Aula 9 - Proteínas

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Métodos não instrumentais e 
instrumentais de análise de proteínas dos 
alimentos
Bromatologia
Prof. Dr.ª Janaina Vieira
Definição de proteínas
• Quimicamente são definidas polímeros de alto peso molecular,
cujas unidades básicas são os aminoácidos ligados entre si por
ligações peptídicas;
• Formam longas cadeias, em várias estruturas geométricas e
combinações químicas para formar as proteínas especificas, cada
qual com sua própria especificidade fisiológica;
• As proteínas são consideradas um dos maiores constituintes da
célula viva.
Carbono
Hidrogênio
Oxigênio
Nitrogênio
Enxofre
Características gerais e definições
• Por hidrólise total, as cadeias peptídicas dão origem aos
aminoácidos (aa) livres -> unidades estruturais básicas ;
• Na natureza existem apenas 20 aminoácidos encontrados com
frequência;
• Os aminoácidos são sólidos incolores, cristalinos, que fundem
com decomposição a altas temperaturas.
Aminoácidos
• Cadeia lateral R 
influencia as 
propriedades
físico-químicas!
Aminoácidos
Peptídeos
Oligopeptídeos
Polipeptídeos
Condensação de menor número de aa forma 
compostos de baixo peso molecular
Composto formado por menos de 10 
unidades de aa
Composto formado por mais de 10 unidades
de aa
 Estrutura primária
 Não leva em consideração outros tipos de ligações como forças de 
Van der Waals ou ligações de hidrogênio;
 É a única que pode ser determinada por meio de reações químicas.
Estrutura das proteínas
 Estrutura secundária
 As cadeias peptídicas não são esticadas, mas torcidas, dobradas ou 
enroladas sobre si mesmas;
 Encontram-se nas conformações α-hélice ou folha pregueada.
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 Estrutura terciária
 Se refere a posteriores dobras e enrolamentos que as cadeias 
peptídicas sofrem, resultando em uma estrutura complexa e mais 
compacta para as proteínas.
 Estrutura quaternária
 Uma proteína natural é formada por duas ou mais cadeias 
peptídicas associadas.
Classificação das proteínas
• Proteínas simples
– São as substâncias das quais por hidrólise total resultam 
aminoácidos como os únicos produtos.
• Proteínas conjugadas
– São moléculas mais complexas, nas quais as proteínas se 
encontram combinadas com substâncias de caráter não-
protéico, formando complexos mais ou menos estáveis.
• Proteínas derivadas
– São compostos não encontrados na natureza, mas obtidos por 
degradação mais ou menos intensa (proteólise) de proteínas 
simples ou conjugadas pela ação de ácidos, bases ou enzimas.
Proteínas em alimentos
• Proteínas da carne
– Miosina
– Actina
– Colágeno
– Tripsina
• Proteínas do leite
– Caseína
– Lactoalbumina
– Lactoglobulina
• Proteínas do ovo
– Ovoalbuina
– Canalbumina
– Glicoproteína
– Avidina
– Lipovitelina
– Fosfovitina
– Livitina
Nitrogênio X Proteínas
• A quantidade de N é importante pois a determinação de 
proteínas geralmente é realizada através da determinação de N
• São encontradas em quase todos os alimentos
– Origem animal
• São proteínas alto valor biológico, ou seja, são proteínas completas 
que apresentam os aminoácidos em teores necessários à 
manutenção da vida e crescimento dos novos tecidos
• Exemplos: miosina, caseína, ovoalbumina
– Origem vegetal
• São geralmente de baixo valor biológico ou parcialmente completas
• Exemplo: frutas, hortaliças e cereais (prolamina)
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Funções fisiológicas
• Regeneração de tecidos
• Catálise de reações (enzimas) 
• Imunodefesa
• Elemento estrutural (colágeno) 
• O homem necessita ingerir as proteínas na alimentação em 
qualidade e quantidades adequadas
– Função nutricional;
– Características sensoriais (textura);
– São macromoléculas de estrutura complexa, não 
apresentando sabor ou odor;
– A solubilidade da proteína vai depender do número de grupos 
hidrofóbicos e hidrofílicos e da distribuição desses grupos na 
molécula;
– Proteínas de origem animal são consideradas de maior valor 
biológico.
Proteínas
Simples
Conjugadas
Derivadas
Funções nos alimentos
Conceitos importantes para a análise de proteínas
• Apresentam cadeias compostas por até 20 diferentes 
aminoácidos, unidos por ligações peptídicas;
• Aminoácidos diferentes => proteínas diferentes;
• Proteínas possuem cargas elétricas que variam com o meio;
• Baseado no fato de as proteínas terem porcentagem de 
nitrogênio quase constante, em torno de 16%, o que se faz 
normalmente é determinar o nitrogênio e, por meio de um fator 
de conversão, transformar o resultado em proteína bruta;
• A degradação de proteínas leva à formação de polímeros 
menores e finalmente aos aminoácidos livres.
Métodos para a determinação do teor de proteínas
• Pelo teor de Nitrogênio
• Fundamenta-se na destruição completa da matéria orgânica 
por digestão com ácido sulfúrico, sendo o nitrogênio da 
amostra transformado em sulfato de amônio
• É realizado em 3 fases
• Digestão
• Destilação
• Titulação
• Conversão do N total para teor de proteínas
Método Kjeldahl
Métodos para a determinação do teor de proteínas
 Método de Kjeldhal (Johan Gustav Christoffer Thorsager Kjeldhal, 1883)
• Princípio: conversão de todo o nitrogênio do alimento em amônia.
• Procedimento:
(1) Digestão: PTNs + H2SO4 + calor + catalisadores  (NH4)2SO4
(2) Neutralização e destilação: (NH4)2SO4 + 2NaOH  2NH3
NH3 + H3BO3 (NH4)3BO3
(3) Titulação: (NH4)3BO3 + HCl H3BO3
• Cálculos:
(1) %N = (100 x mL de HCL x N HCl x 0,014)/Peso da amostra (g)
(2) % PTNs = % N x 6,25
• Digestão • Destilação
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Destilador de Kjeldahl
• Titulação
Amostra que saiu do 
destilador + ácido 
bórico + indicadores
HCl
• Conversão do N total Cálculo
1 Eq HCl ----------------- 1 Eq Nitrogênio
1N (1Eq/1000 mL) ------ 14 g Nitrogênio 
0,1N (1mL) ---------------- 0,0014g Nitrogênio
Proteína (%) = K x V x Fator
P
Onde:
K = Fc x 0,0014 x 100
Fc = fator de correção da solução de ácido 
P = massa da amostra em gramas
V = volume da solução de ácido gasto na titulação
Fator = fator de conversão de nitrogênio para proteína
Teor de proteínas e % de nitrogênio protéico de alguns alimentos
Alimento Proteína (%) Nitrogênio 
protéico (%) 
Fator para conversão 
(%) 
Maçã com casca 0,2 
Alface 1,0 
Batata 2,1 
Leite integral 3,3 15,7 6,38 
Arroz 7,1 19,34 5,17 
Ovo 12,5 16 6,25 
Farinha de trigo 13,7 18,76 5,33 
Frango 23,1 16 6,25 
Queijo Cheddar 36,2 15,7 6,38 
Soja 36,5 18,12 5,52 
 
 Método de Dumas (Jean Baptiste Dumas, 1881)
• Princípio: conversão de todo o nitrogênio do alimento em N2.
• Procedimento: a amostra é pesada e colocada em uma cápsula de cerâmica 
aonde sofre combustão (700 a 800ºC) e o volume de N2 liberado é quantificado 
posteriormente por cromatografia gasosa.
Aplicações dos métodos de Kjeldhal e de Dumas
Kjeldhal Dumas Comparação 
 Método oficial para 
todos os alimentos. 
 Requer produtos 
químicos perigosos. 
 Determinação em até 4 
h. 
 Método oficial. 
 Barato. 
 Relativamente simples. 
 Aplicável para todos 
os alimentos (oficial 
para cereais, carnes e 
alimentos p/ animais). 
 Não requer produtos 
químicos perigosos. 
 Determinação em 3 
min. 
 Até 150 análises em 
fluxo contínuo. 
 Os dois métodos 
determinam N total. 
 Dumas é mais caro. 
 Kjeldhal é mais lento. 
 
 
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Métodos pelas características de um grupo presente (AAs e ligações 
peptídicas)
• Métodos que utilizam cobre
 Método do biureto (Riegler, 1914)
• O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído 
de uma mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que 
estabiliza o cobre em solução;
• Dessa forma, substâncias que contém duas ou mais ligações peptídicas 
formam um complexo decor roxa com sais de cobre em soluções 
alcalinas.
Método do biureto – principais caraterísticas e aplicações
• Rápido;
• Utiliza reagentes de baixo custo;
• Por envolver uma reação com a ligação peptídica, envolve proteína e 
não nitrogênio total;
• Principal desvantagem: Não é considerado um método muito sensível;
• Está sujeito à interferência de substâncias que possam reagir com os 
íons cobre. 
• Procedimento: 
(1) o reagente de biureto (CuSO4 + NaKC4H4O6+ NaOH + água) é adicionado 
à solução de proteínas;
(2) A mistura é incubada a 37ºC/ 20 min;
(3) Mede-se a absorbância da solução em 540 nm;
(4) Faz-se uma curva de calibração utilizando BSA como padrão.
• Interpretação dos 
resultados:
 Método do ácido bicinconínico – BCA (Smith et al., 1985)
• Princípio: sob condições alcalinas, PTNs reduzem Cu+2 para Cu+1. O Cu+1
complexa com o reagente de BCA desenvolvendo uma cor roxa (Abs = 
562 nm);
 Método do ácido bicinconínico – BCA (Smith et al., 1985)
• Vantagens:
– Considerado um método simples, quanto ao preparo de reagentes;
– Sensível;
– Relativamente rápido
• Desvantagens:
– Dependência da temperatura de incubação;
– Variação da absorbância com o tempo.
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 Método do ácido bicinconínico – BCA (Smith et al., 1985)
• Procedimento:
(1) À solução contendo as PTNs adiciona-se o reagente de BCA (NaBCA 
+ NaOH + Na2CO3 + CuSO4, pH = 11,25);
(2) A amostra é incubada a 37 ºC ou 60 ºC / 30 min, ou a temp. 
ambiente / 2 h;
(3) Mede-se a absorbância da solução em 562 nm;
(4) Faz-se uma curva de calibração utilizando BSA como padrão.
• Reação e interpretação dos resultados:
 Método de Lowry (Lowry et al., 1951)
• O princípio do método baseia-se em uma mistura contendo molibdato, 
tungstato e ácido fosfórico, (reagente Folin-Ciocalteau), que sofre uma 
redução quando reage com proteínas, na presença do catalisador cobre (II), 
e produz um composto com absorção máxima em 750 nm;
• Etapas:
1ª etapa: reação do biureto (cobre complexa com as ligações peptídicas);
2ª etapa: tirosina e triptofano presentes nas proteínas reduzem o reagente 
de Folin-Ciocalteu (ácido fosfotungístico-fosfomolibídico) desenvolvendo 
uma cor azulada.
 Método de Lowry (Lowry et al., 1951)
• Procedimento: 
(1) À solução contendo as proteínas, adiciona-se o reagente de biureto e 
a mistura é incubada à temperatura ambiente;
(2) Adiciona-se o reagente de Folin-Ciocalteu. A mistura é novamente 
incubada para que ocorra a reação;
(3) Mede-se a absorbância da solução em 650 nm;
(4) Faz-se uma curva de calibração utilizando albumina de soro bovino 
(BSA) como padrão.
 Aplicações
 A principal vantagem do método de Lowry é sua alta sensibilidade;
 Desvantagens: 
 Está sujeito à interferentes
 Apresenta longo tempo de análise
• Interpretação dos resultados: Aplicações, vantagens e desvantagens dos métodos que utilizam 
cobre
Obs.: nenhum deles detecta nitrogênio não protéico.
Biureto Lowry BCA 
A: cereais, carnes, PTNs 
de soja (isolados protéi-
cos). 
V: simples, rápido, bara-
to; reage de forma semel-
hante com as PTNs. 
D: baixa sensibilidade, 
menos sensível que 
Lowry. 
A: utilizado em pesquisas. 
V: alta sensibilidade, rela-
tivamente simples. 
D: tem reação diferenciada 
para diferentes PTNs, a 
cor não é exatamente 
proporcional ao teor de 
PTNs, a amostra precisa 
ser purificada. 
A: utilizado em pesquisas. 
V: mais sensível que 
Lowry; mais fácil de ser 
conduzido, reagente mais 
estável que Lowry. 
D: tem reação diferenciada 
para diferentes PTNs, a cor 
não é exatamente propor-
cional ao teor de PTNs, a 
cor é pouco estável. 
 
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Métodos utilizando corantes ligantes
 Dye-binding (Fraenkel-Conrat, 1944).
• Princípio: alguns corantes orgânicos tem a capacidade de ligar-se aos 
resíduos básicos de aminoácidos (imidazol, guanidina, ε-amino grupo) e o 
grupo amino terminal das PTNs, promovendo a precipitação do complexo 
formado.
PTNs + corante em excesso  Complexo insolúvel + corante não ligado
(PTNs + corante)
• Procedimento:
(1) Um excesso de corante é adicionado à amostra;
(2) Após a reação, a amostra é centrifugada ou filtrada;
(3) A absorbância da solução é medida.
• Curva de calibração (Abs x corante não ligado):
• Aplicações: leite (método oficial), farinha de trigo, soja, produtos cárneos e 
produtos vegetais. Usado para estimar a lisina disponível em cereais.
• Vantagens: rápido (15 min); barato; boa exatidão; maior precisão que Kjeldhal; 
não utiliza reagentes perigosos; não quantifica nitrogênio não protéico.
• Desvantagens: Pouco sensível; as PTNs diferem no teor de AAs básicos; alguns 
constituintes como o amido, podem ligar-se ao corante.
Métodos utilizando corantes ligantes
 Bradford (Bradford, 1976).
• Técnica para determinação de proteínas totais que utiliza o corante de 
“Coomassie brilliant blue” (BG-250);
• É baseado na interação entre o corante BG-250 e macromoléculas de 
proteínas que contém aminoácidos de cadeias laterais básicas ou 
aromáticas. 
• No pH de reação, a interação entre a proteína de alto peso molecular e o 
corante BG-250 provoca o deslocamento do equilíbrio do corante para a 
forma aniônica (595 nm).
Métodos utilizando corantes ligantes
 Bradford (Bradford, 1976).
• Considerado mais rápido, preciso e está sujeito a menor número de 
interferentes que o método de Lowry ;
• Principal desvantagem: os resultados podem não ser tão reprodutíveis, 
dependendo da pureza do corante. 
Métodos por espectrofotometria ultravioleta
(Warburg e Christian, 1941)
• Princípio: a maioria das proteínas possui um máximo de absorção em 280 
nm (aminoácidos aromáticos tirosina, triptofano e fenilalanina).
• Procedimento:
(1) A proteína é solubilizada em um tampão;
(2) A absorbância é obtida 
em 280 nm.
Métodos por espectrofotometria ultravioleta
(Warburg e Christian, 1941)
• Aplicações: em leite e produtos cárneos.
• Vantagens: altamente sensível (0,06 a 2,0 g de proteína); rápido; não 
destrutivo.
• Desvantagens: os tipos e o conteúdo de aminoácidos diferem entre as 
proteínas; somente aplicado em soluções de proteínas, sujeito a muitos 
interferentes.
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Métodos por espectrofotometria ultravioleta
(Zaia, 1993)
• Metodologia básica utilizando p-benzoquinona (PBQ), para a determinação 
de proteínas em diversos meios;
• O método se baseia no fato de que o produto de reação entre PBQ e 
proteínas absorve em 350 nm;
• Vantagens:
– 10x mais sensível que o método do biureto;
– Menor custo que o método de Lowry;
– Mais rápida que Lowry e Kjedahl;
– Determina simultaneamente proteínas e aminoácidos.
Métodos por espectrofotometria ultravioleta
(Krystal, 1985)
• Método baseado no fato de que prata amoniacal liga-se a proteínas e o 
produto de reação absorve fortemente em 420 nm;
• 100x mais sensível que o método de Bradford;.
(Stoscheck, 1987)
• Método onde o ouro coloidal, na presença de proteínas, desloca o seu 
máximo de absorção de 535 para 595 nm;
• 50x mais sensível que o método de Lowry e sujeito a poucos interferentes.
• Desvantagens dos métodos de Krystal e Stoscheck: reagentes de alto custo!
Métodos turbidimétricos
 A medida é baseada na turbidez causada pela proteína precipitada por 
algum agente precipitante, como ácido tricloroacético, ferricianeto de 
potássio e ácido sulfosalisílico;
 As vantagens do método são:
 É rápido.
 Simples para amostras líquidas, onde a proteína está em solução.
 As desvantagens são:
 Não compensa ser utilizado para amostras sólidas, onde a proteína deve ser 
extraída para umasolução; 
 Os resultados variam com o tipo de proteína; 
 Pode haver precipitação de outras substâncias com as proteínas, causando 
interferência no método.
Métodos de separação, identificaçãoe quantificação de proteínas
 Separação por solubilidade das proteínas (precipitação 
isoelétrica)
 Separação por tamanho (cromatografia por exclusão)
 Consiste na passagem da proteína através de uma coluna (fase 
estacionária), que é desenhada para reter ou diminuir a velocidade 
da passagem da fase móvel, onde estão as proteínas;
 Baseia-se no tamanho, carga ou afinidade química da molécula.
 Separação por tamanho (cromatografia por exclusão)
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 Separação por adsorção (cromatografia líquida de alta eficiência 
- HPLC)
 Separação por tamanho e carga elétrica das proteínas 
(eletroforese)
 Técnica de separação de moléculas que envolve 
a migração de partículas em um gel 
(poliacrilamida ou agarose) durante a aplicação 
de uma diferença de potencial;
 Moléculas menores migram mais rapidamente 
que as maiores;
 Formação de bandas de proteínas;
 Proteínas detectadas com uso de corante (ex. 
azul de Comassie).
 Separação por tamanho e carga elétrica das proteínas 
(eletroforese)
Considerações finais
 Mediante a determinação de proteínas é possível avaliar 
características nutricionais e tecnológicas nos alimentos analisados. 
 Os métodos de determinação de proteínas estão baseados 
principalmente no que diz respeito determinação de nitrogênio.
 Dependendo do método e dos procedimentos aplicados as 
determinações poderão ser quantitativas ou qualitativas. 
 Diversos fatores devem ser analisados antes da escolha de um 
método para determinação de proteínas totais, sendo necessário o 
conhecimento da natureza dos constituintes da amostra e suas
concentrações aproximadas.
 Referências Bibliográficas
• ZAIA, D.A.M.;ZAIA, C.T.B.V.; LICHTIG, J. Determinação de proteínas 
totais via espectrofometria: vantagens e desvantagens dos métodos 
existentes. Química nova, v.21, n.6, p. 787-793, 1998.
• CECCHI Heloísa Máscia; Fundamentos teóricos e práticos em 
análise de alimentos. São Paulo; Editora Unicamp; 2007.
• INSTITUTO ADOLFO LUTZ. Normas analíticas, métodos químicos e 
físicos para análise de alimentos. São Paulo: IAL, 1985, v.1, 371p. 
• LEHNINGER, A.L. Lehninger: principles of biochemistry (Lehninger: 
princípios de bioquímica). 4ª Ed. São Paulo. SARVIER, 2006. 1202p.