Determinação de Proteínas Totais Via Espectrofotometria

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Determinação de Proteínas Totais Via Espectrofotometria
Mateus Alves
Introdução
A determinação de proteínas totais tem se tornado de fundamental importância em várias áreas do conhecimento:
Diagnóstico de doenças (alteração da quant. de proteínas)
Nutrição Animal
Nutrição Humana (obesidade, anorexia nervosa, desnutrição)
Tecnologia e ciencia de alimentos (melhoramento de produtos)
Métodos Espectrofotométricos mais utilizados
MÉTODO DE BIURETO
O método se baseia na reação do reativo de Biureto (mistura de Cobre e Hidróxido de Sódio mais complexante, Tartarato de sódio – estabiliza o sódio em solução).
Cobre em meio alcalino reage com as proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação peptídica.
Produto da reação
Apresenta 2 bandas de absorção:
270 nm: Aumenta em 6 vezes a sensibilidade do método, porém apresenta muita interferência, pois várias subst. absorvem nessa região.
540 nm: Mais utilizado para fins analíticos
Aplicações
Vêm sendo substituído por métodos mais sensíveis.
Utilizados para determinação de proteínas totais em plasma sanguíneo, saliva, leite, líquor, urina, etc.
VANTAGENS: Rápido, Reagente de baixo custo, não apresenta grande variação de absorvidade específica.
DESVANTAGEM: Não é muito sensível.
Interferentes
Substâncias que reagem com os íons de cobre(II)
Bilirrubina: absorve em 540nm
Amônio
Lipídios: Provoca turbidez
Hb
Dextran-40
Peptídios e aa livres (his, ser, Thr)
Melanina: Falso positivo
Lactose: Falso positivo
Amido: Falso negativo
Recomendação para interferentes
Precipitação das proteínas com acido tricloroacético e posterior solubilização das mesmas para determinação.
MÉTODO DE LOWRY
Mais utilizada para determinação de proteínas
Princípio: mistura contendo molibdato, tungstato e ac. Fosfórico, (reagente de Folin-Ciocalteau), que sofre redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador Cobre (II) e produz um composto com absorção máxima de 750 nm.
Aplicações
Alta sensibilidade;
Determinação em diversos meios: plasma, líquor, saliva, tecido animal, suco biliar, etc.
Utilizado em diversos equipamentos automatizados.
Várias propostas de modificações desse método são utilizados para minimizar os interferentes e os pontos negativos.
Interferentes
Sujeito a vários interferentes; apresenta longo tempo de análise, possui absortividade específica altamente variável para diferentes proteínas.
Compostos fenólicos: falso positivo
Lipídios: turbidez
Detergentes: formação de precipitado
Ácido úrico
Guanina e xantina: falso positivo
Bilirrubina: aumento da absorção
Açucares
etc
Recomendação para interferentes
Precipitação das proteínas: ácido tricloroacético e co-precipitantes, entre outros.
Nos últimos anos, vem sendo substituido por metodos como Bradford, Smith.
MÉTODO DE BRADFORD
Princípio: utilização do corante de “coomassie brilliant blue” BCG-250 e sua interação com macromoléculas de proteínas que contem aa de cadeias laterais básicas ou aromáticas. Provocando o deslocamento do corante para a forma aniônica , que absorve fortemente em 595 nm.
Aplicações
Mais rápido e sensível que Lowry e tambem com menor número de interferentes.
Utilizada para diversos meios;
Urina: depende do numero de diluições e da presença de proteínas de baixo peso moecular (problema – proteinúria).
Utilizado também em equipamentos automatizados .
Interferentes
Desvantagens: variação da absortividade específica, fornecimento de resultados nem sempre reprodutíveis.
Para proteínas de baixo peso molecular – Não recomendável!
Os interferentes reagem com as proteínas impedindo a reação com o corante ou reagem com o corante causando aumento da absorvância.
Interferentes
Tolbutamida, Uréia, Detergentes, Polifenóis, Glicerol, lipídios, fluoreto.
Para eliminação de interferentes recomenda-se precipitação de proteínas com ácido tricloroacético.
MÉTODO DE SMITH OU BCA
Baseia-se na reação de cobre (II)com proteínas em meio alcalino, produzindo cobre (I) e formando um complexo com BCA, que absorve fortemente na região de 560nm.
Preparação de reagente simples, relativamente rápido e tão sensível quanto lowry.
Aplicado em saliva, leite, interferons, determinação de grupos funcionais;
Pode ser adaptado para eq. Automatizados.
Interferentes
Desvantagem de dependência de temperatura de incubação, variação de absortividade específica e variação da absorvância com o tempo.
Interf. Substancias que reagem com íons cobre ou com o reativo de BCA – Açucares, EDTA, Lipídios, Sulfato de amônio, Penicilina, Vitamina C e Paracetamol.
Recomendação precipitação com ácido tricloroacético.
MÉTODO DE ABSORÇÃO NO ULTRA-VIOLETA
Baseado no fato de proteínas mostram absorção na região de 280nm (devido a diversos aa) e 220nm (devido a ligação peptídica).
280nm em PH neutro somente Triptofano, tirosina e cistina possuem absortividade molar signif. Grande.
É aplicado em procedimentos de Purificação e separação de proteínas. É rapido e não destrói a amostra
Interferentes
Muitos interferentes – qualquer substância que apresente banda de absorção na região de leitura é um potencial interferente.
Método mais utilizado para purificação.
NOVOS MÉTODOS
PBQ (p-benzoquinona) – produto da reação de PBQ e proteínas absorve em 350 nm.
Prata amonical liga-se a proteínas e absorve fortemente em 420 nm. (100 vezes mais sensível que Bradford.
Ouro coloidal na presença de proteínas desloca o seu max de absorção de 535 para 595nm.
Para escolha da metodologia é essencial conhecer a natureza dos constituintes da amostra e suas concentrações aproximadas, facilitando assim a identificação de possíveis interferentes e na escolha do melhor método.