dos vasos sanguíneos.
A cepa tipo C, tipo infecção vai ocorrer do seguinte modo: ela pode ocorrer pela ingestão do MO ou pela ingestão do alimento com o esporo.
Quando ocorre a ingestão do MO, esse MO vai aderir a mucosa e vai se multiplicar. 
Quando ocorrer a ingestão do alimento com os esporos, ao chegar ao estomago, a enzima tripsina vai atuar no alimento e com isso vai ativar os esporos. Os esporos vão esporular dando origem a forma vegetativa. A partir daí vai ocorrer a multiplicação na mucosa intestinal. 
Tanto na ingestão do alimento com os esporos quanto na infecção do alimento com o MO, vai haver a produção de uma toxina que é necrosante na mucosa intestinal. 
Para eu falar que é tipo intoxicação, a toxina precisaria ser pré formada no alimento, e nesse caso a doença não vai ser causada pela ingestão da toxina, ela está sendo causada pela ingestão do MO ou do esporo e a toxina é uma conseqüência. Por isso que falamos que é tipo infecção. 
	Nesse caso não vai ter febre porque não tem toxina. Vou ter uma diarréia com sangue e uma cólica intensa. 
Quando se trata da cepa do tipo C tipo intoxicação, o que vai acontecer: eu tenho o alimento contaminado com esporo, o meu alimento foi aquecido, no momento do aquecimento os esporos vão esporular e vão formar a forma vegetativa, isso tudo antes da ingestão.
A forma vegetativa desse esporo, o MO vai começar a se multiplicar e nesse momento vai ter formação da toxina no alimento. O que vai acontecer: eu tenho o meu alimento contaminado com o MO e com os esporos. Vou aquecer esse alimento e no momento do aquecimento vai ocorrer a ativação dos esporos, vai formar a forma vegetativa e vai começar o desenvolvimento do MO naquele alimento. Quando ocorre essa multiplicação no alimento, vai haver a formação da toxina que é a mesma toxina que é formada no tipo infecção, a diferença é que enquanto a outra vai ser formada no TGI, essa daqui vai ser formada no alimento antes da ingestão. 
Essa toxina ela vai provocar os mesmos sintomas da tipo infecção. Então vou ter o individuo com diarréia com sangue, vai ter uma necrose intensa da mucosa intestinal, vai ser sem febre, cólica intensa e um desconforto muito grande, pode ter vômito. 
Qual vai ser a diferença? Essa cepa tipo C intoxicação, vai ocorrer a ingestão do alimento com a toxina pré formada. Por isso que é tipo intoxicação, a toxina já foi formada no alimento e a pessoa vai desenvolver os sintomas pela ingestão da toxina. 
A cepa do tipo C é muito mais agressiva do que a cepa do tipo A, mas apesar de ser mais agressiva ela é mais rara. Porque: essa toxina que é formada no alimento, ao chegar no estomago ela é termosensível ao pH estomacal. E quando estou falando da toxina que foi pré formada no alimento, eu vou ingerir esse alimento com a toxina, e quando chegar no estomago, devido ao pH estomacal, essa toxina pode ser destruída, dependendo da imunidade do indivíduo. Se eu estiver falando de crianças, recém nascidos, idosos ou de algum adulto que tenha alguma doença que diminua o sistema imunológico, a pessoa vai desenvolver a doença. Mas se for um individuo sadio, a tendência é que quando esse alimento contaminado pela toxina passe pelo estomago, essa toxina seja destruída. Então essa toxina é sensível ao pH estomacal, por isso que a ocorrência desse tipo é mais rara. 
Toda vez que eu pensar em Clostridium perfringens tipo C, eu devo pensar no suíno como reservatório. Então os produtos incriminados nesse tipo de surto pela cepa do tipo C do Clostridium perfringens, vão ser os produtos de carne suína, principalmente bacon e tocinho. Porque? Quando eu penso no suíno, dificilmente o matadouro faz a esfola como faz no bovino. Geralmente eles só fazem a depilação (eles retiram pêlo), e eles vão retirar a pele junto com a gordura de cobertura e vão vender, que vai dar origem ao bacon e ao tocinho. E nesse sistema o que acontece: o suíno, o comportamento dele é de deitar e rolar nas fezes, então a tendência é que nessa pele eu encontre MO entéricos, entre eles, o Clostridium perfringens. 
Então o suíno é considerado reservatório e pelo comportamento que eles possuem de deitar e rolar nas fezes, existe uma tendência de nós encontrarmos na pele desse suíno MO entéricos, sendo que dentre desses MO entéricos podemos encontrar o Clostridium perfringens.
Então a cepa do tipo A ela sempre vai ser do tipo infecção na forma clássica. 	
Cepa do tipo C ela pode ser: tipo Infecção ou tipo Intoxicação. 
A cepa do tipo A vai estar mais incriminada com o consumo da carne assada 
A cepa do tipo C vai estar mais relacionada com o consumo de produtos suínos
Uma coisa importante é que no momento, se eu tiver com esses sintomas, dificilmente vc consegue descobrir que foi o Clostridium perfringens e se foi a cepa do tipo A ou C. É muito difícil, porque primeiro a pessoa não notifica a vigilância, então a vigilância não tem como saber o que aconteceu. E as vezes vc não consegue relacionar o alimento com os sintomas. E isso que acaba acontecendo, e geralmente os médicos não tem essa visão de alimento e sintoma, então eles tratam como se fosse qualquer indisposição intestinal e não descobrem a causa, então as notificações que existem são muito poucas. Mas esse numero não é baixo porque não existe a intoxicação ou infecção por Clostridium perfringens, é porque não existe a notificação, o diagnóstico.
Identificação e contagem
Como vai ser feito a identificação e a contagem do Clostridium perfringens numa amostra de alimento:
Vou receber a amostra no meu laboratório, geralmente vai ser uma amostra sólida ou semi-sólida. Vou ter que homogeneizar no estomacher. Esse procedimento inicial vai ser sempre igual em todas as analises. Vou receber a minha amostra, geralmente ela vai ser semi-sólida ou sólida, vou homogeneizar no estomacher, por que por ser sólido eu não vou conseguir apenas com a agitação. E vou fazer as diluições. Depois que eu preparei as minhas diluições eu vou começar a fazer a análise propriamente dita.
Vamos utilizar a técnica de plaqueamento de profundidade porque: porque eles vão crescer preferencialmente em ambientes anaeróbios. Então eles precisam para que tenha um bom crescimento, de crescer num ambiente onde tenha a ausência de O2. Por isso que vou utilizar o plaqueamento de profundidade. Essa é a principal diferença entre o cultivo do Clostridium perfringens para o Bacillus cereus e para o Staphylococcus aureus, porque nesses outros 2 MO nós vamos fazer o plaqueamento de superfície.
Vou pegar 1ml da diluição e vou colocar numa placa de petri vazia (porque se é plaqueamento em profundidade, primeiro eu coloco o inócuo para depois adicionar o meio de cultura). Depois que eu adicionei o inócuo, eu vou adicionar o meio de cultura. O meio de cultura vai estar na temperatura de 45°C, porque o meio de cultura é um Agar, é sólido, se eu não tiver o meio de cultura a 45°C, se estiver abaixo disso, ele vai estar sólido, eu não vou conseguir derramar esse meio na minha placa de petri. 
Então vou verter o meio de cultura chamado de Agar SPS. Esse meio de cultura possui em sua composição o sulfito que é um substrato utilizado por todas as espécies de Clostridium. Eu vou ter a polimixina e a sulfadiazina, tanto a polimixina quanto a sulfadiazina são inibidores de outros grupos de bactérias.
Nessse Agar eu vou ter sulfito que é o substrato mais utilizado pelas bactérias do gênero Clostridium. Vou ter a polimixina e a sulfadiazina que são inibidores.
Essa primeira prova vai ser feita para verificar a presença do gênero Clostridium. Eunão posso afirmar depois dessa prova que é um Clostridium perfringens. Para eu saber qual é a espécie, eu preciso realizar as provas bioquímicas.
Então essa primeira etapa vai apenas me dizer se é uma bactéria do gênero Clostridium ou não. 
Adicionei o meu meio de cultura na placa de petri, vou esperar em torno de uns 15-25 minutos para solidificar. Depois que solidificou eu vou incubar essa placa. Só que vai ter uma outra diferença quanto aos outros MO. Como é um MO anaeróbio, eu preciso cada vez mais dar condições de anaerobiose para eles, porque antes de incubar eu vou pegar a placa de petri e vou colocar na jarra de Gaspak. Essa jarra vem com uns riscos que são riscos compostos por uma substância e esses riscos vão retirar o O2 presente aqui dentro dessa jarra. Então o ambiente vai ser de anaerobiose. Vou colocar as placas aqui dentro, vou fechar e vou incubar essa jarra na estufa. 
Toda vez que estiver pesquisando um MO que seja anaeróbio eu preciso utilizar a jarra Gaspak na incubação. 
Vou incubar a jarra Gaspak com as placas a 46°C durante 24-96 horas. Essa temperatura e esse tempo também são diferentes do Bacillus e do Staphylococcus. Essa temperatura de 46°C vai ser favorável para o crescimento do Clostridium e além disso ela também vai ser seletiva porque os outros MO, a maioria deles não conseguem se desenvolver nessa temperatura. São raros os MO que possuem a temperatura ótima de crescimento a temperatura de 46°C. 
Uma outra coisa importante é que quando eu falo de incubação, tanto aqui quanto do Staphylococcus quanto do Bacillus, eu sempre vou utilizar a temperatura de incubação a temperatura ótima de crescimento do MO. 
Então eu incubei a jarra Gaspak na estufa, o tempo é maior porque eu preciso que os esporos esporulem, formem a forma vegetativa e formem as colônias visíveis. 24 horas dependendo do grau de contaminação do meu alimento pode crescer, porem é mais comum nós obtermos esse crescimento a partir de 72 horas. Sempre é bom lembrar que nessas etapas iniciais eu preciso ter a colônia isolada de uma colônia visível. Se eu tirar antes do tempo preconizado provavelmente não vai ter ocorrido a formação da colônia. 
Então eu retirei após as 96 horas, retirei a jarra Gaspak da estufa. O que eu vou observar: se for um MO do gênero Clostridium, o que vai acontecer: eles vão utilizar o sulfito. Ou seja, eles são sulfitos redutores, então eles vão reduzir o sulfito em sulfeto formando colônias com a coloração negra (fica bem pretinho).
Nesse momento, se eu retirar minha placa da estufa e eu observar a formação de colônias negras, significa que houve a utilização do sulfito, esse sulfito foi reduzido a sulfeto, tanto a coloração negra. Porque se dá essa coloração negra: quando há redução do sulfito em sulfeto também há liberação de ferro, e o ferro também é negro, então vai dar a essa colônia uma característica de cor escura. 
Nesse momento eu sei que estou trabalhando com um MO sulfito redutor, com um Clostridium sulfito redutor. Eu ainda não posso afirmar que seja o Clostridium perfringens. 
A partir desse momento eu vou partir para as provas bioquímicas. Assim como no Staphylococcus assim como no Bacillus, eu preciso restabelecer o potencial LOG do meu MO. Ou seja, o potencial de multiplicação. 
Vou pegar de 3-5 colônias características que cresceram no Agar SPS e vou semear no Agar nutriente inclinado. 
Toda vez que eu for restabelecer o potencial de multiplicação de um MO, independentemente da espécie, eu sempre vou utilizar um meio de enriquecimento, que vai ser um meio que vai dar condições para o meu MO restabelecer o seu potencial máximo de multiplicação.
Geralmente nós utilizamos o Agar nutriente, só que as vezes agente não tem o Agar nutriente no laboratório, então vc pode optar por outro meio de enriquecimento. 
Então eu vou pegar essas colônias características que cresceram no Agar SPS, as colônias negras e vou inocular no Agar nutriente inclinado. Vou incubar. Nesse momento não precisa estar na jarra gaspak, pode incubar normalmente no tubo de ensaio. Incubar a 46°C durante 24-48 horas. Vou utilizar esse tempo porque não estou trabalhando mais com esporo, estou trabalhando já com a colônia formada, então eu não preciso esperar a transformação do esporo na forma vegetativa. 
Relembrando: o Agar nutriente inclinado vai estar num tubo de ensaio inclinado, justamente para eu ter uma maior superfície de contato. 
Para a determinação, para a confirmação da espécie Clostridium perfringens eu vou realizar 5 provas bioquímicas:
- Prova de redução do nitrato a nitrito; 
- Prova da motilidade;
- Prova da coagulação do leite;
- Fermentação da glicose e da lactose;
- Prova da gelatinase.
Vamos ver que a partir de agora, todos os MO que vamos utilizar vai ter uma infinidade de provas bioquímicas. Então faz uma tabela mostrando quais provas bioquímicas se faz para cada grupo, para não nos enrolarmos.
A prova da gelatinase não vou falar de novo porque é igual a que foi feita para Staphylococcus aureus e para Bacillus cereus. Então estudar no caderno.
Vou utilizar o meio gelatina nutritiva e vou precisar um tubo controle e de um tubo onde vou inocular as minhas colônias, porque justamente como é uma gelatina eu não posso autoclavar o meu meio senão vai desnaturar, então eu preciso trabalhar com um grupo controle. Essa prova no caso do Clostridium perfringens vai ser positiva, ele vai ser produtor da enzima gelatinase. (Gelatinase +).
Então eu incubei o meu Agar nutriente inclinado em estufa, depois de 48 horas eu retirei. O que vou fazer agora: a partir das colônias que cresceram nesse Agar nutriente inclinado é que vou realizar todas as provas bioquímicas. 
A primeira prova: prova de redução do nitrato a nitrito.
Essa prova tem como objetivo verificar se o MO em questão, se ele é capaz de reduzir o nitrato em nitrito utilizando as enzimas Nitrato Redutase Assimilativa e Nitrato Redutase Respiratória. 
Ou seja, o objetivo dessa prova é verificar se o MO que está contaminando a minha amostra é capaz de reduzir o nitrato a nitrito através da produção dessas 2 enzimas: a Nitrato Redutase Assimilativa e a Nitrato Redutase Respiratória.
Dependendo a capacidade de desenvolvimento do meu MO, ele pode produzir muita quantidade de enzimas, ou uma quantidade um pouco menor. Dependendo dessa quantidade de enzima produzida, o nitrato pode ser reduzido a nitrito, quando a quantidade de enzima produzida for pequena. Ou no caso do MO produzir uma quantidade muito elevada das 2 enzimas, vou ter a redução do nitrato a amônia. Vai alem do nitrito, vai reduzir nitrato a nitrito e o nitrito em amônia.
Quando a quantidade de enzimas produzidas for uma quantidade pequena, vai reduzir o nitrato até nitrito. Então o que vou fazer: vou pegar 2 a 3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e vou semear, vou inocular no Caldo Nitratado. Como o próprio nome já diz, o principal substrato desse meio de cultura vai ser Nitrato. 
Vou incubar o tubo com caldo Nitratado inoculado a uma temperatura de 35-37°C durante 48 horas. 
Então eu peguei de 2-3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e semeei no caldo nitratado. Incubei esse caldo nitratado onde foi inoculado minhas colônias, vou tirar da incubação. 
Depois da incubação eu vou pingar 2 reagentes nesse tubo, que são: Ácido sulfanílico e o Alfa-naftil amina. Pode ocorrer 3 tipos de resultados: 
1º deles: Eu posso ter tido a formação de nitrito durante a incubação. Quando eu tenho a formação do nitrito durante a incubação e eu pingo os reagentes, o meu tubo do meio de cultura vai adquirir a coloração vermelha. 
Se ocorreu a redução do nitrato em nitrito durante a incubação, quando eu pingar os reagentes vai formar a cor vermelha, significa que a prova é positiva porque houve a redução do nitrato a nitrito. 
2º deles: Se houver a presença de nitrato no meu tubo após a incubação, significa que a bactéria em questão não é capaz de reduzir o nitrato em nitrito. 
Se depois da incubação tiver nitrato presente no tubo, significa que abactéria que está contaminando minha amostra não é redutora, e não é Clostridium perfringens. 
O meu tubo vai ficar amarelo. 
3º deles: Porém existe a possibilidade do meu MO produzir muita enzima e reduzir o nitrato até chegar a amônia. Também vai ficar amarelo. O que eu preciso fazer: toda vez que eu tiver nessa prova o tubo amarelo, eu não sei se o resultado é negativo porque é negativo ou se é um falso negativo pela presença de amônia. O que vou fazer: vou pegar um tubo amarelo e vou colocar zinco em pó.
O zinco em pó tem a capacidade de provocar a redução do nitrato em nitrito. Então o tubo que for amarelo depois da incubação, quando eu adicionar o zinco em pó, se nesse tubo houver a presença do nitrato, o zinco em pó vai reduzir esse nitrato em nitrito, e o tubo que era amarelo vai ficar vermelho. Então significa que nesse caso a prova é negativa, porque a redução de nitrato em nitrito não foi provocada pela produção de enzimas do MO, ela foi provocada pela adição do zinco em pó. Então o tubo vai ficar vermelho, porém é uma prova negativa.
Se no meu tubo, onde tinha amônia (eu não sabia que era amônia, era amarelo), eu adicionar o zinco em pó, não vai ocorrer nada, ele continua amarelo, porque o zinco em pó não reage com a amônia. Então como ele não reage com a amônia vai continuar amarelo o meu meio de cultura, então nesse caso a minha prova é positiva para redução de nitrato a nitrito.
É uma prova bem fácil de realizar porque as cores são fáceis de identificar.
Prova da motilidade
	A segunda prova que será realizada é a prova da motilidade. É uma prova que vai ser realizada no meio de cultura chamado de Meio SIM.
	Essa prova vai permitir identificarmos se o microrganismo apresenta a capacidade de se multiplicar em diversos locais ou se é um MO imóvel. 
Esse meio de cultura é interessante porque ele vai permitir que nós realizemos 3 provas ao mesmo tempo. Consigo realizar nesse meio a prova do sulfito, a prova do Indol e a prova da motilidade.
Então utilizando apenas esse meio de cultura eu vou conseguir verificar se meu MO está conseguindo reduzir o sulfito, se é produtor de Indol e a prova da motilidade (se é móvel ou imóvel)
O que vou fazer: vou semear 2 ou 3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado no meio SIM (o meio SIM é um Agar, então vai ser duro). Então eu semeei as minhas colônias nesse meio de cultura. Vou incubar a 35-37°C durante 24-48 horas.
O que pode acontecer depois da incubação: sabemos que nosso MO é sulfito redutor, então ele vai reduzir o sulfito em sulfeto liberando ferro e formando pontos pretos. Então vai haver a formação de colônias negras, e isso caracteriza o fato de ser sulfito positivo. 
Quanto a motilidade: se o crescimento das colônias ocorrerem somente no local da semeadura, significa que essa prova é motilidade negativa, significa que esse MO é motilidade negativa.
Se o crescimento ocorrer em todo o meio de cultura e não somente no local de semeadura, significa que esse MO é móvel. Então a prova é um resultado de motilidade positiva. 
Prova do indol, como vamos fazer: essa prova do indol tem como objetivo verificar a capacidade do MO produzir a enzima triptofanase degradando o triptofano presente no meio de cultura em indol. Então qual o objetivo da prova do indol? Eu vou verificar a capacidade do MO degradar o triptofano por meio da produção da enzima triptofanase com produção do indol. 
	Porem quando eu retiro o tubo da estufa eu não consigo ver se houve a produção ou não do indol. O que eu faço: eu retiro da estufa e pingo o reagente de Kovac’s. O reagente de Kovac’s se tiver tido a degradação do triptofano produzindo indol, ou seja, se o indol estiver presente no meio de cultura após a incubação, ao pingar o reagente de kovac’s, vai haver a formação de um anel vermelho na superfície do tubo. 
	Se não tiver ocorrido a produção de indol, não vai acontecer nada, vou pingar o reagente e não vai haver nenhuma formação de anel. 
Para ser Clostridium perfringens eu preciso que seja sulfito +, indol + e motilidade -.
Então significa que como característica eu vou ter a formação de colônias negras no local onde foi semeado (porque é motilidade negativa) com um anel vermelho. O anel vermelho vai estar relacionado com a produção de indol, e as colônias negras com a redução do sulfito em sulfeto.
Se tiver algum resultado diferente, é negativo para Clostridium perfringens.
Prova da coagulação do leite
	Vou pegar de 2 a 3 colônias que cresceram no Agar nutriente inclinado e vou semear num tubo contendo leite desnatado. 
O Clostridium perfringens tem a capacidade de produzir a enzima caseinase, quando há produção da enzima caseinase vai provocar a coagulação da caseína. E a caseína é a principal enzima presente no leite. sendo que o meu MO (Clostridium perfringens) que estou pesquisando ele é produtor de caseinase. 
Então eu vou inocular as colônias nesse leite desnatado e vou incubar esse tubo a uma temperatura de 35-37°C durante 24-48 horas. Após a incubação, se o meu leite estiver coagulado, significa que o MO produziu a enzima caseinase durante a incubação e o meu leite coagulou. É a prova positiva.
Se o leite não estiver coagulado após a incubação, é prova negativa para produção da enzima caseinase e não é Clostridium perfringens.
Fermentação da glicose e da lactose : Vamos falar na próxima aula.