Pratica 1 Caracterizacao de proteinas e ponto isoeletrico

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Universidade Federal do Ceará
Centro de Ciências Agrárias
Departamento de Tecnologia de Alimentos
Disciplina: Bioquímica de Alimentos
Professora: Luciana de Siqueira
Pratica 1
Caracterização de proteínas e determinação do ponto isoelétrico
INTRODUÇÃO
      As reações dos aminoácidos são aquelas de seus grupamentos funcionais, isto é, do grupo alfa-carboxílico, dogrupo alfa-amino e dos grupos presentes nas cadeias laterais. As reações das proteínas, por sua vez,dependem dos diferentes aminoácidos que as constituem. Sendo assim, podemos adotar a seguinte nomenclatura para essas reações envolvendo aminoácidos e proteínas:
      Reações Gerais: são as que estão relacionadas com os grupos -carboxílico e -amino. Portanto, são positivas para todo e qualquer aminoácido.
      Reações Específicas: são as que estão relacionadas com os grupos funcionais das cadeias laterais. Essas reações são, então, positivas unicamente na presença do grupo funcional que caracteriza o aminoácido.
PRINCIPIOS TEORICOS E PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
PARTE 1
Reações Gerais de aminoácidos e proteínas : Reação da ninidrina
Quando os aminoácidos são aquecidos em solução contendo excesso de ninidrina, todos aqueles que têm grupamento amino livre produzem um composto púrpura, conhecido como Púrpura de Rüehmann. Essa reação também pode ser utilizada na detecção de peptídios e proteínas que apresentem essa característica.
Em condições apropriadas, a intensidade da cor produzida é proporcional à concentração de espécies (aminoácidos, peptídeos ou proteínas) presentes.
      Observação: Existem dois aminoácidos que são exceções a essa reação: com a prolinae hidroxiprolina, que são iminoácidos, a ninidrina reage formando um composto amarelo.
Material
	     a) Reagentes e soluções
     - solução aquosa de ninidrina [C6H4COCO.C(OH)2]0,1% 
     - solução de ovoalbumina 2%
     - solução de glicina 0,1%
     - solução de prolina 0,2%
     - água destilada
     - solução de amostra desconhecida
	 
	b) Vidraria e equipamentos
          
- 05 tubos de ensaio
- pipetas de 2 mL (plásticas ou de vidro)
	 Procedimento Experimental
     1. Numerar os tubos de ensaio e preparar a seguinte bateria:
     (1) 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
     (2) 2 mL da solução de glicina 0,1%
     (3) 2 mL da solução de prolina 0,2%
     (4) 2 mL de água destilada
     (5) 2 mL de amostra
     2. A cada tubo de ensaio,adicionar 0,5ml da solução de ninidrina;
     3. aquecer em banho-maria até que seja desenvolvida coloração;
     4. observe e anote os resultados.
    
Análise do Resultado : O desenvolvimento de coloração púrpura indica presença de grupamentos amino, revelando a existência de aminoácidos, peptídeos ou proteínas na amostra.
PARTE 2
Reações Especificas : Reação do biureto
 Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da uréia, quando essa é submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180oC:
 Soluções alcalinas que contenham biureto desenvolvem uma coloração violeta, quando em presença de sulfato de cobre (CUSO4). Esse fenômeno deve-se à formação de um complexo entre o íon Cu2+ e os átomos de nitrogênio presentes na molécula do biureto. O esquema abaixo representa um modelo da formação desse complexo:
Se fizermos uma boa observação, veremos que as ligações existentes na molécula de biureto são muito parecidas com as ligações peptídicas estabelecidas entre os aminoácidos durante a formação de peptídeos e, finalmente, das proteínas.
Observe o esquema abaixo, que representa a interação entre as ligações peptídicas de uma proteína ou peptídeo com íons Cu2+:
 Assim, a reação de peptídeos e proteínas com o sulfato de cobre recebeu o nome de Teste do Biureto, e é utilizada para pesquisa de ligações peptídicas.
 
Material
 a) Reagentes e soluções
 - reagente de biureto *
 - solução de ovoalbumina 2%
 - solução de glicina 0,1%
 - solução de cistina 1%
 - água destilada
 - solução de amostra desconhecida
 	b) Vidraria e instrumental
 
- 05 tubos de ensaio
- pipetas de 2 mL (plásticas ou de vidro)
- conta-gotas ou pipeta Pasteur
 * Preparo do reagente de biureto: dissolva 1,5g de sulfato de cobre (CuSO4 . 5H2O) e 6,0g de tartarato duplo de sódio e potássio (KNaC4H4O6 . 4H2O) em 500 mL de água destilada. Adicione, sob agitação constante, 300 mL de solução de NaOH 10%. Adicione 1g de iodeto de potássio (KI). Complete o volume para 1L com água destilada e guarde o reagente em frasco âmbar. Esse reagente conserva-se por tempo indefinido.
 Procedimento Experimental
 1. Numerar os tubos de ensaio e preparar a seguinte bateria:
 (1) 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
 (2) 2 mL da solução de glicina 0,1%
 (3) 2 mL da solução de cistina 1%
 (4) 2 mL de água destilada
 (5) 2 mL de amostra
 2. A cada tubo de ensaio adicione,gota a gota, o reagente de biureto;
 3. agite os tubos;
 4. observe e anote os resultados.
Análise do Resultado : O aparecimento de coloração violeta indica que os íons Cu2+ provenientes do CuSO4 formaram complexo com ligações peptídicas presentes na amostra, indica que se trata de uma proteína ou peptídeo.
 PARTE 3
Reações para aminoácidos sulfurados
 O enxofre está presente como constituinte de aminoácidos como cistina, cisteína (que é, na verdade, um duplo aminoácido) e metionina. Comparativamente, o enxofre da metionina apresenta-se mais estável do que nas moléculas de cistina ou cisteína. Por esse motivo, nem todas as reações de detecção de enxofre são aplicáveis a todos esses aminoácidos.
 a) Reação do acetato de chumbo em meio alcalino
 O enxofre, presente em moléculas de alguns aminoácidos, é convertido a sulfeto por ação de bases e do calor. Esse, por sua vez, pode ser detectado com a adição de um sal de chumbo: forma-se sulfeto de chumbo, composto de coloração escura.
 Material
 a) Reagentes e soluções
 - solução de hidróxido de sódio (NaOH) 40%
 - solução de acetato de chumbo [Pb(C2H3O2)2.3(H2O)] 10%
 - solução de ovoalbumina 2%
 - solução de tirosina 1% 
 - solução de cisteína 1%
 - solução de cistina 1%
 - água destilada
 - solução de amostra desconhecida
 
 	
b) Vidraria e instrumental
 
- 6 tubos de ensaio
- pipetas de 5 mL plásticas ou de vidro
- conta-gotas
 Procedimento Experimental
 1. Numerar os tubos de ensaio e preparar a seguinte bateria:
 (1) 2 mL da solução de ovoalbumina 2%
 (2) 2 mL da solução de tirosina 1%
 (3) 2 mL da solução de cisteína 1%
 (4) 2 mL da solução de cistina 1%
 (5) 2 mL de água destilada
 (6) 2 mL de amostra
 2. A cada tubo de ensaio,adicionar 3 mL da solução de NaOH 40%;
 3. junte 5 gotas da solução de acetato de chumbo;
 4. ferva por 6 minutos em banho-maria;
 5. observe e anote os resultados.
PARTE 4
Determinação do ponto isoeletrico da caseína
INTRODUÇÃO
          Os aminoácidos apresentam dois grupos que são passíveis de sofrer protonação (adição de H) e desprotonação (retirada de H). Observe:
	
          A figura demonstra as etapas de ionização em que podem ser encontrados os aminoácidos:
          1. Forma positivamente carregada.
          2. Forma eletricamente neutra. Note que existe uma densidade de carga negativa e uma densidade de carga positiva sobre a molécula, conferindo carga total nula. Essa forma também é denominada isoelétrica ouzwitteriônica.
         3. Forma negativamente carregada
          Essas formas são encontradas em maior ou menor quantidade dependendo do pH em que a solução do aminoácido se encontra. Isso porque quanto menor o valor de pH, maior a concentração de íons H+ em solução e, conseqüentemente, maior a prevalência da forma positivamente carregada (1). Em contrapartida, quanto maior o valor de pH, menor a quantidade de íonsH+ em solução, havendo prevalência da forma negativamente carregada(3). A forma eletricamente neutra (2) só poderá existir, então, numa condição de pH intermediária à existência predominante da forma positiva e negativa do aminoácido. Esses valores de pH podem ser facilmente determinados experimentalmente e também podem ser estendidos às proteínas, ou seja: as proteínas também apresentam uma distribuição de cargas, que pode ser alterada em função do pH.
O ponto onde a carga líquida total da molécula de aminoácido ou proteína é nula é tão importante, que recebeu uma denominação especial. Assim, o valor de pH onde existe equivalência entre as cargas positivas e negativas da molécula é denominado PONTO ISOELÉTRICO.
          A solubilidade das proteínas, como veremos mais adiante, depende de vários fatores. Dentre eles, destaca-se a presença das cargas elétricas ao longo da molécula. A existência de uma carga positiva ou negativa determina a interação com o meio aquoso, além de estabelecer um estado de repulsão entre as próprias moléculas de proteína, aumentando a interação com o solvente e, conseqüentemente, favorecendo_a_solubilidade. 
 	Com vimos, no ponto isoelétrico existe um equilíbrio entre o número de cargas positivas e negativas, o que gera uma situação em que as forças de repulsão entre as moléculas de proteína e as forças de interação com o solvente são mínimas. Assim, as proteínas vão formando aglomerados que, cada vez maiores, tendem a precipitar. 
É importante destacar que essa diminuição de solubilidade varia de proteína para proteína.
Procedimento experimental 
          A parte experimental está dividida em três momentos, a saber:
          3.1. extração da caseína do leite
          3.2. preparo de uma solução de caseína
          3.3. determinação do ponto isoelétrico da caseína
  Extração da caseína do leite
   Material
	        a) Reagentes e soluções
        - leite
        - solução de ácido acético (CH3COOH) 2M
        - etanol (CH3CH2OH) 95% (v/v)
        - éter etílico (CH3CH2OCH3CH2)
	 
	b) Vidraria e instrumental
          
- béquer de 250 mL
- proveta de 100 mL
- conta-gotas
- funil e papel de filtro
	Procedimento Experimental
	
          1. Aquecer 150ml de água destilada a 38oC;
          2. adicionar 50 ml de leite e misturar bem;
          3. à solução acima, gotejar a solução de ácido acético, até o aparecimento de um precipitado abundante          (aproximadamente 0,7ml do ácido);
          4. deixar descansando durante, aproximadamente, 20 minutos para sedimentação da proteína;
          5. separar o sobrenadante por decantação;
          6. ao precipitado, adicionar 20ml de etanol e misturar bem;
          7. filtrar (ou, se possível, centrifugar) e desprezar o filtrado (só interessa o precipitado);
          8. adicionar, ao precipitado, 5ml de éter etílico e misturar;
          9. decantar o sobrenadante e secar o precipitado (caseína) em papel de filtro.