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ANA PAULA KNUPP RODRIGUES MORAES RA: D447HH8 CAROLINE LOPES SANTOS RA: N190AJ5 ELISANGELA A. RODRIGUES DA SILVA RA: D447JJ9 FERNANDA P. A. KUSCHAUSKY RA: D3223H8 FERNANDA DE OLIVEIRA LIMA RA: N1910G3 GABRIELA DE SOUZA GALVÃO RA: N189010 ISABELA MARCELLY NOGUEIRA NEVES RA: C6447F4 JEFFERSON FERNANDO DIAS LEITE RA: D15HIB1 JÉSSICA OLIVEIRA DE PAULA RA: D262220 LILIAN PAULA COSTA NOVAES RA: N184BC5 FRAUDES EM ALIMENTOS: LEITE ADULTERANTES E MÉTODOS PARA DETECÇÃO Trabalho de Atividade Pratica Supervisionada com ênfase na disciplina de Bromatologia do 2° semestre do curso de graduação em Nutrição apresentado à Universidade Paulista - UNIP Orientador: Professor MSC Mário Carlos Barros Junior SÃO JOSE DOS CAMPOS 2017 RESUMO O leite é um dos alimentos mais completos da alimentação humana, possuindo vários nutrientes essenciais para o organismo, sendo a única forma de alimentação de recém nascidos até os seis meses de idade, mas mesmo após este período, o ser humano continua usando o leite como forma de alimento, agora se alimentando de leite de outras espécies, tais como o leite de vaca e o leite de cabra. Este alimento se caracteriza por possuir uma alta gama de nutrientes tais como proteínas, carboidratos, gorduras, vitaminas e minerais, e também possuir um alto teor de água. O leite apesar de ser muito consumido no Brasil, vem sofrendo grandes adulterações, principalmente pelos produtores, que para aumentar o lucro de suas vendas fraudam o leite com adições de substâncias tais como a água e o peróxido de hidrogênio(água oxigenada), e também por desrespeitarem o período de carência de antibióticos aplicados no gado leiteiro, causando alterações nutricionais no leite, podendo causar também reações alérgicas em consumidores por causa da ingestão dos antibióticos presentes no produto. Os produtos lácteos possuem um grande papel na alimentação brasileira, aparecendo em pirâmides e guias alimentares como um grupo de alimentos essenciais para o brasileiro. As fraudes neste alimento se caracterizam por tentarem aumentar o volume do produto ou tentar preservar sua integridade física para que o produto não estrague antes de chegar ao consumidor, adicionando-se assim para o aumento de volume tanto a água quanto a urina, e para a preservação o peróxido de hidrogênio. Um dos principais motivos de se encontrar o antibiótico no leite é devido ao tratamento de doenças no gado leiteiro, tal como a mastite, uma doença que afeta as mamas da vaca. O produtor visando receber lucro o mais rápido possível não respeita o período de carência do antibiótico, contaminando o leite, não apenas de sua produção, mas também de outros produtores, pois o produto contaminado de apenas um produtor pode alterar o de outros durante o transporte. A fraude no leite brasileiro vem sendo facilmente detectadas, a adição de água possui um método de congelamento do leite para a sua detecção, o de peróxido de hidrogênio possui dois métodos de detecção o método de biossensor e o de guaiacol, e para a detecção de antibióticos são os métodos físico-químicos, métodos imunoquímicos e o método de inibição microbiana (Devoltest e Copan). A qualidade do leite no Brasil vem aumentando nos últimos anos e a tendência é que por causa de testes de rotina feitos pelas industrias esta qualidade continue em aumento. Palavras-chave: leite, adulterantes, métodos, fraudes, nutrientes. ABSTRACT Milk is one of the most complete foods for humans, possessing several essential nutrients for the body, being the only form of feeding of newborn babies until six months of age, but even after this period, the human being continues to use milk as form of food, now feeding on milk from other species, such as cow's milk and goat's milk. This food is characterized by having a high range of nutrients such as proteins, carbohydrates, fats, vitamins and minerals, and also possess a high water content. Milk, despite being widely consumed in Brazil, has been heavily adulterated, especially by producers, who increase milk sales by adding substances such as water and hydrogen peroxide. For disregarding the lack of antibiotics applied in dairy cattle, causing nutritional changes in milk, and may also cause allergic reactions in consumers because of the intake of the antibiotics present in the product. Dairy products play a large role in Brazilian food, appearing in pyramids and food guides as a group of essential foods for the brazilian. Frauds in this food are characterized by trying to increase the volume of the product or try to preserve its physical integrity so that the product does not spoil before reaching the consumer, thus adding to increase the volume both water and urine, and for preservation adding hydrogen peroxide. One of the main reasons for finding the antibiotic in milk is due to the treatment of diseases in dairy cattle, such as mastitis, a disease that affects the udder of the cow. The producer seeking to make a profit as soon as possible does not respect the antibiotic shortage period, contaminating the milk, not only of its production but also of other producers, since the contaminated product of only one producer can alter the one of others during the transport. The frauds in Brazilian milk have been easily detected, the addition of water has a method of freezing the milk for its detection, the hydrogen peroxide has two detection methods the biosensor and guaiacol method, and for the detection of antibiotics are the physicochemical methods, immunochemical methods and methods of microbial inhibition (Devoltest and Copan). The quality of milk in Brazil has increased in recent years and the trend is that because of routine testing by the industries this quality continues to increase. Key-words: milk, adulterants, methods, cheats, nutrients. LISTA DE ILUSTRAÇÕES Figura 1 – Pirâmide Alimentar 13 LISTA DE TABELAS Tabela 1 – Nutrientes em um copo de leite 14 Tabela 2 – Ingestão de cálcio recomendada 16 Tabela 3 – Tabela 03 - Limite Máximo de Resíduos (LMR) estabelecidos pelos órgãos fiscalizadores – em µg/kg (ppb) 21 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................ 9 2 OBJETIVOS .................................................................................................. 11 2.1 Objetivo Geral ........................................................................................... 11 2.2 Objetivos Específicos .............................................................................. 11 3 IMPORTÂNCIA DO LEITE ............................................................................ 12 3.1 Nutrientes contidos no Leite ................................................................... 14 4 PRINCIPAIS ADULTERANTES .................................................................... 16 4.1 Fraude por Adição de Água ..................................................................... 17 4.2 Fraude por Adição de Reconstituintes ................................................... 17 4.3 Fraude por Adição de Conservantes ...................................................... 18 4.4 Fraude por Antibióticos ........................................................................... 18 4.5 Fraude por Adição de Neutralizantes ..................................................... 18 4.6 Antibiótico no leite ................................................................................... 19 4.7 Adição de Água ........................................................................................ 22 4.8 Peróxido de Hidrogênio ........................................................................... 23 5 CONSEQUÊNCIAS .......................................................................................24 6 MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE: ............................................................. 25 6.1 Antibióticos............................................................................................... 25 6.1.1 Métodos de Inibição Microbiológicos ....................................................... 25 6.1.2 Métodos Físicos e Químicos ................................................................... 26 6.1.3 Métodos Imunoquímicos (Receptores, Enzimas e imunológicos) ........... 28 6.2 Água .......................................................................................................... 29 6.2.1 Crioscopio ............................................................................................... 29 6.2.2 Reagentes ............................................................................................... 29 6.2.3 Padrões ................................................................................................... 30 6.2.4 Materiais .................................................................................................. 30 6.2.5 Equipamentos ......................................................................................... 30 6.2.6 Precauções analíticas ............................................................................. 30 6.2.7 Procedimentos ........................................................................................ 31 6.2.8 Resultados .............................................................................................. 32 6.3 Peróxido de Hidrogênio ........................................................................... 32 6.3.1 Reagentes ............................................................................................... 33 6.3.2 Materiais Eletrodos Impressos ................................................................ 33 6.3.3 Resultados .............................................................................................. 33 6.3.4 Método de Guaiacol ................................................................................ 34 6.3.5 Reagentes ............................................................................................... 34 6.3.6 Materiais .................................................................................................. 34 6.3.7 Resultados .............................................................................................. 34 7 METODOLOGIA ........................................................................................... 35 8 RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................... 36 9 CONSIDERAÇÕES FINAIS .......................................................................... 38 REFERÊNCIAS ............................................................................................. 39 9 1 INTRODUÇÃO A alimentação é um fator muito importante para a saúde do ser humano, pois possui os pilares de construção que o organismo necessita para seu desenvolvimento e manutenção, possuindo nutrientes necessários para que o organismo funcione de forma correta. O leite é um alimento que possui vários destes nutrientes, sendo a única forma de alimentação de recém-nascidos de todas as espécies mamíferas, pois além destes nutrientes possui anticorpos produzidos pela mãe, o que protege a prole de infecções durante o primeiro período de vida (Araujo et al, 2013) O consumo de leite pelo ser humano não acaba após o período de lactação da mãe, passando para a vida adulta até a terceira idade, onde o consumo de leite é recomendado para a ajuda na prevenção de doenças ósseas, sendo assim consumido o leite de diferentes espécies de mamíferos, tais como o leite de vaca e o de cabra, que são os mais consumidos pela população (Philippi, 2014). Este alimento é uma importante fonte de nutrientes necessários para atingir o valor de calorias (kcal) de uma dieta. Por ser rico em cálcio e proteínas, o consumo de produtos lácteos é muito importante para o desenvolvimento dos ossos, principalmente em crianças, onde é necessária uma alimentação balanceada para o auxílio do seu crescimento e desenvolvimento (Philipi, 2014). No Brasil o consumo de leite vem aumentado, e a adulteração e fraude deste alimento também, principalmente para o aumento de volume e vida útil, causando mudanças nutricionais no leite, tirando-o de suas propriedades nutricionais que o tornam um alimento quase completo. É adicionado em sua composição vários tipos de adulterantes como a água e a urina de vaca, durante o processo de ordenha, para que o comprador compre uma quantidade maior de produto do que o produtor realmente o está oferecendo (Scherer,2015). Por ser um alimento de vida útil baixa, o uso de conservantes utilizados no leite também é algo a se preocupar, pois após a ordenha existe uma dificuldade de se armazenar o leite mantendo uma boa qualidade. Um dos principais conservantes utilizados é o peróxido de hidrogênio (água oxigenada), mas sua detecção após certo 10 período é dificultada por ser uma substancia instável e de rápida oxidação (Simonaggio, 2014). Para que o leite chegue em boa qualidade na mesa do consumidor a saúde do gado leiteiro é muito importante, e se deve seguir a risca as direções das legislações, o que não ocorre algumas vezes, por isso vestígios de antibióticos são encontrados no leite, devido à falta de atenção do produtor por não respeitar o período de carência de certos antibióticos. O consumo de leite contaminado por esses compostos pode causar alergias em consumidores, como por exemplo o uso de penicilina, pois é visto que certos consumidores possuem certas reações alérgicas a esse tipo de medicamento (Ribeiro, 2009). Devido a essas grandes alterações foram criados métodos para a detecção destes agentes fraudulentos, e as consequências de se alimentar de um produto adulterado é alta, devido a vários fatores que esses adulterantes podem causar ao consumidor (Barbieri, 2013). 11 2 OBJETIVOS 2.1 Objetivo Geral Informar a população dos riscos que o consumo de leite adulterado pode causar e informar os métodos de detecção destas fraudes. 2.2 Objetivos Específicos Mostrar a importância do leite na alimentação humana; Indicar as principais formas de fraudes no leite; Apontar os motivos da fraudação no leite; Expor as consequências de se consumir leite adulterado; Demonstrar os métodos utilizados para a detecção de fraudes e adulterações no leite. 12 3 IMPORTÂNCIA DO LEITE Com a correria do dia-a-dia as pessoas esquecem que precisam de nutrientes para aguentar a carga de atividades, e com isso acabam surgindo novas doenças e a queda da qualidade de vida da população. Na maioria das vezes a solução para esses problemas está numa alimentação equilibrada, em que o leite se destaca como um dos alimentos principais que é consumido desde 6.000 anos a.C pela humanidade, sempre foi considerado saudável e completo, pois possui um grande valor nutricional. Os seres humanos são os únicos mamíferos que mesmo após o desmame utilizam o leite como alimento, sendo essencial quando bebês, recebendo o leite da mãe e após adultos estando em sua dieta, por ser importante e fundamental para uma boa formação dos ossos, pois é um alimento rico em cálcio (Araujo et al, 2013). O consumo de leite é importante nos diversos períodos da vida. Na infância, participa no desenvolvimento e formação do organismo fornecendo proteína, sais minerais e gordura; na adolescência, o leite fornece condições para o rápido crescimento com ótima constituição muscular, óssea e endócrina; e, para pessoas idosas, é fonte principal de cálcio, fundamental na manutenção da integridade dos ossos (Tombini, 2012). O Leite é um alimento-fonte de vários nutrientes, vem da glândula mamária dosmamíferos, e é caracterizado por ser uma fonte importante de vitaminas e minerais, rico em cálcio. Além do cálcio, o leite possui vitaminas, proteínas, potássio, aminoácidos, açúcar, e fósforo, grandes benefícios à saúde, anti-arteriosclerose entre outros, e além disso possui também muita água (88%), componentes estes que o tornam um alimento nutritivo e hidratante. De acordo com muitos estudos, concluíram que até o ano 2020 o leite seja considerado no mundo um dos alimentos mais valiosos, seus nutrientes serão reconhecidos por seus pontos positivos na saúde humana. Ao ser ordenhado o leite contém alguns microrganismos, normalmente encontrados no animal e após a ordenha pode acabar recebendo vários outros do meio ambiente (Philippi, 2014). Se trata de um alimento ingerido diariamente pela maioria da população e infelizmente tem sido vítima de fraudação no Brasil toneladas de produtos vem sendo 13 adulteradas com a intenção de aumentar a produção e prolongar a conservação (Garcia, 2003). Com o intuito de conscientizar a população sobre a importância de ter uma dieta variada e saudável, e ensinar, educar que o leite e seus derivados tem um papel forte na alimentação, foi criada a Pirâmide Alimentar adaptada à população brasileira, com a parceria do Ministério da Saúde, ela indica de modo visual como deve ser feito o consumo dos alimentos em grupos, incluindo os lácteos. Na figura 1 no qual é a representação da Pirâmide Alimentar mostra que, para pessoas que necessitam de 2.000 kcal/dia, recomenda-se o consumo de três porções de lácteos por dia, para poder suprir as necessidades diárias de cálcio e proteínas. Um copo de leite (200 mL) corresponde a uma dessas porções (Philippi, 2014). Figura 1 – Pirâmide Alimentar (Philippi, 2014). 14 3.1 Nutrientes contidos no Leite A composição básica do leite consiste em 88% de água, 3,2% de proteínas, 3,4% de gordura, 4,7% de lactose e 0,72% de minerais. Abaixo segue a Tabela 1, que demonstram os nutrientes encontrados em um copo de leite contendo 244 gramas (Margarido et al, 2004). 15 Tabela 1 – Nutrientes em um copo de leite (Margarido et al, 2004). 16 Podemos entender na Tabela 2, a Ingestão Dietética Recomendada (RDA) e Limite Superior Tolerável de Ingestão (UL) para o cálcio, por faixa etária e estágio de vida (mg/dia) (Amancio, 2015). Tabela 2 – Ingestão de cálcio recomendada (Amancio, 2015). 4 PRINCIPAIS ADULTERANTES Classificado como produto perecível, o leite precisa de uma atenção especial em várias etapas como por exemplo, na produção, transporte, comercialização e consumo, pois está sujeito a alterações, e ou, até mesmo uma adulteração intencional, e isto é em nível mundial, seja pela simples adição de água ou pelo adicionamento de conservantes, reconstituintes, antibióticos, entre outros; essa prática vêm lesando não apenas economicamente o consumidor por fornecer um produto de má qualidade, as consequências geram também a baixa da qualidade do produto, tornando-o impróprio para consumo, além de trazer alguns riscos à saúde de quem o consome. Algumas fraudes podem ocorrer na fase de produção do leite, com a intenção de entregar menos produto para a indústria e para o caminhoneiro, outras ocorrem durante o 17 transporte de leite até o laticínio, neste caso é de autoria do transportador, que age sozinho ou a mando. Ao chegar no laticínio o leite ainda está sujeito a fraudes, nos produtos já expostos, podem ocorrer também diversas alterações, a mais comum a modificação de data de validade (Scherer, 2015). Um dos mais graves exemplos ocorreu em 2008, na China quando adicionaram intencionalmente melanina ao leite para simular aumento do seu teor de proteína. A substância teve um efeito particular sobre os rins das vítimas, e foram registradas seis mortes e mais de 300 mil pessoas adoeceram devido a esse fato (Oliveira, 2012). 4.1 Fraude por Adição de Água É o tipo de fraude mais frequente e simples no leite, com o intuito de aumentar o volume. É facilmente detectado pelo controle físico-químico nas análises de rotina; quando a aguagem é feita pela indústria, a fraude é bem mais precisa e essas alterações dificilmente são detectadas, neste caso, provas que são feitas na rotina do laticínio podem identificar a fraude, como por exemplo a pesquisa de sal ou açúcar. Esta fraude prejudica bastante a qualidade microbiológica do leite, pois a maioria dos fraudadores adicionam água não tratada no leite (Silva et al, 2008). 4.2 Fraude por Adição de Reconstituintes A fraude de água dificilmente vem sozinha, em sua grande maioria ela está acompanhada de algumas substâncias que tentam encobrir sua fraude, essas substâncias são chamadas reconstituintes, justamente por reconstituírem a densidade ou a crioscopia do leite. Essa substância tem como objetivo recompor a aparência e algumas características físico-químicas do leite que foi fraudado, geralmente com água. Dentre os principais reconstituintes destaca-se o sal, sacarose, amido e álcool (Anvisa, 2013). 18 4.3 Fraude por Adição de Conservantes O leite se deteriora rapidamente pela ação dos microrganismos, para impedir que isso aconteça, os conservantes são adicionados fraudulentamente, fazendo com que tenha a capacidade de destruir os microrganismos e/ou impedir sua multiplicação. Os conservantes utilizados são os mais acessíveis e baratos, por exemplo água oxigenada, hipoclorito de sódio, e também formol. Essas substâncias são compostos tóxicos, e prejudicam diretamente nossa saúde (Scherer, 2015). 4.4 Fraude por Antibióticos Os antibióticos presentes em leites, quase sempre de maneira “não intencional’, ou seja, ocorre quando os leites de animais medicados não são devidamente separados (Scherer, 2015). 4.5 Fraude por Adição de Neutralizantes Os microrganismos durante o processo de deterioração produzem diversos metabólitos que alteram a composição natural do leite, por exemplo a deterioração causada por aeróbicos mesófilos, que degradam a lactose e produzem ácido lático, onde ocorre a diminuição do pH do leite. Para encobrir esse processo, são adicionadas algumas substâncias para repor o pH natural do leite, que varia de 6,4 a 6,8. Essas substâncias são chamadas neutralizantes, podemos citar o bicarbonato de sódio e o hidróxido de sódio, chamado também de soda cáustica. Dessa forma, é fundamental um rigoroso controle de qualidade em toda a cadeia produtiva do leite (Anvisa, 2013). 19 4.6 Antibiótico no leite O leite de vaca possui características nutricionais, e por isso caracteriza-se como um alimento de destaque na alimentação humana. Devido à preocupação constante da população e dos órgãos de saúde com a segurança alimentar, faz-se necessário uma atenção especial aos perigos microbiológicos e químicos que podem ser veiculados por esse alimento. A produção leiteira nas diversas regiões do país, faz o uso indiscriminado de antibióticos para tratamento das infecções das glândulas mamárias, a mastite, das vacas em lactação. A presença de resíduos de antibióticos no leite interfere na fabricação de alguns produtos lácteos, podendo ocasionar no consumidor reações alérgicas, além de resistência a antibioticoterapia, várias drogas são empregadas no gado leiteiro, tais como antimicrobianos, antiparasitários e anti- inflamatório não esteroidais. Quando o período de carência, a dosagem e a via de administração destes antibióticos são desrespeitados, ocorre a presença de resíduos de antibióticos indesejáveis nos alimentos de origem animal, acarretando risco à saúde humana; as tetraciclinas são uma classe de antibióticos que agem contra uma grande variedade de microrganismos, desde bactérias gram positivas até gramnegativas, sendo utilizadas na medicina veterinária no tratamento de infecções. Na medicina veterinária o gênero Staphylococcus é o prevalente agente causador de mastites, houve um grande emprego de antibióticos no tratamento desta infecção, causando os maiores prejuízos econômicos à pecuária leiteira brasileira, o impacto decorrente da mastite reduz a produção de leite, a redução do valor comercial desses animais, gastos com medicamentos e mão de obra extra, além disso, a doença causa prejuízos a indústria de laticínios devido a alterações na composição físico-químico do leite, e ainda constitui ameaça a saúde dos consumidores devido a presença de resíduos de antibióticos (Ribeiro et al, 2009). Tendo em vista, que o uso de medicamentos veterinários em animais produtores de alimentos pode causar riscos à saúde da população, foi necessário o estabelecimento de legislações específicas para monitorar a qualidade dos alimentos, com isso, a instrução normativa número 62 que surgiu com o objetivo de complementar a instrução normativa número 51, as principais mudanças adotadas foram a diminuição dos padrões da contagem bacteriana total, e contagem de células 20 somáticas, cujos valores máximos para o recebimento passaram para 600 mil, para a contagem bacteriana total ( ufc/ ml) e contagem de células somáticas ( cs/ml). A higiene durante a obtenção e armazenamento do leite na propriedade leiteira pode ser visto por meio da contagem de bactérias, já a contagem de células somáticas está relacionada ao cuidado sanitário das glândulas mamárias de vacas leiteiras (Melo, 2013). Para assegurar a alta qualidade e a segurança dos produtos lácteos, em relação a presença de antibióticos, é necessário, portanto, determinado o LMR, que é a concentração máxima de resíduos presentes no alimento, resultante do uso de drogas veterinárias. Estes limites, recomendado pelo Codex Alimentarius, São legalmente permitidos ou reconhecidos como aceitáveis no alimento (Matos, 2005). No Brasil, a Instrução Normativa nº 51, de 18 de setembro de 2002, exige a pesquisa periódica de antibióticos em leite, os quais não devem ser superiores aos Limites Máximos de Resíduos (LMRs) previstos para cada grupo químico específico. Os Limites Máximos de resíduos de antibióticos no leite foram estabelecidos no Brasil, por meio do PAMVet, com o objetivo de oferecer produtos de qualidade ao consumidor, que podemos ver na Tabela 03 (Matos, 2005). 21 Tabela 03 - Limite Máximo de Resíduos (LMR) estabelecidos pelos órgãos fiscalizadores – em µg/kg (ppb) (Matos, 2005). 22 4.7 Adição de Água Uma das formas de adulteração no leite mais conhecidas e frequentes é a de adição de água, o que acaba prejudicando a qualidade do leite, pois acaba diminuindo o seu valor nutritivo, interferindo até mesmo na questão de contaminação com microrganismos patogênicos afetando a população microbiana total, prejudicando a saúde do consumidor e implicações jurídicas desrespeitando a Lei 8.078/90 Código de Defesa do Consumidor, sendo assim as indústrias de laticínios monitoram de perto esta possível adição de água feita pelos fornecedores de leite (Cruz, 2009). É fundamental verificar as características físico-químicas do leite, com o intuito de detectar se há alguma fraude, que na maioria dos casos acontecem no campo pelo próprio produtor rural que de má fé repassa o leite adulterado para as indústrias, que acabam comprando uma quantidade de leite com adição de água ao invés de leite puro “gato por lebre”. Tanto que a Constituição Federal de 1988 conferiu especial destaque ao tema, sobretudo ao incluir em seu artigo 6º, a partir da Emenda Constitucional nº 64 de 05 de outubro de 2012 a alimentação como um dos direitos humanos fundamentais a partir da aprovação da PEC 047/2003. A adição de água no leite é uma prática criminosa, o artigo 272 do Código Penal fala expressamente que corromper, adulterar, falsificar ou alterar substâncias ou produtos alimentícios, trazendo danos à saúde e diminuindo o seu valor nutricional, podendo pegar pena de quatro a oito anos sem prejuízo de multa (Barbieri, 2013). A adição de água no leite é um método muito antigo utilizado para aumentar o rendimento do produto, e para mascarar esse ato adicionam diversos outros produtos junto a água, além dela, são adicionados propositalmente no leite, por exemplo o soro do queijo e até mesmo urina, para aumentar o volume. A adição de soro por possuir uma composição de água, lactose e sais minerais, apresentam características físico- químicas semelhantes ao do leite. Esses líquidos possuem baixo ponto de congelamento, e com isso aumenta a dificuldade em detecta-los. Em relação a urina, ela é menos densa comparada ao leite, caso não haja correção da sua densidade, essa fraude será detectada por testes de rotina (Tronco, 2003). 23 4.8 Peróxido de Hidrogênio O peróxido de hidrogênio quando ingerido acarreta sérios problemas à saúde, por esse motivo a legislação brasileira proíbe o uso dessa substância como conservante no leite. Se ingerido em pequenas quantidades, o peróxido de hidrogênio em solução a 3% provoca moderado efeito gastrointestinal, porém em grandes quantidades ou em solução igual ou superior a 10% pode ocorrer grave irritação no trato gastrointestinal, náusea, vômito, danos neurológicos e podem estar associados à morbidade e mortalidade (Embrapa, 2010). As más condições de ordenha, armazenamento, transporte e conservação, faz com que o leite seja contaminado e ocorra o crescimento microbiano, dessa forma o peróxido de hidrogênio é aplicado para recuperar e conservar o leite já deteriorado, camuflando e fazendo com que o leite chegue aos consumidores aparentemente em bom estado, não apresentando nenhum traço da contaminação, pronto para o consumo (Simonaggio et al, 2014). No Brasil a forma usada para conservação do leite é o processo de congelamento para evitar a contaminação por bactéria, mas devido ao fato do peróxido de hidrogênio ser um composto instável e haver alguns registros da dificuldade de sua detecção, ocorre uma fraude de adicioná-lo ao leite que é praticamente despercebida, pois o peróxido oxida e se transforma em água e hidrogênio livre, por isso a fiscalização é falha (Toigo, 2015). Além disso, o peróxido de hidrogênio (água oxigenada) é uma substância altamente oxidante, essa propriedade pode representar em longo prazo um problema sério para a saúde, se utilizado em grandes concentrações. O problema mais grave se dá pelo ataque as células provocando a formação de radicais livres no organismo, acelerando o processo de envelhecimento, morte celular, desenvolvimento de câncer e de uma série de outras doenças degenerativas (Mattos, 2003). ‘’ Não é possível melhorar a qualidade do leite após a ordenha, o melhor que se pode fazer é evitar que a qualidade do mesmo se perca no caminho entre o úbere e o consumidor” (Pinto, 2010). 24 5 CONSEQUÊNCIAS A adição de água ao leite é um método para aumentar o seu rendimento. Esse tipo de alteração além de lesar o consumidor pelo custo de comprar que não é 100% leite, põe em risco a saúde, pois a água que é adicionada muitas vezes não passa por nenhum tratamento e pode contaminar o produto (Cruz, 2009). Uma das fraudes mais conhecidas é a presença dos antibióticos, que quase sempre aparece de maneira “não intencional”, ou seja, quando o leite de animais medicados com antibióticos não é devidamente separado. Esse tipo de caso pode afetar a saúde, com reações alérgicas, tóxicas e a resistência a antibioticoterapia (Brito, 2005). E a adição de Peróxido de Hidrogênio (água oxigenada) altamente oxidante, que a longo prazo pode ocasionar mal à saúde, pode acabar atacando as células e provocar a formação de radicais livres no organismo e com isso aceleraro envelhecimento de células e morte celular, pode também desenvolver câncer e outras inúmeras doenças degenerativas, problemas no fígado e desconfortos abdominal. No nosso organismo, nós já temos a síntese de peróxido, mas em concentrações baixas. Se ingerirmos o peróxido de hidrogênio estaremos acelerando esse processo de ataque celular (Alves, 2007). Além de prejudicar o consumidor economicamente, as consequências geram também a perda da qualidade do alimento, que o torna inapropriado para se consumir, trazendo também riscos à saúde por conter tais substâncias prejudiciais (Barbieri, 2013). 25 6 MÉTODOS PARA DETECÇÃO DE: 6.1 Antibióticos 6.1.1 Métodos de Inibição Microbiológicos Entre os testes mais usados na rotina dos laticínios destacam-se o Delvotest e Copan, E esse método consiste em fazer a incubação de um microrganismo sensível à baixas concentrações de antibióticos conhecidos (geralmente o Bacillus stearothermophilus, entre outros como Streptococcus salivarius sub sp. thermophilus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus e Micrococcus luteus), com uma amostra de leite por 24 a 72 horas; e, caso haja uma concentração de antibióticos suficiente, o crescimento bacteriano será reduzido ou eliminado. Essa inibição pode ser observada através de um halo de inibição no caso do método do disco em placas contendo ágar triptona com microrganismo ativo, O kit Delvotest é um teste de difusão que mede a inibição de microrganismos. Ele foi reconhecido pela AOAC em 1982, onde estabeleceu um limite de detecção para a penicilina de 7 UI penicilina/ mL. Apresenta-se na forma de ampolas contendo meio de cultura com microrganismos na forma não esporulada (Matos, 2005). Após a abertura das ampolas adiciona uma pastilha de glicose no frasco, ampola já contendo a amostra de leite e incuba-se para posterior visualização da coloração da amostra. E o resultado é positivo se não houver crescimento de microrganismos e a coloração manter a cor violeta-púrpura e se a coloração mudar para amarelo o resultado é negativo que indica que houver o crescimento de microrganismos, a cor muda por causa da redução de pH, esse teste é utilizado para a detecção de cinco classes de antimicrobianos: β-lactâmicos, Sulfonamidas, Tetraciclinas, Macrolídas, Aminoglicosídeos (Matos, 2005). E o kit Copan está disponível no mercado em duas versões Microplate e Single ATK que consiste crescimento de microrganismo como o Bacillus stearothermophilus var calidolactis que atua promovendo a redução do pH do meio, consequentemente, essa redução provoca a mudança da cor do meio de violeta para amarelo, uma 26 amostra de leite é adicionada ao tubo contendo a matriz (cultura bacteriana e indicador púrpura de bromocresol) e transferido para incubadora por três horas a uma temperatura de 64,5ºC, o período de incubação permite que os esporos germinem, logo, a multiplicação dos microrganismos promove a produção de ácido e alteração da cor do meio. Após esse período a leitura é feita visualmente, a cor amarela representa negativo para resíduos de antibióticos e a cor violeta indica positivo (Matos, 2005). 6.1.2 Métodos Físicos e Químicos Um exemplo de teste que atua em receptores e se consiste na afinidade específica que os antimicrobianos tem com alguns locais de recepção na parede celular dos microrganismos é o Charm Cowside Test II, A amostra de leite junto com um antimicrobiano da classe a ser testado é adicionada com os receptores, que são marcados radioativamente. A ausência destes resíduos de antibióticos marcados no leite indica que todos os sítios dos receptores serão marcados com a droga não- marcada. Portanto, a quantidade de sítios de ligação ocupados pela droga não- marcada será proporcional à concentração de antibiótico na amostra, para a realização do procedimento do kit Charm Cowside Test II, a amostra de leite é adicionada na ampola do kit e levada à incubação por duas horas e trinta minutos. A leitura é feita visualmente, a cor amarela ou verde representa negatividade da amostra para presença de antibióticos e a cor roxa ou azul indica que é uma amostra positiva, a cor obtida é estável por até 16 horas (Matos, 2005). Os kits CITE Probe (β-lactâmicos), Charm II e Spot Test, são exemplos de testes que se baseiam na reação antígeno (antibiótico) com um anticorpo específico e que utilizam substâncias radioativas. Já o teste de ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) utiliza enzimas que permitem a visualização do resultado através da mudança de cor na solução supostamente positiva. Esta técnica tem sido muito utilizada para detectar resíduos de antibióticos no leite, além de avaliar o controle de qualidade de outros alimentos nas indústrias e diagnosticar patologia humana e vegetal. Isso se deve à alta sensibilidade que o teste apresenta, à rapidez 27 na execução das amostras, número maior de amostras realizadas em 31 menor tempo. Quando uma amostra apresenta positividade para a presença de resíduos de antibióticos através deste método, outros testes mais específicos devem ser utilizados para sua confirmação, o teste de ELISA atua quando o antígeno desconhecido (antibiótico) é depositado sobre a superfície do orifício da placa contendo o anticorpo específico, de modo a ligar-se ao antígeno (Matos, 2005). Uma vez ligado o anticorpo à enzima, estes formarão um complexo de antígeno/anticorpo e que quando adicionado uma última substância no procedimento final do teste, esta irá fluorescer de modo que, a quantidade de antígeno na amostra pode ser inferida por meio da fluorescência. Já no teste imunoenzimático Snap (Betalactâmicos e Tetraciclinas), o antimicrobiano é capturado por uma proteína conjugada com receptor específico em um suporte sólido absorvente localizado em uma unidade plástica moldada que permite detectar no leite resíduos de tetraciclina, clortetraciclina, oxitetraciclina e penicilina G, amoxicilina, ampicilina, ceftiofur, cefapirina, Para realização do procedimento do kit Snap (β- lactâmicos e Tetraciclinas), a amostra de leite é adicionada até a linha indicadora, sendo transferido com uma pipeta do kit para um tubo com a enzima de reação azul (Matos, 2005). O processo de homogeinização do tubo permite dissolver o granulo do conjugado, por sua vez, não deve ser ultrapassado o tempo de 15 segundos no tubo. Após esta etapa, o conteúdo do tubo deve ser para a cavidade do dispositivo SNAP. Quando a amostra estiver escorrida pela janela de resultados na direção de ativação do círculo azul e a borda deste do círculo começar a desaparecer, é pressionado para baixo com firmeza até ouvir um som de ¨Snp¨ claro, o tempo esperado é de seis minutos. A leitura do teste é feita visualmente, ou por meio de instrumentos (usando reflectance) para fornecer interpretações numéricas dos resultados visuais. A alteração na intensidade da cor no círculo de ativação da amostra e do controle, de azul escuro em ambos os orifícios representa teste negativo. Quando houver a cor azul claro ou ausência de coloração no círculo, mostra-se a positividade da amostra, esse kit permite testar o leite diretamente no campo ao pé da vaca, no caminhão, em tanques ou em qualquer lugar. As principais vantagens deste teste são: economia e rapidez para indústrias e produtores do leite, bem como aumento da segurança, além de não precisar de aquecimento ou incubação da amostra e menor tempo para execução (Matos, 2005). 28 6.1.3 Métodos Imunoquímicos (Receptores, Enzimas e Imunológicos) A cromatografia é um método físico e químico de separação dos componentes de uma mistura, que ocorre por meio da migração diferencial destes componentes através das interações entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A fase estacionária é considerada uma forma física desse método,e pode ser realizada em um tubo cilíndrico, ou disposta em superfície planar. Na cromatografia gasosa o estado físico da fase móvel encontra-se na forma de um gás, enquanto na cromatografia líquida apresenta na forma líquida e na cromatografia supercrítica esta fase encontra-se na forma de vapor pressurizado e em temperatura acima da crítica. Dividida em dois grupos, a cromatografia líquida pode ser classificada: em cromatografia líquida clássica e cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). Sendo a primeira realizada em colunas de vidro, sob pressão atmosférica, com fluxo da fase móvel devido à força da gravidade e a segunda utiliza coluna metálica e pressão de fase móvel elevada, obtida com o auxílio de uma bomba de pressão (Matos, 2005). A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica analítica sensível e específica, muito utilizada para a identificação e quantificação de resíduos de antibióticos presentes em alimentos de origem animal, método como este são exigidos pelas agências governamentais, a fim de fiscalizar e monitorar de modo eficiente a concentração desses compostos em alimentos, garantindo assim maior segurança e confiança nos resultados alcançados. Para a validação de métodos analíticos existem parâmetros que devem ser seguidos, como: a seletividade, linearidade, faixa de aplicação, precisão, exatidão, limite de detecção, limite de quantificação e robustez (Matos, 2005). A determinação de resíduos de antimicrobianos no leite pelo método CLAE envolve procedimentos de extração, limpeza, identificação, quantificação e confirmação. O processo de extração consiste em retirar os possíveis interferentes presentes nas amostras, no caso do leite, a elevada quantidade de proteínas e lipídios. Os lipídios, por exemplo, podem obstruir a coluna de extração da fase sólida utilizada na etapa de limpeza, aumentando o tempo deste processo. Para realizar a retirada de gordura presente no leite pode se usar uma pipeta de Pasteur, centrifugação ou ainda pelo processo de congelamento e descongelamento da amostra em temperatura 29 ambiente. No processo de desproteinização do leite utilizam-se ácidos, como o ácido tricloroacético, ácido acético e metano, ácido oxálico e acetonitrila, ácido perclórico, seguida de centrifugação (Matos, 2005). Estudos envolvendo a CLAE que detecta de forma simultânea resíduos de tetraciclinas, sulfonamidas e clorafenicol no leite, os antibióticos da classe das tetraciclinas apresentam solubilidade em ácidos, bases, alcoóis e solventes orgânicos polares, desta forma podem ser extraídos com solventes orgânicos como n-butanol, acetato de etila, acetona e acetonitrila (Matos, 2005). 6.2 Água 6.2.1 Crioscopio Este método tem o objetivo de determinar o teor de água no leite, aplicado em leite fluído in natura ou nas apresentações integrais, semidesnatados e desnatado tratados com o processo de UHT ou pasteurização. O índice crioscópico é a medida do ponto de congelamento ou depressão do ponto de congelamento (DPC) do leite em relação ao da água. O equipamento fornece o índice crioscópico na escala Hortvet (º H). Internacionalmente, se adota expressar os resultados nesta escala (Lanagros, 2011). Equivalência entre as escalas Hortvet (° H) e Celsius (° C) T (° C) = 0,9656 x T (° H) T (° H) = 1,0356 x T (° C) 6.2.2 Reagentes Solução refrigerante: etilenoglicol 70% (Lanagros, 2011). 30 6.2.3 Padrões É necessário utilizar soluções padrões com ponto de congelamento conhecidos para ajuste do crioscópio. Soluções de cloreto de sódio (NaCl) a 0,8646 % (m/v) (ponto de congelamento de -0,530º H ou -0,512º C) e a 1,0155 %(m/v) (ponto de congelamento de -0,621º H ou -0,600º C): secar o cloreto de sódio p.a em forno mufla a 300° C por 5 horas ou em estufa a 130° C por 24 horas, esfriar em dessecador e pesar, exata e rapidamente 8,646 g (para a solução 0,8646%) e 10,155 g do sal (para a solução 1,0155%). Dissolver e transferir para balões de 1000 mL, completando o volume com água fervida e resfriada a 20° C. Estocar as soluções em frasco plástico rígido, com tampa interna de pressão e externa rosqueável. Conservar em geladeira (Lanagros, 2011). 6.2.4 Materiais Pipeta graduada de 5 ml ou material volumétrico similar e cubeta de vidro (Lanagros, 2011). 6.2.5 Equipamentos Crioscópio eletrônico (LANAGROS, 2011). 6.2.6 Precauções analíticas Seguir atentamente as instruções do fabricante do crioscópio, especialmente no que se referir ao banho de refrigeração, o agitador e o procedimento de ajuste com as soluções padrões -0,530º H e -0,621º H. Realizar as leituras com os padrões na 31 mesma temperatura das amostras, a lavagem da vidraria utilizada no ensaio é fundamental, pois quando a mesma apresenta resquícios de detergente, os resultados obtidos são discrepantes (Lanagros, 2011). 6.2.7 Procedimentos Pipetar 2,5 ml da amostra de leite para a cubeta (ensaio em duplicata). Repetir o mesmo procedimento para cada padrão e para água destilada (triplicata dos tubos) colocar as cubetas na geladeira por aproximadamente 1 hora para que todas fiquem na mesma temperatura, realizar o seguinte procedimento: (Lanagros, 2011). (1) Começar a verificação do equipamento com o 1º tubo de água destilada. Se a leitura for adequada, isto é, 0,000 ± 2 mili graus, passar para o próximo passo. Caso contrário, repetir a leitura com a 2º cubeta e assim por diante. Pode ser necessário realizar o ajuste. Neste caso, registrar a leitura no campo adequado (Lanagros, 2011). (2) Fazer a verificação do equipamento com a 1º cubeta da solução padrão - 0,621º H. Se a leitura for adequada, passar para o próximo passo. Caso contrário, repetir a leitura com a 2º cubeta e assim por diante. Se o analista fizer o ajuste, registrar a leitura no campo específico (Lanagros, 2011). (3) Conferir a leitura com o padrão intermediário -0,530º H. Caso a leitura seja adequada, realizar o ensaio com as amostras. Caso contrário, repetir os procedimentos de verificação e ajuste com água destilada e solução padrão -0621º H, para obter um teste satisfatório é necessário que os resultados sejam próximos, com uma tolerância de mais ou menos 2 miligraus (± 0,002° H) (Lanagros, 2011). Neste caso foi identificado uma diferença maior do que 0,002 graus celsius H do valor esperado, sendo assim e preciso realizar outra leitura (2 cubetas). Se o resultado for inadequado e necessário realizar um ajuste, se o resultado for satisfatório o mesmo não é necessário. O procedimento de uso do crioscópio é descrito na IU POA/12 - Crioscópio Eletrônico ITR MK 540. Após cada leitura, limpar 32 cuidadosamente o sensor e o agitador com água e secar delicadamente com papel absorvente fino (Lanagros, 2011). 6.2.8 Resultados Os dados brutos obtidos na análise da depressão do ponto de congelamento são registrados no formulário “Dados brutos da análise de leite” – anexo N POP POA/06/02 (versão atual) e inseridos na planilha eletrônica IT POA/04 para que o resultado seja calculado automaticamente. Fazer a média aritmética das leituras das amostras (considerar apenas as leituras dentro dos limites de tolerância de mais ou menos 2 miligraus). Expressar os resultados com três casas decimais (Lanagros, 2011). O ponto de congelamento máximo aceito pela legislação brasileira é -0,530º H, equivalente a -0,512o C para o leite de vaca e entre -0,550 a 0,585º H para o leite de cabra (Lanagros, 2011). 6.3 Peróxido de Hidrogênio Existem dois métodos utilizados para a detecção do Peroxido de Hidrogênio no leite sendo o Biossensor amperométrico e o Método de Guaiacol. O Método mais utilizado atualmente é o Biossensor amperométrico que possibilita a detecção dessa substância com limites de detecção bastantemenores, além da praticidade e rapidez das análises. Os biossensores funcionam da seguinte forma: para a análise é utilizado Peroxida-se de raiz forte (HRP), pois é atualmente usada em uma grande variedade de sistemas analíticos. Os Peroxidasses podem ser classificados em relação ao seu grupo prostético em hêmicas ou não-hêmicas, as hêmicas apresentam um grupo heme ou ferroprotoporfirina formado por um íon Fe3+. O eletrodo é o principal agente no biossensor, A etapa de incorporação do biocomponente ao eletrodo é crucial no desenvolvimento de um biossensor. A imobilização pode afetar a conformação da 33 enzima, e assim sua estabilidade, ou fazer com que os sítios ativos se tornem menos acessíveis para a difusão de substratos. Sendo assim, o método de imobilização deve ser compatível com a biomolécula que está sendo imobilizada, com a superfície do sensor ou matriz na qual está sendo imobilizada e com o meio onde o sensor será utilizado (Silva et al, 2011). 6.3.1 Reagentes Cloreto de potássio, Cloreto de sódio, hexacianoferrato de potássio, Glutaraldeído Hidroquinona, Peróxido de hidrogênio, Enzima peroxidasse, Nitrogênio, Tinta condutora de carbono (Silva et al, 2011). 6.3.2 Materiais Eletrodos Impressos A impressão dos eletrodos foi feita com a deposição da tinta condutora de carbono Eletrodag (Silva et al, 2011). 6.3.3 Resultados Os resultados obtidos que o pH da solução tampão utilizada nos ensaios iniciais foi 6,0, valor ideal para a HRP segundo recomendações do distribuidor da enzima (Silva, 2011). 34 6.3.4 Método de Guaiacol Outro Método é o Método de Guaiacol que é feito pela formação de coloração salmão, é utilizado o leite Cru, pois possui maior quantidade da enzima peroxida-se. Ao adicionar à solução hidro alcoólica de guaiacol a coloração do leite se torna na cor salmão, obtendo-se assim o resultado positivo na amostra, mostrando que ali não há Peroxido de Hidrogênio no Leite (Lanagros, 2014). 6.3.5 Reagentes Solução hidro alcoólica de guaiacol, álcool etílico, leite cru (Lanagros, 2014). 6.3.6 Materiais Tubo de ensaio, Pipetas graduadas, Estante para tubos (Lanagros, 2014). 6.3.7 Resultados O teste é considerado negativo por ter surgido a coloração salmão mostrando assim que naquele leite não possui Peroxido de Hidrogênio (Lanagros, 2014). 35 7 METODOLOGIA O presente trabalho trata-se de uma revisão de literatura de bibliografia publica de artigos científicos publicados a partir do ano de 2003 em sites como SciELO, LILACS, documentos eletrônicos da Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA) e livros. Após os recolhimentos de dados presentes nas fontes citadas, foram realizadas interpretações dos mesmos para a utilização e desenvolvimento deste presente estudo. 36 8 RESULTADOS E DISCUSSÃO O alto nível de adulterações no Brasil é algo alarmante, mas devido a legislações que regularizam a coleta e transporte do leite, sua qualidade vem aumentando nos últimos anos. Por ser um alimento muito consumido nas casas de brasileiro sua integridade deve ser mantida, por isso a fiscalização deste alimento deve ser rigorosa (Garcia, 2003). O leite é um alimento quase completo, ou seja, possui a maioria dos nutrientes necessários para o organismo, desde o período lactante da mãe, onde o leite é a única forma de alimentação do bebê, até a terceira idade onde o consumo de leite ajuda a manter sua integridade óssea (Tombini, 2012). Por ser um alimento perecível, o leite está sujeito as alterações pelo motivo de tentar prolongar a vida de prateleira do mesmo, assim o produtor buscando um lucro financeiro alto, altera sua produção, mas esta pratica também contamina o produto de diferentes produtores devido a sua forma de transporte, onde é transportado em caminhão de transporte de líquidos, e acaba se misturando com o produto de outros latifúndios. Essa pratica causa uma grande perda de produto pois devido a legislação, este leite deve ser descartado, e o produtor responsável pela contaminação deve então arcar com o pagamento da carga descartada (Scherer, 2015). O alto uso de antibióticos nos animais também é algo alarmante, além de favorecer o surgimento de microrganismos resistentes a esses antibióticos, sua utilização de forma errada pode também causar danos ao consumidor, por estar ingerindo uma quantidade de medicamento não necessária, e muitas vezes causar reações alérgicas, pois o consumidor pode apresentar sensibilidade a certos tipos de antibióticos. O tratamento de doenças no gado leiteiro deve ser feito corretamente respeitando o prazo de tempo até que o leite possa ser ordenhado. Mas na prática muitos produtores, almejando um alto lucro, não respeitam esse período e assim contaminam o produto de vários latifundiários (Brito, 2005). Para que o produtor venda uma quantidade maior de produto, a técnica de fraude por adição de água também é bastante utilizada para sua alteração física, mas esta fraude é facilmente detectada devido aos métodos citados neste trabalho. Uma 37 outra forma de criar esta ilusão de volume seria a adição de urina de vaca, pois por possuir minerais em sua composição podem, se a análise for feita de forma incorreta, não ser detectadas. O soro de queijo também é utilizado nesta fraude, causando uma dificuldade em detectar sua presença por ser um produto derivado do leite e possuírem uma quantidade de nutrientes semelhantes (Tronco, 2003). 38 9 CONSIDERAÇÕES FINAIS O leite é um alimento bastante consumido pela população brasileira, não apenas por possuir vários nutrientes, mas também por ter um contexto cultural muito forte dentro da alimentação do ser humano, apesar de ainda ser um alimento muito fraudado no pais, os métodos analíticos vistos nesta revisão de literatura mostram-se muito eficientes para a detecção de agentes adulteradores. A adição de água, peróxido de hidrogênio e presença de antibióticos no leite são as adulterações mais comuns no país, e os métodos criados para a detecção destas fraudes apesar de serem efetivos, possuem um baixo rendimento analítico e mão de obra especializada o que dificulta a detecção de fraudes na matéria-prima de várias indústrias. Os métodos citados aqui são os mais comuns e recentes para a análise do leite, o método para a detecção de antibiótico é feita a partir da incubação de microrganismos sensíveis a vários tipos de antibióticos e então se é visto se há um crescimento ou eliminação destes microrganismos em contato com a amostra, para o do peróxido de hidrogênio é utilizado dois métodos que demonstram o pH da amostra por detecção de peroxidase, e o para a detecção de água é feito o congelamento da amostra e medição da sua temperatura de solidificação. 39 REFERÊNCIAS Alves, LC. As Consequências do Leite Adulterado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ministério da Educação, 2007. Amancio, OMS. A importância do consumo do leite no atual cenário nutricional brasileiro, Sociedade Brasileira de Alimentação e Nutrição, 2015. Anvisa, Anvisa avalia risco da presença de formol e ureia no leite, disponível em: http://www.anvisa.gov.br/, 2013. Araujo, MC. Bezerra, IN. Barbosa, FDS. Junger, WL. Yokoo, EM. Pereira, RA. Sichieri R. Consumo de macronutrientes e ingestão inadequada de micronutrientes em adultos, São Paulo, Rev. Saúde Pública vol.47, 2013. Barbieri, CR. Araujo, YRS. A Adulteração do Leite a partir da adição de Água e a Violação aos Direitos do Consumidor, Congresso Nacional de Pesquisas em Ciências Sociais Aplicadas, Conape, Francisco Beltrão, PR. 2013). Brito, MAVP. Lange, CC. Resíduos de antibióticos no leite, Comunicado Técnico, Juízde Fora, 2005. Cruz, EM. Santos. EP. 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