apostila microbiologia de alimentos coliformes

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André Fioravante Guerra 
1ª Edição 
Valença – RJ, 2014 
 
 
MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS 
Análise de coliformes 
GRUPO COLIFORME 
 A presença das bactérias deste grupo nos alimentos 
fornece evidência indireta sobre a qualidade da matéria 
prima, condições de processamento, condições do 
armazenamento e transporte ao qual este alimento foi 
submetido. Portanto, são análises que evidenciam 
indiretamente: 
Condições higiênicas – o grupo responsável por indicar 
indiretamente as condições higiênicas ao qual o alimento foi 
submetido durante toda cadeia produtiva é o grupo dos 
coliformes totais, que incluem: Escherichia coli, Citrobacter, 
Enterobacter e Klebsiella. 
Condições higiênicas sanitárias – além de evidências 
indiretas sobre higiene, também há evidências da 
possibilidade da veiculação de microrganismos patogênicos 
pelos alimentos. O grupo responsável por indicar 
indiretamente as condições higiênicas sanitárias é o grupo 
dos coliformes fecais. 
 Atualmente, na RDC n°12/2001 está descrito os 
padrões microbiológicos dos alimentos no Brasil. Em quase 
todos alimentos são exigidos limites para coliformes a 45°C, 
mas somente em alguns exige-se padrões para coliformes a 
35°C. Acredita-se que dentro dos limites propostos pela 
legislação, há certa segurança sobre a presença de 
patogênicos. 
 Atualmente sabe-se que alguns sorovares de 
Escherichia coli (coliformes fecais) são patogênicos, assim 
como algumas Enterobacter (coliformes totais). Sabe-se que 
alguns sorovares de Escherichia coli, mesmo que em doses 
baixíssimas, podem causar doenças de origem alimentar. 
Este risco é assumido quando se analisa a presença do grupo 
coliformes dentro dos limites exigido pela RDC n° 12/2001. 
 
 
 
Introdução 
Os coliformes totais são 
bactérias anaeróbicas 
facultativas, Gram negativas, 
não formadoras de esporos, 
com capacidade de fermentar 
a lactose com produção de 
ácido e gás a 32-35 ºC em 
um intervalo de 48 horas. As 
bactérias presentes neste 
grupo são: Escherichia coli, 
Citrobacter, Enterobacter e 
klebsiella. Os coliformes 
fecais são bactérias em 
forma de bastonetes, Gram 
negativas, não esporuladas, 
anaeróbicas facultativas, 
capazes de fermentar a 
lactose com produção de 
ácido e gás a 44,5-45,5 ºC 
em um intervalo de 24 horas. 
Na maioria das vezes, a 
Escherichia coli é a bactéria 
representante deste grupo, 
porém sabe-se que algumas 
Enterobacter e Klebsiella 
também conseguem 
fermentar a lactose com 
produção de gás em 24 horas 
na temperatura de 44,5-45,5 
ºC (HAJDENWURCEL, 
2004). 
 
 
 
 
 
CURIOSIDADE!!! 
A legislação microbiológica 
brasileira vigente RDC n°12/2001 
exige padrões de coliformes totais 
apenas para um restrito grupo de 
alimentos. 
ANA LISE DE COLIFORMES FECAIS E 
TOTAIS EM ALIMENTOS 
 A análise de coliformes pode ser realizada basicamente de duas formas: 
contagem em placas ou técnica dos tubos múltiplos. Para cumprimento dos 
padrões exigidos pela RDC n°12/2001, nesta apostila será contemplado a 
contagem de coliformes pela técnica de tubos múltiplos. Esta análise é realizada 
em duas etapas: fase presuntiva e fase confirmativa. 
 
FASE PRESUNTIVA 
 
Baseia-se na inoculação da amostra em caldo lauril sulfato de sódio, em que 
a presença de coliformes é evidenciada pela formação de gás nos tubos de Durhan, 
produzido pela fermentação da lactose contida no meio. 
O caldo lauril sulfato de sódio contém uma mistura de fosfatos que lhe 
confere um poder tamponante, impedindo a acidificação. A seletividade do meio é 
devido à presença do lauril sulfato de sódio, um agente surfactante aniônico que 
atua na membrana citoplasmática de microrganismos Gram positivos, inibindo o 
seu crescimento. 
 
FASE CONFIRMATIVA 
 
coliformes totais – a confirmação da presença de coliformes totais é feita por meio 
da inoculação dos tubos positivos na prova presuntiva em caldo verde brilhante 
bile 2% lactose, e posterior incubação a 36 ± 1ºC. A presença de gás nos tubos de 
Durhan do caldo verde brilhante evidencia a fermentação da lactose presente no 
meio. O caldo verde brilhante bile 2% lactose contém bile bovina e um corante 
derivado do trifenilmetano (verde brilhante), responsáveis pela inibição dos 
microrganismos Gram positivos. 
Coliformes termotolerantes - a confirmação da presença de coliformes totais é 
feita por meio da inoculação dos tubos positivos na prova presuntiva em caldo EC, 
com incubação em temperatura seletiva de 45 ± 0,2ºC. A presença de gás nos tubos 
de Durhan evidencia a fermentação da lactose presente no meio. O caldo EC 
contém uma mistura de fosfatos que lhe confere poder tamponante, impedindo a 
acidificação. A seletividade do meio se deve à presença de sais biliares, 
responsáveis pela inibição dos microrganismos Gram positivos e pela temperatura 
de incubação. 
ANA LISE 
 
Pesar 25 ± 0,2 g ou pipetar 25 ± 0,2 mL da amostra do alimento e adicionar 
225 mL de água peptonada a 0,1%. Homogeneizar por aproximadamente 60 
segundos em “stomacher”. Esta é a diluição 10-1. Preparar diluições subsequentes 
através da transferência de 1 mL para tubos contendo 1 mL do mesmo diluente. 
A partir de cada diluição, inocular alíquotas de 1 mL em série de 3 tubos 
contendo caldo lauril. Incubar os tubos a 36 ± 1°C por 24 a 48 horas. Os tubos 
positivos são evidenciados pela presença no mínimo 1/10 de gás do volume total 
do tubo de Duhran ou efervescência quando agitado gentilmente. 
Os tubos positivos devem ser confirmados quanto a presença de coliformes 
fecais ou totais quando for o caso. 
 
 
 
 
 
 
CURIOSIDADE!!! 
O grupo dos coliformes totais são denominados como 
indicadores higiênico. 
O grupo dos coliformes fecais são denominados como 
indicadores higiênico-sanitário. 
Há também os microrganismos indexadores, estes são 
microrganismos não patogênicos que evidenciam 
diretamente a possibilidade da presença de um 
patógeno específico, como Escherichia coli indexa a 
presença de Salmonella spp. 
 
COLIFORMES FECAIS 
 
Transferir com auxílio de alça microbiológica uma alçada do tubo positivo 
da fase presuntiva para tubo contendo caldo EC. Incubar os tubos a 45 ± 0,2°C, por 
24 a 48 horas em banho maria com agitação. 
A presença de coliformes termotolerantes é confirmada pela formação de 
gás (mínimo 1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando 
agitado gentilmente. 
Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. 
 
COLIFORMES TOTAIS 
 
Transferir com auxílio de alça microbiológica uma alçada do tubo positivo 
da fase presuntiva para tubo contendo caldo verde brilhante. Incubar os tubos a 
36°C, por 24 a 48 horas em estufa. 
A presença de coliformes totais é confirmada pela formação de gás (mínimo 
1/10 do volume total do tubo de Durhan) ou efervescência quando agitado 
gentilmente. 
Anotar o resultado obtido para cada tubo, bem como a diluição utilizada. 
Na Figura 1 está apresentado o esquema de inoculação de coliformes totais 
e fecais. 
 
CURIOSIDADE!!! 
Há algumas diferenças na nomenclatura que podem 
gerar confusão. Há diferentes nomes para referenciar 
ao mesmo grupo de microrganismo, por exemplo: 
coliformes totais e coliformes a 35°C significam a 
mesma coisa. Da mesma forma, coliformes fecais 
coliformes termotolerantes e coliformes a 45°C. 
 
EXPRESSA O DOS RESULTADOS 
 Os resultados devem ser calculados com auxílio de uma tabela estatística de 
número mais provável por g ou mL (NMP/g ou mL). Deve-se atentar que a as 
diluições dos inóculos estão equivalentes às diluições da tabela utilizada. 
0.1g 0.01g 0.001g 
NMP/g ou 
mL 
Intervalo de Confiança 
(95%) 
0 0 0 <3.00.15 9.5 
0 0 1 3.0 0.15 9.6 
0 1 0 3.0 0.15 11 
0 1 1 6.1 1.2 18 
0 2 0 6.2 1.2 18 
0 3 0 9.4 3.6 38 
1 0 0 3.6 0.17 18 
1 0 1 7.2 1.3 18 
1 0 2 11 3.6 38 
1 1 0 7.4 1.3 20 
1 1 1 11 3.6 38 
1 2 0 11 3.6 42 
1 2 1 15 4.5 42 
1 3 0 16 4.5 42 
2 0 0 9.2 1.4 38 
2 0 1 14 3.6 42 
2 0 2 20 4.5 42 
2 1 0 15 3.7 42 
2 1 1 20 4.5 42 
2 1 2 27 8.7 94 
2 2 0 21 4.5 42 
2 2 1 28 8.7 94 
2 2 2 35 8.7 94 
2 3 0 29 8.7 94 
2 3 1 36 8.7 94 
3 0 0 23 4.6 94 
3 0 1 38 8.7 94 
3 0 2 64 17 180 
3 1 0 43 9 180 
3 2 0 93 18 420 
3 2 1 150 37 420 
3 2 2 210 40 430 
3 2 3 290 90 1000 
3 3 0 240 42 1000 
3 3 1 460 90 2000 
3 3 2 1100 180 4100 
3 3 3 >1100 420 -- 
EXEMPLOS 
1 – Combinação de resultados 
Diluição 
utilizada 
Tubos 
positivos 
 10-1 + + + 
10-2 + + 
10-3 + 
 
2 – Combinação de resultados 
Diluição 
utilizada 
Tubos 
positivos 
 10-1 + + + 
10-2 + + + 
10-3 + + + 
10-4 + + 
 
3 – Combinação de resultados 
Diluição 
utilizada 
Tubos 
positivos 
 10-1 - - - 
10-2 - - - 
10-3 - - - 
 
4 – Combinação de resultados 
Diluição 
utilizada 
Tubos 
positivos 
 10-0 - - - 
10-1 - - - 
10-2 - - - 
 
5 – Combinação de resultados 
Diluição 
utilizada 
Tubos 
positivos 
 10-1 - - - 
10-2 - - - 
10-3 - - - 
 
Combinação de tubos positivos 
3 2 1 
Pela Tabela NMP/g = 150 NMP/g 
Combinação de tubos positivos 
3 3 3 2 
Pela Tabela NMP/g = 11 000 NMP/g 
Combinação de tubos positivos 
0 0 0 
Pela Tabela NMP/g = <3,0 NMP/g 
Combinação de tubos positivos 
0 0 0 
Pela Tabela NMP/g = <0,3 NMP/g 
Combinação de tubos positivos 
3 3 3 
Pela Tabela NMP/g = >1100 NMP/g 
 
BIBLIOGRAFIA 
 
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Administration. Department of Health and Human Services, 2001. 
 
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2003. Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para o 
Controle de produtos de Origem Animal e Água. 
 
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venda ou de alguma forma destinados ao consumo. Resolução RDC nº 12, de 2 de 
janeiro de 2001. 
 
DOWNES, F.P. & ITO, K. Compendium of Methods for the Microbiological 
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FRANCO, B. D. G. M. Microbiologia dos Alimentos. São Paulo: Ed. Atheneu, 2003. 
 
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JAY, J.M. Microbiologia de Alimentos. 6ª ed. Artmed Editora S.A. Porto Alegre, 2005, 
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ICMSF. Microorganismos de los alimentos. Metodos de isolamiento. 2º ed. 
Zaragoza: Ed. Acribia.1982. 
 
SBCTA / PROFIQUA. Amostragem por Atributos para Empresas de Alimentos. 
Manual – Série Qualidade. Sociedade Brasileira de Ciência e Tecnologia de 
Alimentos, Campinas, SP. 36 p., 1995.