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André Fioravante Guerra 1ª Edição Valença – RJ, 2014 MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS Análise de coliformes GRUPO COLIFORME A presença das bactérias deste grupo nos alimentos fornece evidência indireta sobre a qualidade da matéria prima, condições de processamento, condições do armazenamento e transporte ao qual este alimento foi submetido. Portanto, são análises que evidenciam indiretamente: Condições higiênicas – o grupo responsável por indicar indiretamente as condições higiênicas ao qual o alimento foi submetido durante toda cadeia produtiva é o grupo dos coliformes totais, que incluem: Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella. Condições higiênicas sanitárias – além de evidências indiretas sobre higiene, também há evidências da possibilidade da veiculação de microrganismos patogênicos pelos alimentos. O grupo responsável por indicar indiretamente as condições higiênicas sanitárias é o grupo dos coliformes fecais. Atualmente, na RDC n°12/2001 está descrito os padrões microbiológicos dos alimentos no Brasil. Em quase todos alimentos são exigidos limites para coliformes a 45°C, mas somente em alguns exige-se padrões para coliformes a 35°C. Acredita-se que dentro dos limites propostos pela legislação, há certa segurança sobre a presença de patogênicos. Atualmente sabe-se que alguns sorovares de Escherichia coli (coliformes fecais) são patogênicos, assim como algumas Enterobacter (coliformes totais). Sabe-se que alguns sorovares de Escherichia coli, mesmo que em doses baixíssimas, podem causar doenças de origem alimentar. Este risco é assumido quando se analisa a presença do grupo coliformes dentro dos limites exigido pela RDC n° 12/2001. Introdução Os coliformes totais são bactérias anaeróbicas facultativas, Gram negativas, não formadoras de esporos, com capacidade de fermentar a lactose com produção de ácido e gás a 32-35 ºC em um intervalo de 48 horas. As bactérias presentes neste grupo são: Escherichia coli, Citrobacter, Enterobacter e klebsiella. Os coliformes fecais são bactérias em forma de bastonetes, Gram negativas, não esporuladas, anaeróbicas facultativas, capazes de fermentar a lactose com produção de ácido e gás a 44,5-45,5 ºC em um intervalo de 24 horas. Na maioria das vezes, a Escherichia coli é a bactéria representante deste grupo, porém sabe-se que algumas Enterobacter e Klebsiella também conseguem fermentar a lactose com produção de gás em 24 horas na temperatura de 44,5-45,5 ºC (HAJDENWURCEL, 2004). CURIOSIDADE!!! A legislação microbiológica brasileira vigente RDC n°12/2001 exige padrões de coliformes totais apenas para um restrito grupo de alimentos. ANA LISE DE COLIFORMES FECAIS E TOTAIS EM ALIMENTOS A análise de coliformes pode ser realizada basicamente de duas formas: contagem em placas ou técnica dos tubos múltiplos. Para cumprimento dos padrões exigidos pela RDC n°12/2001, nesta apostila será contemplado a contagem de coliformes pela técnica de tubos múltiplos. Esta análise é realizada em duas etapas: fase presuntiva e fase confirmativa. FASE PRESUNTIVA Baseia-se na inoculação da amostra em caldo lauril sulfato de sódio, em que a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durhan, produzido pela fermentação da lactose contida no meio. O caldo lauril sulfato de sódio contém uma mistura de fosfatos que lhe confere um poder tamponante, impedindo a acidificação. A seletividade do meio é devido à presença do lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que atua na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o seu crescimento. FASE CONFIRMATIVA coliformes totais – a confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação dos tubos positivos na prova presuntiva em caldo verde brilhante bile 2% lactose, e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose contém bile bovina e um corante derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos. Coliformes termotolerantes - a confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio da inoculação dos tubos positivos na prova presuntiva em caldo EC, com incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC. A presença de gás nos tubos de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC contém uma mistura de fosfatos que lhe confere poder tamponante, impedindo a acidificação. A seletividade do meio se deve à presença de sais biliares, responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos e pela temperatura de incubação. ANA LISE Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra do alimento e adicionar 225 mL de água peptonada a 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. Preparar diluições subsequentes através da transferência de 1 mL para tubos contendo 1 mL do mesmo diluente. A partir de cada diluição, inocular alíquotas de 1 mL em série de 3 tubos contendo caldo lauril. Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas. Os tubos positivos são evidenciados pela presença no mínimo 1/10 de gás do volume total do tubo de Duhran ou efervescência quando agitado gentilmente. Os tubos positivos devem ser confirmados quanto a presença de coliformes fecais ou totais quando for o caso. CURIOSIDADE!!! O grupo dos coliformes totais são denominados como indicadores higiênico. O grupo dos coliformes fecais são denominados como indicadores higiênico-sanitário. Há também os microrganismos indexadores, estes são microrganismos não patogênicos que evidenciam diretamente a possibilidade da presença de um patógeno específico, como Escherichia coli indexa a presença de Salmonella spp. COLIFORMES FECAIS Transferir com auxílio de alça microbiológica uma alçada do tubo positivo da fase presuntiva para tubo contendo caldo EC. Incubar os tubos a 45 ± 0,2°C, por 24 a 48 horas em banho maria com agitação. A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. COLIFORMES TOTAIS Transferir com auxílio de alça microbiológica uma alçada do tubo positivo da fase presuntiva para tubo contendo caldo verde brilhante. Incubar os tubos a 36°C, por 24 a 48 horas em estufa. A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado gentilmente. Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. Na Figura 1 está apresentado o esquema de inoculação de coliformes totais e fecais. CURIOSIDADE!!! Há algumas diferenças na nomenclatura que podem gerar confusão. Há diferentes nomes para referenciar ao mesmo grupo de microrganismo, por exemplo: coliformes totais e coliformes a 35°C significam a mesma coisa. Da mesma forma, coliformes fecais coliformes termotolerantes e coliformes a 45°C. EXPRESSA O DOS RESULTADOS Os resultados devem ser calculados com auxílio de uma tabela estatística de número mais provável por g ou mL (NMP/g ou mL). Deve-se atentar que a as diluições dos inóculos estão equivalentes às diluições da tabela utilizada. 0.1g 0.01g 0.001g NMP/g ou mL Intervalo de Confiança (95%) 0 0 0 <3.00.15 9.5 0 0 1 3.0 0.15 9.6 0 1 0 3.0 0.15 11 0 1 1 6.1 1.2 18 0 2 0 6.2 1.2 18 0 3 0 9.4 3.6 38 1 0 0 3.6 0.17 18 1 0 1 7.2 1.3 18 1 0 2 11 3.6 38 1 1 0 7.4 1.3 20 1 1 1 11 3.6 38 1 2 0 11 3.6 42 1 2 1 15 4.5 42 1 3 0 16 4.5 42 2 0 0 9.2 1.4 38 2 0 1 14 3.6 42 2 0 2 20 4.5 42 2 1 0 15 3.7 42 2 1 1 20 4.5 42 2 1 2 27 8.7 94 2 2 0 21 4.5 42 2 2 1 28 8.7 94 2 2 2 35 8.7 94 2 3 0 29 8.7 94 2 3 1 36 8.7 94 3 0 0 23 4.6 94 3 0 1 38 8.7 94 3 0 2 64 17 180 3 1 0 43 9 180 3 2 0 93 18 420 3 2 1 150 37 420 3 2 2 210 40 430 3 2 3 290 90 1000 3 3 0 240 42 1000 3 3 1 460 90 2000 3 3 2 1100 180 4100 3 3 3 >1100 420 -- EXEMPLOS 1 – Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos 10-1 + + + 10-2 + + 10-3 + 2 – Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos 10-1 + + + 10-2 + + + 10-3 + + + 10-4 + + 3 – Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos 10-1 - - - 10-2 - - - 10-3 - - - 4 – Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos 10-0 - - - 10-1 - - - 10-2 - - - 5 – Combinação de resultados Diluição utilizada Tubos positivos 10-1 - - - 10-2 - - - 10-3 - - - Combinação de tubos positivos 3 2 1 Pela Tabela NMP/g = 150 NMP/g Combinação de tubos positivos 3 3 3 2 Pela Tabela NMP/g = 11 000 NMP/g Combinação de tubos positivos 0 0 0 Pela Tabela NMP/g = <3,0 NMP/g Combinação de tubos positivos 0 0 0 Pela Tabela NMP/g = <0,3 NMP/g Combinação de tubos positivos 3 3 3 Pela Tabela NMP/g = >1100 NMP/g BIBLIOGRAFIA BAM - BACTERIOLOGICAL ANALYTICAL MANUAL On Line . 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