Métodos diretos de análises de carboidratos totais nos alimentos e determinação do teor de fibra alimentar

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Métodos diretos de análises de carboidratos totais nos alimentos e determinação do teor de fibra alimentar
Carboidratos: Componentes mais abundantes nos alimentos.
Carboidratos totais: soma de todos os carboidratos que estão presentes nos alimentos e que são ingeridos através da alimentação (inclui, os carboidratos disponíveis, isto é, aqueles hidrolisáveis e absorvidos no trato gastrintestinal, e as fibras alimentares, os carboidratos que são resistentes à digestão e absorção no intestino delgado humano com fermentação completa ou parcial no intestino grosso). 
Grande maioria de origem vegetal; abundantes e baratos; Produtos de origem vegetal são, de modo geral, mais baratos que os produtos de origem animal; Energia fornecida pelos carboidratos disponíveis: 4 kcal/g; diferentes estruturas, tamanhos, propriedades; não são tóxicos; podem ser modificados quimicamente. 
 
Análises de carboidratos: Existem várias metodologias de análise as mais comuns são utilizadas para análises de:
• Carboidratos totais
• Carboidratos redutores totais
Normalmente exigem um tratamento inicial da amostra ou diluições antes das análises
MÉTODOS:
• Diretos: que quantificam, a partir de análise específica, os carboidratos totais do alimento, os carboidratos redutores, um determinado grupo de carboidratos ou um carboidrato em especial
• Indiretos: são necessárias determinações de outros constituintes do alimento, que não carboidratos, para se obter os carboidratos totais, ou algum carboidrato ou grupo de carboidratos específico.
Principais métodos diretos:
• Baseados nas propriedades físicas das soluções de carboidratos ou no poder redutor dos açúcares simples ou
• Hidrólise dos carboidratos complexos para determinação do teor de carboidratos totais
Destacam-se:
• Redução para carboidratos redutores por prova titulométrica (ex. Fehling)
• Redução para carboidratos redutores por prova colorimétrica (ex. Ácido 3,5-dinitrosalissílico – DNS)
• Prova colorimétrica para carboidratos totais (ex. Fenol-Sulfúrico)
· Método fenol-ácido sulfúrico
• Prova colorimétrica
• Baseado na hidrólise dos carboidratos presentes na amostra
• A hidrólise é realizada com ácido sulfúrico concentrado (2,5 a 3 ml)
• Utiliza-se 0,5 ml de amostra diluída em água para a análise
• Acrescenta-se também 0,5 ml de solução de fenol a 5%
• Pelo aquecimento da reação com o ácido, as pentoses são convertidas em furfural e as hexoses em hidroximetilfurfural
• Ao reagirem com fenol, furfural e hidroximetilfurfural produzem uma cor amarelo-alaranjada
Aquecimento de hexoses gera hidroximetilfurfural, Aquecimento de pentoses gera 2-furfural ou furfural. 
 
· Método fenol-ácido sulfúrico
• Para os produtos ricos em pentoses, como fibra do trigo e do milho, são construídas curvas de calibração com xilose (principal carboidrato destes constituintes) e as medidas de absorbância são efetuadas a 480 nm;
• Para os produtos ricos em hexoses, são construídas as curvas de calibração com o monossacarídeo predominante e as medidas de absorbância são efetuadas a 490 nm.
• Obs: usar sempre o açúcar predominante no alimento como padrão, uma vez que a intensidade de coloração obtida a partir dos diferentes carboidratos é variável
• Para esta metodologia são preparados padrões de calibração nas concentrações entre 2 mg/100 ml e 10mg/100 ml
• A amostra utilizada para a análise deve ser diluída até se obter um valor de absorbância dentro da faixa obtida para os padrões. 
Construção da curva de calibração: Construir a tabela no Excel contendo os valores de absorbância obtidos para as respectivas concentrações de carboidratos. Selecionar todos os valores da tabela. 
Determinação de carboidratos redutores
Métodos de redução para carboidratos redutores por prova
colorimétrica:
- Teste com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS): Baseado na reação entre o açúcar redutor e o ácido, de cor amarela, o qual é reduzido a um composto colorido avermelhado, o ácido 3-amino-5-nitrosalicílico; O açúcar redutor é oxidado nesta reação; Para esta análise é preparada uma curva de calibração utilizando-se o carboidrato redutor de interesse na concentração de 0 a 1 g/L.
· Método DNS
- Aspecto das amostras em função da concentração de carboidratos – teste com ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). Quando tem menos açucares redutores tem cor amarelo claro, quando tem mais açucares redutores é mais escuro quase laranja.
FIBRA ALIMENTAR
Versão em português reconhecida de dietary fiber (EN-US) ou dietary fibre (EN-UK). Não deve ser traduzida como “fibra dietética”; O termo em português “dietético” para alimentos significa “produto especialmente formulado ou processado, no qual se introduzem modificações no conteúdo de nutrientes adequados para a utilização em dietas diferenciadas ou opcionais, atendendo às necessidades de pessoas em condições metabólicas e fisiológicas específicas”
Dessa forma, o termo “dietético” não deve ser utilizado para um nutriente que deve estar presente na alimentação humana normal. 
Métodos
Segundo exigência da ANVISA: Para a determinação de fibra alimentar e dos demais nutrientes dos alimentos deverão ser utilizados métodos analíticos reconhecidos internacionalmente e validados. 
Várias metodologias de análise: A escolha depende da necessidade de informações em relação a seus componentes; pode haver variação de resultado em função da metodologia utilizada e do tipo de polissacarídeo predominante na fibra alimentar; há métodos ultrapassados, em que os valores são subestimados. 
· Métodos gravimétricos: 
ultrapassados, determinam o resíduo insolúvel após uma extração química ou enzimática e química dos componentes que não pertencem à fração fibra
Tipos:
Fibra bruta: fornece valores inexatos de celulose e lignina
Método detergente ácido (ADF): representa a soma de lignina e celulose
Métodos detergente neutro sem (NDF) ou com a adição de alfa-amilase (NDFM): determina a soma de celulose, lignina e hemicelulose insolúvel. 
Métodos que utilizam detergentes: foram originalmente desenvolvidos para analisar forragens e rações; foram aplicados extensivamente para alimentos; não determinam os componentes solúveis da fibra; Os resíduos quantificados não correspondem, portanto, à fibra alimentar como ela é hoje definida. 
Métodos enzímico-gravimétricos: métodos de rotina mais utilizados para fins de rotulagem.
· Métodos enzímico-químicos: 
Usados em pesquisa e para certos tipos de fibras em que o método enzímico-gravimétrico não é recomendado. Permitem isolar e identificar os componentes que fazem parte da fibra alimentar de forma individual;
Etapas:
1. Pesagem da amostra previamente seca e triturada
2. Digestão enzimática
3. Precipitação da fibra alimentar solúvel com etanol a 80%
4. Hidrólise ácida do resíduo resultante para identificação dos monomêros
5. Determinação dos monomêros liberados da hidrólise ácida do resíduo: açúcares neutros e ácidos urônicos
6. Açúcares neutros: identificados por técnicas colorimétricas, cromatografia gasosa (CG) ou cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE)
7. Ácidos urônicos: primeiramente convertidos em açúcares neutros e posterior determinação por colorimetria CG e CLAE
8. Quantificação da lignina (resíduo que permanece insolúvel após a hidrólise ácida) por gravimetria
9. Fibra alimentar total = açúcares neutros + ácidos urônicos + lignina
Métodos enzímico-gravimétricos 
Fundamento: metodologias baseadas na quantificação da massa de resíduo resultante após eliminação de amido e proteína das amostras através de hidrólise enzimática, seguida de precipitação da fibra alimentar solúvel em etanol a 78%. 
· Materiais para filtração:
 Cadinhos filtrantes
 Auxiliar de filtração de SiO2 para retenção do resíduo (Celite® Analytical Filter Aid, Sigma).
Etapas:
1. Sequência de hidrólises simulando a atividade das enzimas do TGI que atacam moléculas grandes (enzimas: amilase, protease e amiloglicosidase)
2. Precipitação, em etanol a 78%, da fração solúvel com grau de polimerização superior a 12 (ex. pectinas, hemiceluloses solúveis,β-glicanos)
3. Determinação do resíduo obtido após a precipitação
4. Quantificação das cinzas e proteínas remanescentes para serem descontadas do resíduo
Observação:
 Verificar constantemente a atividade e pureza das enzimas utilizadas (devem estar sem contaminação com pectinases, β-glicanases e hemicelulases);
 Para eficiência da hidrólise, as amostras devem apresentar baixo teor de umidade e de lipídeos na amostra úmida (< 10 g/100 g). Também devem ser trituradas previamente às análises (tamanho de partícula entre 0,3 e 0,5 mm)
 Preferencialmente, trabalhar com amostras previamente secas e desengorduradas;
Método mais preciso e mais próximo da definição atual de fibra alimentar que os métodos gravimétricos; no entanto, carboidratos não-digeríveis com menos de 12 monômeros não são quantificados (ex. inulina, frutooligossacarídeos, polidextrose, maltodextrinas, etc);
 Esses componentes deverão ser quantificados por metodologias que são específicas para eles, publicadas pela AOAC International.