PRÁTICA 8 - RELATÓRIO DE BIOQUIMICA

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO 
 CURSO DE GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA 
 
 
 
 
LAIANE DEVESA ARAÚJO 
 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA 
DOSAGEM DE PROTEÍNAS- MÉTODO DE BRADFORD 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PETROLINA 
2022 
 
LAIANE DEVESA ARAÚJO 
 
 
 
 
 
AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA 
DOSAGEM DE PROTEÍNAS- MÉTODO DE BRADFORD 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
PETROLINA 
2022 
 
 
OBJETIVO(S): 
 
 Construir uma curva padrão para dosagem de proteínas totais solúveis. 
 Encontrar a equação da reta e o coeficiente de correlação (r2). 
 Determinar a concentração de proteína total solúvel em amostras desconhecidas 
 
INTRODUÇÃO 
 
 
O método de Bradford (Bradford, 19761) baseia-se na observação de que o Azul Brilhante 
de Coomassie G-250 se converte da cor vermelha para azul após ligação à proteína. O complexo é 
formado rapidamente (2 min.), permanece disperso em solução por um tempo relativamente longo 
(1 h.) e tem um alto coeficiente de extinção, permitindo grande sensibilidade na dosagem das 
proteínas. As soluções usadas neste método são soluções aquosas de proteína (Albumina Sérica Bovina - 
BSA) 1 mg mL-1 e as soluções de concentração desconhecidas 
O preparo dos reagentes para solução do reagente de Bradford: 100 mg de Azul de 
Coomassie G - 250, dissolvido em 50 mL de Etanol P. A.; 100 mL de Ácido Fosfórico (H3PO4) 85%, 
Água “milli Q” q.s.p 1.000 mL. Para o preparo é necessário dissolver o Azul de Coomassie em Etanol 
P. A., e após dissolver, adicionar o Ácido Fosfórico 85%, homogeneizar bem ( 5 min.). Completar 
o volume com Água “milli Q”. A curva padrão para dosagem de proteínas é construída utilizando-se 
a proteína solúvel Albumina do Soro Bovino (B.S.A.). 
 
Método do biureto 
 
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de Autenrieth, em 1915; 
posteriormente diversos autores propuseram modificações do mesmo, sendo, atualmente, a proposta 
metodológica de Gornall e cols9. a mais utilizada. O método se baseia na reação do reativo do biureto, 
que é constituído de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o 
cobre em solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols.9. O cobre, em meio 
alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica. O 
produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e outra em 540 nm. Apesar da 
banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a sensibilidade do método do biureto14, a banda 
na região de 540 nm é a mais utilizada para fins analíticos, porque diversas substâncias, normalmente 
presentes na maioria dos meios analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência 
no método. 
 
 
O método de biureto tem sido aplicado para determinar a concentração de proteínas totais em diversos 
meios, sendo eles: soro ou plasma sangüíneo, líquido cérebro espinhal (líqüor), urina, alimentos, saliva, 
fibrinogênio e tecido animal. O método de biureto tem sido, também, utilizado em análise por injeção em 
fluxo, assim como em alguns métodos cinéticos. Apesar de ser rápido, utilizar reagentes de baixo custo 
e não apresentar grande variação da absortividade específica para diferentes proteínas, este método 
não é muito sensível, como foi destacado por diversos autores, colocando-o em grande desvantagem, 
em relação a outras metodologias, e por isto tem sido, ao longo dos anos, substituído por métodos mais 
 
sensíveis. Mesmo assim, o método de biureto continua sendo recomendado para a determinação da 
concentração de proteínas totais em plasma sangüíneo pela Associação Americana de Análises Clínicas 
e por diversos autores, bem como para a determinação de proteínas totais em saliva30 e leite29, quando 
comparado com outros métodos. 
 
 
Verifica-se que o método de biureto está sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com 
os íons cobre. 
 
 
Método de Lowry 
 
O método que atualmente conhecemos como de Lowry e cols., para a determinação de proteínas totais, 
foi originalmente proposto por Wu, em 1922, sendo esta a metodologia mais utilizada para a 
determinação de proteínas. O princípio do método baseia-se numa mistura contendo molibdato, 
tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma redução quando reage com 
proteínas, na presença do catalisador cobre (II), e produz um composto com absorção máxima em 750 
nm. Chou e Goldstein e Legler e cols. estudaram extensivamente o mecanismo de redução do reagente 
de Folin-Ciocalteau por proteínas, peptídeos ou aminoácidos. Estes autores sugerem que esta redução 
ocorra diretamente através das cadeias laterais de alguns aminoácidos (tirosina, triptofano, cisteína, 
asparagina e histidina), que contribuem com quatro elétrons, ou através da retirada de dois elétrons de 
cada unidade tetrapeptídica dos peptídeos e proteínas, que é facilitada pela formação do quelato entre 
o cobre (II) e peptídeos/proteínas. 
 
A principal vantagem do método de Lowry é a sua alta sensibilidade e, por isto, tem sido utilizado para 
a determinação da concentração de proteínas totais em diversos meios, sendo eles: líqüor, plasma 
sanguíneo, saliva humana, tecido animal, plantas, suco biliar, membranas, leite humano e produtos 
alimentícios. Sargent propôs uma modificação no método de Lowry que possibilitou o aumento da 
sensibilidade em cinqüenta vezes. Tal modificação está baseada no fato de que o verde de malaquita 
reage com o azul de molibdato produzido no método de Lowry e o produto desta reação absorve 
fortemente em 690 nm aumentando a sensibilidade do método de Lowry. 
Devido ao seu extenso uso, o método de Lowry e cols. tem sido utilizado em diversos tipos de 
equipamentos automatizados. Em estudos comparativos de métodos, alguns autores recomendam a 
utilização da metodologia proposta por Lowry e cols. para determinar proteínas totais em líqüor, tecido 
animal e tecido vegetal. Os autores de maneira geral, recomendam o método de Lowry, pois no estudo 
comparativo de metodologias o mesmo mostrou-se mais sensível, com melhor exatidão, menor 
consumo de amostra e, dependendo do caso, menos suscetível a alguns tipos de interferentes. 
Apesar do método de Lowry e cols.10 apresentar uma grande sensibilidade para proteínas, o mesmo 
possui algumas desvantagens, tais como: estar sujeito a muitos interferentes, apresentar longo tempo 
de análise, possuir absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas, e seguir a Lei 
de Beer-Lambert apenas numa pequena faixa de concentração de proteínas. Várias modificações no 
método de Lowry têm sido propostas para resolver os problemas acima citados. Para aumentar a 
velocidade da reação, Shakir e cols. recomendam aquecer a amostra, por 3 minutos, a 37°C, após a 
adição de sulfato de cobre alcalino, e por mais três minutos, após a adição do reagente de Folin-
Ciocalteau. Larson e cols. recomendam a adição de tri-1,4-dimercaptobutanodiol, 3 minutos após a 
adição do reagente Folin-Ciocalteau, com o objetivo de aumentar a velocidade de reação e eliminar a 
etapa de 30 minutos de espera. Alam60 propõe um rígido controle do pH para diminuir o tempo de 
análise, estabilizar o produto formado e uniformizar as absortividades específicas das diferentes 
proteínas. Hartree fez várias modificações no método de Lowry melhorando a faixa de linearidade e 
uniformizando as absortividades específicas para algumas proteínas; estas modificações são as mais 
utilizadas, apesar de tornar o método de Lowry mais trabalhoso no preparo dos reagentes. 
Stauffer recomenda a construção do gráfico de log Abs versus log microgramas de proteína e Hess e 
cols. Recomendam o uso de alta concentração do reagente Folin-Ciocalteau. Tais procedimentos, 
segundo estes autores, diminuem o tempo de análise, uniformizam as absortividades específicas para 
 
algumas proteínas e/ou aumentam a faixa de linearidadedo método de Lowry e cols. Diversas 
substâncias interferentes no método de Lowry são citadas na literatura; estas normalmente causam 
aumento na absorbância do branco, diminuição da absortividade específica ou formação de algum tipo 
de precipitado. 
Apesar de todos os esforços para melhorar o método de Lowry, isto é, diminuir o tempo requerido para 
a análise, aumentar a faixa de linearidade para a lei de Beer e tornar mais homogênea as absortividades 
específicas para diferentes proteínas, o mesmo continua moroso e sujeito a inúmeros interferentes e, 
nos últimos anos, está sendo substituído por outros métodos, tais como, o método de Bradford e o 
método de Smith ou do BCA. 
 
 
Método de Smith ou do BCA 
 
O método proposto por Smith e cols.12, também conhecido por método do ácido bicinchoninico (BCA 
4,4'-dicarboxi-2,2'- biquinolina), se baseia na reação de cobre (II) com proteínas, em meio alcalino, 
produzindo cobre (I) e formando um complexo com o BCA, que absorve fortemente na região de 560 
nm. 
No entanto, Legler e cols., estudando o papel catalisador do cobre, em meio alcalino, na reação entre 
proteínas e o reativo de Folin-Ciocauteau, detectaram formação de um intermediário de cobre (III) com 
peptídeos, porém não detectaram cobre (I), como estabelecido por Smith e cols., devendo, portanto, ser 
este mecanismo melhor estudado para se estabelecer qual ou quais intermediários de cobre são 
formados. 
Este método tem a vantagem de ser mais simples no preparo dos reagentes, tão sensível quanto o 
método de Lowry e cols. e relativamente rápido, sendo aplicado na determinação da concentração de 
proteínas totais em saliva, proteínas celulares, interferons, leite humano e determinação de grupos 
funcionais. O método de Smith e cols. tem sido recomendado em estudos de comparação de 
metodologias para a determinação de proteínas totais em leite humano e células. Esta metodologia 
também tem sido adaptada para a determinação de proteínas totais utilizando-se equipamentos 
automatizados. 
 O método de Smith e cols. possui algumas desvantagens, como a dependência da temperatura de 
incubação das amostras, a variação da absortividade específica para diferentes proteínas e a variação 
da absorbância com o tempo. 
Recomendamos, portanto, um rígido controle no tempo de leitura das amostras, após a incubação das 
mesmas. 
Os interferentes, em potencial, do método de Smith e cols. são aquelas substâncias que reagem com 
os íons cobre (reações de óxido-redução, formação de complexos, precipitação) ou com o reativo de 
BCA. 
 
Método de absorção no ultra violeta 
 
As medidas espectroscópicas de absorção molecular na região do Ultravioleta-Visível (UV-Vis) baseiam-
se nas interações da radiação com a matéria. A região do ultravioleta é considerada entre 200 – 400nm 
e a região do visível entre 400 – 800nm. 
A técnica consiste em passar luz pela amostra e medir a fração de luz que é absorvida. A fração de luz 
absorvida é descrita pela lei de Lambert – Beer, que afirma que a fração de luz após a interação com a 
amostra (I) versus a intensidade de luz incidente (I0) é dependente do percurso da luz através da amostra 
(I), da absortividade molar do material (Ԑ) e da concentração das espécies absorventes (c). 
Esse equipamento realiza leituras nas regiões do visível e do ultravioleta (190 – 1100nm). O sistema 
óptico é de feixe duplo. Acomoda até oito cubetas e possui amostrador automático ou manual. O 
equipamento permite fazer medição fotométrica, varredura de espectro e determinação quantitativa. Os 
dados obtidos nas leituras são facilmente exportados em arquivos Excel, já que o equipamento é 
conectado a um computador, o que também permite utilizar recursos como medidas cinéticas, 
armazenamento de métodos e dados. 
 
 
 
 
 
 
 
MATERIAL E MÉTODOS: 
 
 
 Solução de BSA (1 g 
mL-1) 
 Água ultra pura (H2O 
Milli-Q) 
 Reagente de Bradford 
 Cubeta de plástico 
 Espectrofotômetro 
Visível 
 Estante para tubos de 
ensaio 
Material 
 Pipeta Automática 
 Ponteiras 
 Vórtex 
 Tubos “Falcon” 
 Saliva 
 Solução salina de extrato de sementes de 
feijão 
 
 
 
 
 
 
Metodologia 
 
 
 A uma solução de B.S.A com concentração de 1 mg mL-1(solução mãe). Foi diluído a solução mãe 
1 : 1000, medindo 100 uL da solução mãe e misturado a 9,9 mL de H2O Milli-Q, obtendo assim 
uma solução com [B.S.A] = 1 g mL-1, que será a solução de trabalho. 
 Colocou – se 31 tubos Falcon em uma estante para tubos de ensaios. Numerado os tubos de 
1 a 10 e usou um tubo para ser a testemunha (branco). No branco foi adicionado tudo que havia 
nos outros tubos, porém no lugar da B.S.A., colocou-se H2O Milli-Q. 
 Feito os procedimentos em triplicata e preenchido no quadro a seguir: 
 
RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO 
 
Preencha as lacunas vazia no quadro a seguir: 
 
TUBO REPETIÇÃO 
[B.S.A] = 1 g  mL-1 H2O Milli-Q Reagente de Bradford 
 
A
g
it
a
r 
n
o
 V
ó
rt
e
x
 e
 a
g
u
a
rd
a
r 
d
e
 5
 a
 1
0
 m
in
 a
 t
e
m
p
e
ra
tu
ra
 a
m
b
ie
n
te
 
 (595 nm) B.S.Afinal (g) (L) (L) (mL) 
 
1 
1 
2 
 
18 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1,0 
0,049 
1 2 0,068 
3 0,046 
 
2 
1 
4 
 
16 
0,111 
2 2 0,107 
3 0,036 
 
3 
1 
6 
 
14 
0,122 
3 2 0,142 
3 0,136 
 
4 
1 
8 
 
12 
0,169 
4 2 0,139 
3 0,140 
 
5 
1 
10 
 
10 
0,157 
5 2 0,191 
3 0,203 
 
6 
1 
12 
 
8 
0,189 
6 2 0,234 
3 0,194 
 
7 
1 
14 
 
6 
0,254 
7 2 0,233 
3 0,257 
 
8 
1 
16 
 
4 
0,273 
8 2 0,282 
3 0,297 
 
9 
1 
18 
 
2 
0,299 
9 2 0,315 
3 0,278 
 
10 
1 
20 
 
0 
0,332 
1
0 
2 0,241 
3 0,336 
BRANCO 0 20 0,418 0 
 As repetições que estão marcadas de vermelho NÃO são consideradas** 
 
 
 
 
 
 
 
 
Este experimento foi considerado aceito pois seu r2 (índice de correlação) = 0,9852, sendo assim, obedece a 
estatística padrão que necessariamente o r2 deve ser maior que 0,96 e menor que 1.
y = 0.0304x + 0.0346
R² = 0.9852
0.00
0.05
0.10
0.15
0.20
0.25
0.30
0.35
0.40
0 2 4 6 8 10 12
A
b
so
rb
ân
ci
a 
(5
95
 n
m
 )
(BSA) (ug . mL -1)
Curva padrão
 
AMOSTRAS DESCONHECIDAS 
 
 
TUBO 
 
REPETIÇÃO 
Saliva 
(L) 
H2O Milli-Q 
(L) 
Reagente de 
Bradford 
(mL) 
A
g
it
a
r 
n
o
 V
ó
rt
e
x
 e
 a
g
u
a
rd
a
r 
d
e
 
5
 a
 1
0
 m
in
 a
 t
e
m
p
e
ra
tu
ra
 
a
m
b
ie
n
te
 
 
 (595 nm) 
sem 
diluição 
1 
20 
 
0 
 
 
 
1,0 
0,707 
2 0,718 
3 0,785 
Diluição 
1:10 
1 
2 
 
18 
0,291 
2 0,309 
3 0,331 
Diluição 
1:100 
1 
*20 L 
0,138 
2 0,129 
3 0,117 
 
As repetições que estão em vermelho são excluídas, pois são mais afastadas que as outras. *** 
 
 
*1:100  1 L de saliva + 99 L de água = 100 L de solução. Tira-se, dessa solução, alíquotas de 20 L 
para cada repetição. 
 
 
 
 
 
Na amostra da saliva foi considerado a diluição 1:10 pois entre a diluição de 1:100, os números 
da diluição de 1:10 são miaores e aceito consequetemente a média será estatisticamente 
satisfatória , a sem diluição está fora da curva, pois seus valores foram maiores que 0,700; 
1:100 está dentro da curva, porém seus valores são baixos 
 
 
 
 
TUBO 
 
REPETIÇÃO 
Extrato de 
Cotilédone de feijão 
(L) 
H2O Milli-Q 
(L) 
Reagente de 
Bradford 
(mL) 
A
g
it
a
r 
n
o
 V
ó
rt
e
x
 e
 a
g
u
a
rd
a
r 
d
e
 5
 a
 
1
0
 m
in
 a
 t
e
m
p
e
ra
tu
ra
 a
m
b
ie
n
te
 
 
 (595 nm) 
sem 
diluição 
1 
20 
 
0 
 
 
 
1,0 
0,360 
2 0,336 
3 0,341 
Diluição 
1:100 
1 
*20 L 
0,096 
2 0,125 
3 0,142 
Diluição 
1:1.000 
1 
**20 L 
0,012 
2 0,036 
3 0,089 
Saliva A( A= 595nm) MÉDIA
Sem diluição 0,707 0,7125
0,718
A
Diluição 1:10 0,291 0,300
0,309
Diluição 1:100 0,138 0,1335
0,129
 
*1:100  1 L de saliva + 99 L de água = 100 L de solução. Tira-se, dessa solução, alíquotas de 20 L 
para cada repetição. 
**1:1000 1 L de saliva + 999 L de água = 1000 L de solução. Tira-se, dessa solução, alíquotas de 20 
L para cada repetição. 
 
 
 
 
Na amostra do feijão foi considerado a diluição 1:10 pois como é mostrado no gráfico, 
apresenta uma diluição mais centralizada, conforme a estatística exige a média central. 
 
Calcule a concentração de proteínas totais solúveis 
 
Concentração de proteína 
X= Y – 0,0346/ 0,0304 
 
SALIVA 
X= 0,300 – 0,0346 / 0,0304 = 8,73 
 
FEIJÃO 
X= 0,134 – 0,0346 / 0,0304 = 3,25 
 
 
CONCLUSÃO 
 
Portanto, de acordo com os resultados obtidos pode – se considerar que o experimento da 
saliva apresentou uma concentração de proteína maior do que o experimento de Extrato de 
Cotilédone de feijão. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
FEIJÃO A( A= 595nm) MÉDIA
Sem diluição 0,336 0,3385
0,341
Diluição 1:10 0,125 0,134
0,142
Diluição 1:100 0,012 0,024
0,036
 
 
 
 
 
Referências 
 
(s.d.). Fonte: BRASIL ESCOLA: https://brasilescola.uol.com.br/o-que-e/quimica/o-que-sao-
aminas.htm 
 
(2022). Fonte: BRASIL ESCOLA: https://brasilescola.uol.com.br/o-que-e/quimica/o-que-e-
eter.htm#:~:text=%C3%89ter%20%C3%A9%20uma%20fun%C3%A7%C3%A3o%20org%C3
%A2nica,a%20um%20%C3%A1tomo%20de%20oxig%C3%AAnio. 
 
Curso Bioquímica. (s.d.). Fonte: 
http://cursobioquimica.iq.usp.br/paginas_view.php?idPagina=503&idTopico=1060#.YhBGNej
MK3A 
 
UFRGS. (s.d.). Fonte: https://www.ufrgs.br/dequi-labs/central-analitica/espectrofotometro-de-
absorcao-molecular-na-regiao-do-ultravioleta-e-
visivel/#:~:text=As%20medidas%20espectrosc%C3%B3picas%20de%20absor%C3%A7%C3
%A3o,da%20radia%C3%A7%C3%A3o%20com%20a%20mat%C3%A9ria.&text=A% 
 
UFRGS . (FEVEREIRO de 2022). Fonte: https://www.ufrgs.br/dequi-labs/central-
analitica/espectrofotometro-de-absorcao-molecular-na-regiao-do-ultravioleta-e-
visivel/#:~:text=As%20medidas%20espectrosc%C3%B3picas%20de%20absor%C3%A7%C3
%A3o,da%20radia%C3%A7%C3%A3o%20com%20a%20mat%C3%A9ria.&text=A% 
 
 
 
 
. 
 
 
 
 
 
 
 
 
ATIVIDADE 
 
Encontre, nomeie e defina os grupos funcionais encontrados na molécula do Azul 
Brilhante de Coomassie cuja fórmula estrutural encontra-se logo abaixo: 
 
 
 
 ÉTER 
 
 AMINA SECUNDÁRIA 
 
 
 
Éter é uma função orgânica oxigenada, isto é, apresenta o elemento químico oxigênio, além de 
carbono e hidrogênio. Essa função possui como principal característica estrutural a presença de dois 
radicais orgânicos ligados a um átomo de oxigênio. 
 
AMINA SECUNDÁRIA - são compostos orgânicos nitrogenados que derivam da substância amônia 
(NH3) formada pela substituição de dois hidrogênios da amônia por dois radicais orgânicos. 
 
AMINA TERCIÁRIA – são compostos orgânicos nitrogenados que derivam da substância amônia 
(NH3) formada pela substituição dos três hidrogênios da amônia por três radicais orgânicos. 
 
 
Justifique o fato do Azul Brilhante de Coomassie ter uma baixa solubilidade em etanol. 
O Azul Brilhante de Coomassie apresenta uma baixa solubilidade em etanol devido à suas baixas 
interações iônicas e baixas interações secundárias . Como exemplo de baixas interações secundárias 
tem – se as pontes de hidrogênio, interações hidrofóbicas e interações de Van der Waals 
 
 
 
AMINA TERCIÁRIA 
	UNIVERSIDADE FEDERAL DO VALE DO SÃO FRANCISCO
	CURSO DE GRADUAÇÃO EM ZOOTECNIA
	AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA
	DOSAGEM DE PROTEÍNAS- MÉTODO DE BRADFORD
	PETROLINA 2022
	AULA PRÁTICA DEMONSTRATIVA (1)
	DOSAGEM DE PROTEÍNAS- MÉTODO DE BRADFORD (1)
	PETROLINA 2022 (1)
	OBJETIVO(S):
	INTRODUÇÃO
	MATERIAL E MÉTODOS:
	Material
	Metodologia
	RESULTADOS EXPERIMENTAIS E DISCUSSÃO
	AMOSTRAS DESCONHECIDAS
	CONCLUSÃO
	Portanto, de acordo com os resultados obtidos pode – se considerar que o experimento da saliva apresentou uma concentração de proteína maior do que o experimento de Extrato de Cotilédone de feijão.
	Referências
	ATIVIDADE