VALIDAÇÃO DE MÉTODOS ANALÍTICOS

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VALIDAÇÃO DE MÉTODOS
ANALÍTICOS
MOSTRAR A IMPORTÂNCIA DO EMPREGO DE MÉTODOS ANALÍTICOS VALIDADOS PELOS
LABORATÓRIOS DE CONTROLE DE QUALIDADE PELAS INDÚSTRIAS FARMACÊUTICAS E DESCREVER OS
PROCEDIMENTOS PARA A DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS DE DESEMPENHO ANALÍTICO.
AUTOR(A): PROF. CARLA TOSCANO DE OLIVEIRA SIMOES
DEFINIçãO
A validação de método analítico é o ato documentado pelo qual é determinado, através de estudos
de laboratório, os parâmetros de desempenho analítico do método que devem atender as exigências
desejadas garantindo sua eficiência, deve garantir que o método atenda às exigências das
aplicações analíticas assegurando a confiabilidade dos resultados.
Os parâmetros de desempenho analítico que deverão ser determinados são exatidão, precisão,
especificidade e seletividade, limite de detecção (sensibilidade), limite de quantificação, linearidade e
intervalo e robustez.
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De acordo com a RE nº 899, de 29 de maio de 2003, o objetivo de uma validação é demonstrar que o método
é apropriado para a finalidade pretendida, ou seja, a determinação qualitativa, semi-quantitativa e /ou
quantitativa de fármacos e outras substâncias em produtos farmacêuticos.
Importância da validação da metodologia:
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Garantir que os resultados obtidos reflitam a operação dos procedimentos analíticos.
Fornecer informações confiáveis.
Assegurar uniformidade, reprodutibilidade e qualidade do método.
Reduzir a incidência de desvios do método.
Diminuir a perda financeira.
Indicar qualidade uma vez que faz parte integral do Controle de Qualidade.
É documentação exigida pela legislação e necessária para comprovação de que o método é adequado e
apto para o uso desejado.
A metodologia analítica descrita em farmacopéias ou formulários oficiais, devidamente reconhecidos pela
ANVISA (Agência Nacional de Vigilância Sanitária), é considerada validada, porém, no caso, de metodologia
analítica não descrita nesses compêndios oficiais, só será considerada validada desde que sejam avaliados
os parâmetros de desempenho analítico do método em questão.
Para a garantia da qualidade analítica dos resultados todos os equipamentos utilizados na validação devem
estar devidamente calibrados e os analistas devem ser qualificados e adequadamente treinados.
Uma metodologia analítica deve ser revalidada quando houver:
Mudanças na síntese da substância ativa.
Mudanças na composição do produto acabado.
Mudanças no procedimento analítico.
De acordo com a farmacopéia os testes ou métodos são classificados em quatro categorias diferentes:
Categoria I: métodos destinados à determinação quantitativa de substâncias tais como princípios ativos e
excipientes de medicamentos, assim como também de conservantes empregados nestas preparações.
Categoria II: métodos destinados à determinação de impurezas ou produtos de decomposição em geral.
Compreendem dois tipos de métodos: os ensaios quantitativos e os ensaios limite.
Categoria III: métodos específicos para determinação do desempenho de propriedades características tais
como desintegração, dissolução, etc.
Categoria IV: testes de identificação.
E para cada categoria é exigida a determinação de um conjunto de parâmetros como mostra o quadro 1.
Quadro 1. Parâmetros exigidos em função de cada categoria.
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    CATEGORIA II CATEGORIA II    
PARÂMETROS CATEGORIA
I
ENSAIOS
QUANTITATIVOS
ENSAIOS
LIMITE
CATEGORIA
III
CATEGORIA
IV
Exatidão Sim Sim * * Não
Precisão Sim Sim Não Sim Não
Especificidade Sim Sim Sim * Sim
Limite de detecção Não Não Sim * Não
Limite de
quantificação
Não Sim Não * Não
Linearidade Sim Sim Não * Não
Intervalo Sim Sim * * Não
Robustez Sim Sim Sim Não Não
* pode ser necessário dependendo da natureza do teste específico.
 
                                                                                                     PARÂMETROS DE DESEMPENHO ANALÍTICO
                                                                                                                                EXATIDÃO
DEFINIçãO
Grau de concordância entre os resultados encontrados pelo método e o valor verdadeiro.
A determinação da exatidão é realizada através de várias metodologias.
A determinação para análise de fármacos consiste em aplicar o método em amostras de pureza conhecida
(padrão de referência) e comparam-se os resultados do método em questão com os de um segundo método
bem caracterizado já validado, ou seja, que tenha sua exatidão conhecida.
A determinação para análise de uma forma farmacêutica consiste na análise de uma amostra na qual uma
quantidade conhecida de fármaco foi adicionada a uma mistura dos componentes do medicamento (placebo
contaminado). Para os casos em que amostras de todos os componentes do medicamento estão
indisponíveis aceita-se a análise pelo método de adição de padrão no qual adiciona-se quantidades
conhecidas de padrão de referência ao medicamento.
A determinação para análise de impurezas consiste na adição do padrão no qual adiciona-se quantidades
conhecidas de impurezas e/ou produtos de degradação ao medicamento ou ao fármaco.
A exatidão do método deve ser determinado após o estabelecimento da linearidade, do intervalo linear e da
especificadade do mesmo.
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E ã A idã é l l d d ã (R%) d id d h id d
                                                                                     onde:
                                                                                     CF= concentração da amostra adicionada
                                                                                     CNF = concentração da amostra não adicionada
                                                                                     CA = concentração de analito adicionado
Alíquotas: recomenda-se no mínimo 3 concentrações e 3 replicatas de cada perfazendo 9 determinações no
mínimo.
                                                                                                          PRECISÃO
DEFINIçãO
É o grau de concordância entre os resultados individuais quando a técnica é aplicada em diversas
alíquotas de uma mesma amostra homogênea em idênticas condições de testes. A precisão é
considerada em três níveis: repetibilidade, precisão intermediária e reprodutibilidade.
A determinação da repetibilidade (precisão intra-corrida) que é a concordância entre os resultados dentro
de um curto período de tempo se faz com o mesmo analista e mesma instrumentação.
A determinação da   precisão intermediária (inter-corridas) que é a concordância entre os resultados do
mesmo laboratório se faz em dias diferentes com analistas diferentes e/ou equipamentos diferentes. Para a
determinação da precisão intermediária recomenda-se um mínimo de 2 dias diferentes com analistas
diferentes.
A determinação da reprodutibilidade (precisão inter-laboratorial) que é a concordância entre resultados
obtidos se faz por laboratórios diferentes como em estudos colaborativos, geralmente aplicados à
padronização de metodologia analítica, por exemplo, para inclusão de metodologia em farmacopéias. Estes
dados não precisam ser apresentados para a concessão de registro.
Expressão: a precisão de um método analítico pode ser expressa como desvio padrão ou desvio padrão
relativo (coeficiente de variação).
                                                                                        DPR =  DP x 100
                                                                                                  CMD
                                                                                         onde:
                                                                                         DPR = desvio padrão relativoDP = desvio padrão
                                                                                         CMD = concentração média determinada
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O valor máximo aceitável deve ser definido de acordo com a metodologia empregada, a concentração do
analito, o tipo de matriz e a finalidade do método, não é admitido valores superiores a 5%.
Alíquotas: : a precisão é verificada por, no mínimo, 9 (nove) determinações contemplando o intervalo linear
do método, ou seja, 3 (três) concentrações com 3 (três) replicatas cada ou mínimo de 6 determinações de
100% da concentração do teste.
Legenda: ESTA FIGURA INDICA PRECISãO E EXATIDãO
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Legenda: ESTA FIGURA INDICA FALTA DE PRECISãO E FALTA DE EXATIDãO.
                                                                                            ESPECIFICIDADE E SELETIVIDADE
DEFINIçãO
A especificidade é a capacidade que um método tem de avaliar de forma inequívoca a substância em
exame na presença de componentes tais como impurezas, produtos de degradação e componentes
da matriz que poderiam interferir na sua determinação numa mistura. A seletividade é a capacidade
que um método tem de avaliar de forma inequívoca um pequeno grupo de substâncias na presença
de outras.
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A determinação é feita mostrando que o procedimento não é afetado pela presença de impurezas, produtos
de degradação e excipientes adicionando-os em níveis apropriados.
Para análise qualitativa (teste de identificação) é necessário demonstrar a capacidade de seleção do método
entre compostos com estruturas relacionadas que podem estar presentes. Isto deve ser confirmado pela
obtenção de resultados positivos (preferivelmente em relação ao material de referência conhecido) em
amostras contendo o fármaco, comparativamente com resultados negativos obtidos com amostras que não
contém o fármaco mas compostos estruturalmente semelhantes.
Para análise quantitativa (teor) e análise de impurezas a especificidade pode ser determinada pela
comparação dos resultados obtidos de amostras (fármaco ou medicamento) contaminadas com quantidades
apropriadas de impurezas ou excipientes e amostras não contaminadas para demonstrar que o resultado do
teste não é afetado por esses materiais. Quando a impureza ou o padrão do produto de degradação não
estiverem disponíveis pode-se comparar os resultados do teste das amostras contendo impurezas ou
produtos de degradação com os resultados de um segundo procedimento bem caracterizado (por exemplo
metodologia farmacopeica ou outro procedimento validado). Estas comparações devem incluir amostras
armazenadas sob condições de estresse (por ex. luz, calor, umidade, hidrólise alcalina/ácida, oxidação).
Expressão: é feita através da porcentagem de concordância (%C).
                                                                                                %C = TP x 100
                                                                                                         TA
                                                                                                  onde:
                                                                                                 TP = teor do padrão
                                                                                                 TA = teor da amostra
Legenda: ESPECIFICIDADE
                                                                                                                  LIMITE DE DETECÇÃO
DEFINIçãO
É a menor quantidade da substância em exame presente em uma amostra que pode ser detectada,
porém não necessariamente quantificada, dentro de um limite de confiabilidade, sob as condições
experimentais estabelecidas.
A determinação é feita através da análise de soluções de concentrações decrescentes conhecidas do analito
até nível mínimo o qual é possível a detecção.
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No caso de métodos não instrumentais (CCD, titulação) esta determinação pode ser feita visualmente onde
o limite de detecção é o menor valor de concentração capaz de produzir o efeito esperado (mudança de cor,
turvação etc).
No caso de métodos instrumentais (CLAE, CG, absorção atômica) será determinado pela inclinação da curva
de calibração e do desvio padrão.
Expressão: a expressão do Limite de Detecção (LD) se faz através da construção de uma curva de calibração
calculando o desvio padrão e a inclinaçao da curva.
                                                      LD =            desvio padrão x 3
                                                              Inclinação da curva de calibração
Deverão ser construídas 3 curvas de calibração.
                                                                                LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO
DEFINIçãO
É a menor concentração da substância em exame presente na amostra que pode ser quantificada
com precisão e exatidão aceitáveis sob as condições experimentais estabelecidas.
O limite de quantificação é um parâmetro determinado principalmente para ensaios quantitativos de
impurezas, produtos de degradação em fármacos ou em formas farmacêuticas.
A determinação do limite de quantificação se faz através da análise de soluções de concentrações
decrescentes do fármaco conhecidas até nível mínimo determinável com precisão e exatidão aceitáveis. É
determinado pela inclinação da curva de calibração e do desvio padrão.
Expressão:a expressão do Limite de Quantificação (LQ) se faz determinando o desvio padrão e construíndo
uma curva de calibração.
                                                            LQ =           desvio padrão x 10
                                                                    Inclinação da curva de calibração
Deverão ser construídas 3 curvas de calibração.
                                                                                         LINEARIDADE E INTERVALO
DEFINIçõES
Linearidade é a capacidade de um método de fornecer resultados diretamente proporcionais à
concentração da substância em exame dentro de uma determinada faixa de variação.
Intervalo é o intervalo entre o nível superior e o inferior de concentração dentro dos parâmetros de
exatidão, precisão e é derivado do estudo de linearidade.
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A linearidade é determinada pela construção da curva de calibração com no mínimo 5 concentrações.
Expressão: é feita através da construção de uma curva de calibração e, posteriormente, fazendo o cálculo do
coeficiente de correlação ( r ) da reta que deverá apresentar um valor mínimo de 0,99.
                                                                                                                       ROBUSTEZ
DEFINIçãO
É a medida da capacidade do método em não afetar-se por uma pequena e deliberada variação em
seus parâmetros analíticos, é um indicativo de confiabilidade durante seu uso.
Os principais fatores que devem ser considerados na determinação da robustez do método analítico são pH,
temperatura, composição da fase móvel, velocidade de fluxo etc.
ATIVIDADE FINAL
Validar um método analítico é, através de estudos de laboratório,
determinar os parâmetros de desempenho analítico do mesmo
garantindo assim a sua eficiência. Entende-se por exatidão e precisão
de um método, respectivamente:
A. Grau de concordância entre os resultados encontrados pelo método e um valor aceito como real e
grau de concordância entre os resultados individuais quando a técnica é aplicada em diversas
alíquotas de uma mesma amostra homogênea em idênticas condições de testes. 
B. Grau de concordância entre os resultados individuais quando a técnica é aplicada em diversas
alíquotas de uma mesma amostra homogênea em idênticas condições de testes e grau de
concordância entre os resultados encontrados pelo método e um valor aceito como referência.
C. Grau de concordância entre os resultadosindividuais quando a técnica é aplicada em diversas
alíquotas de uma mesma amostra homogênea em idênticas condições de testes e grau de
concordância entre os resultados encontrados pelo método e um valor aceito como real.
D. Mais de uma alternativa está correta.
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REFERÊNCIA
ANVISA. Farmacopéia Brasileira. 5ed. Rio de Janeiro: Editora Fiocruz. 2010.
 
ANVISA. RE n 899, de 29 de maio de 2003. Determina a publicação do Guia para validação de métodos
analíticos e bioanalíticos. Publicado no Diário Oficial da União em 02 de junho de 2003.
 
GIL, E.S. Controle Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos. 3ed. São Paulo: Pharmabooks. 2010
 
LEITE, F. Validação em Análise Química. 5ed. Campinas: Editora Átomo. 2008.
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