POP (3) - método de Biureto

Prévia do material em texto

Procedimento Operacional Padrão
POP 3 Proteínas Data de elaboração: Data de revisão: Versão:
Elaborado por: Andressa Dantas e Eloá Avelino Pg. ___/_____
Revisado por:
1. Método
Determinação de proteína pelo método de Biureto
2. Descrição:
As origens do método do biureto podem ser traçadas desde a proposta inicial de
Autenrieth, em 1915. Desde então, muitos autores propuseram modificações do mesmo,
sendo, atualmente, a proposta metodológica de Gornall e cols. a mais utilizada. O método
tem por finalidade quantificar as proteínas no soro ou em líquidos por meio de ligações
peptídicas das proteínas (-HN-CO-) reagindo com íons cúpricos em meio alcalino (Reagente
do Biureto) formando um complexo de coloração violeta, cuja absorbância medida em 545
nm é diretamente proporcional à concentração de proteínas na amostra.
3. Princípio:
O método se baseia na reação do reativo do biureto, que é constituído de uma
mistura de cobre e hidróxido de sódio com um complexante que estabiliza o cobre em
solução, sendo o tartarato de sódio o recomendado por Gornall e cols. O cobre, em meio
alcalino, reage com proteínas formando um complexo quadrado planar com a ligação
peptídica. O produto de reação apresenta duas bandas de absorção, uma em 270 nm e
outra em 540 nm. Apesar da banda na região de 270 nm aumentar em seis vezes a
sensibilidade do método do biureto, a banda na região de 540 nm é a mais utilizada para fins
analíticos, porque diversas substâncias, normalmente presentes na maioria dos meios
analisados, absorvem na região de 270 nm causando muita interferência no método
4. Materiais, vidrarias e equipamentos:
● Bastões de vidro;
● Béqueres de 250 mL;
● Pipetas graduadas de 2 e 5 mL;
● Pipeta Pasteur;
● Tubos de ensaio;
● Espectrofotômetro (leitura em 540 ± 10 nm);
Procedimento Operacional Padrão
POP 3 Proteínas Data de elaboração: Data de revisão: Versão:
Elaborado por: Andressa Dantas e Eloá Avelino Pg. ___/_____
Revisado por:
● Estante para tubos de ensaio
5. Reagentes e soluções
● Solução de Hidróxido de Sódio (NaOH) 20%;
● Solução de Sulfato de Cobre (CuSO4) 0,25 mol/L;
● Solução de Ovoalbumina 10%;
● Reagente de Biureto.
● Água destilada
6. Precauções e cuidados especiais:
● Aplicar os cuidados habituais de segurança na manipulação dos reagentes e
amostra biológica dentro da capela.
● De acordo com as instruções de biossegurança, todas as amostras devem
ser manuseadas como materiais potencialmente infectantes.
● O Biureto é corrosivo. Contato com os olhos, pele ou mucosas devem ser
evitados. Não aspirar ou ingerir.
● Descartar os reagentes e as amostras de acordo com as resoluções
normativas locais, estaduais e federais de preservação do meio ambiente.
7. Preparo das amostras
● Amostras sólidas em pó ou grânulos: 1. Retirar partes representativas da amostra,
em quantidade suficiente para determinações em triplicata e repetições; 2. Com o
auxílio de uma espátula, transferir para um gral de porcelana previamente preparado
e fragmentar a amostra.
● Amostras líquidas: 1. Agitar a amostra até homogeneizá-la bem; 2. filtrar, se for
necessário; 3. transferir, com o auxílio de uma pipeta, o volume da amostra;
● Sorvetes e gelados: 1. Deixar em repouso à temperatura ambiente (para liquefazer a
amostra); 2. Homogeneizar.
● Produtos semi-sólidos ou misturas líquidas ou sólidas: 1. Ralar produtos, como
queijo e chocolate; 2. Retirar a amostra por quarteamento.
● Pastas semi-viscosas e líquidos contendo sólidos: Segue um único passo:
Homogeneizar o produto em liquidificador ou multiprocessador.
8. Procedimento experimental (descrição da análise)
Procedimento Operacional Padrão
POP 3 Proteínas Data de elaboração: Data de revisão: Versão:
Elaborado por: Andressa Dantas e Eloá Avelino Pg. ___/_____
Revisado por:
PROCEDIMENTO 1:
Branco de Amostra: Misturar 20 μLdo soro com 1000 μLde solução de NaCl 150 mmol/L
(0,85%). Medir a absorbância da mistura em 545 nm, acertando o zero de absorbância com
água deionizada ou destilada. Subtrair a absorbância obtida do Branco de Amostra da
absorbância do Teste e calcular o resultado final
PROCEDIMENTO 2:
A. Condições de Reação:
● Leitura: Comprimento de onda 545 nm (530 a 550 nm)
● Medida: contra o Branco
● Tipo de reação: Ponto final
B. Técnica de Análise:
1. Deve-se pipetar em cada tubo de ensaio:
Tubos:
1º tubo:
Branco
2º tubo:
Teste
3º tubo:
Padrão
Água deionizada 20 μL
Amostra 20 μL
Padrão (1) 20 μL
Biureto (2) 1000μL 1000μL 1000μL
2. Homogeneizar e incubar em banho-maria a 37 ºC por 10 minutos. O nível de água do
banho-maria deve ser superior ao nível dos reagentes nos tubos;
3. Fazer as leituras fotométricas do Padrão (Ap) e do Teste (At) zerando o aparelho com
o Branco em 545 nm (530 a 550 nm);
4. A cor é estável por 1 hora.
9. Cálculo dos resultados
Procedimento Operacional Padrão
POP 3 Proteínas Data de elaboração: Data de revisão: Versão:
Elaborado por: Andressa Dantas e Eloá Avelino Pg. ___/_____
Revisado por:
Como a metodologia obedece a lei de Lambert-Beer, pode-se efetuar os cálculos através do
Fator de Calibração (FC).
Fórmula:
𝐹𝐶 = 𝐶𝑝𝐴𝑃 𝐶𝑡 = 𝐹𝐶 × 𝐴𝑡
Onde, Concentração do Padrão (Cp) ; Concentração do Teste (Ct); Absorbância do Padrão
(Ap); Absorbância do Teste (At).
Conversão de Unidades: Unidades Convencionais ( g/dL) x 10 = Unidades SI (g/L)
10. Referencias
ANALISA. Proteínas totais. Kit para determinação das proteínas totais por metodologia
caloriméttrica. Disponível em:
<http://www.goldanalisa.com.br/arquivos/%7BB9568130-0164-4EF2-BC10-13875DD3469C%
7D_Prote%C3%ADnas%20Totais_REF_418.pdf>. Acesso em 21 jul. 2021.
BRITO E FREITAS , Cássia Almeida Brito e Leonardo Viana de Freitas. CARACTERIZAÇÃO
DE PROTEÍNAS VIA MÉTODO DE BIURETO COMO PROPOSTA INTERDISCIPLINAR
PARA O ENSINO DE QUÍMICA DE COORDENAÇÃO. Experiências em Ensino de
Ciências V.13, No.5: O MÉTODO DE BIURETO, São Paulo, v. 13, n. 31, ed. 5, p. 1/31, 15
out. 2018. Disponível em: https://if.ufmt.br/eenci/artigos/Artigo_ID524/v13_n5_a2018.pdf.
Acesso em: 20 jul. 2021.
DIMAS A. M. Z.; CÁSSIA T. B. V. Z. DETERMINAÇÃO DE PROTEÍNAS TOTAIS VIA
ESPECTROFOMETRIA: VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS EXISTENTES.
São Paulo. 1998. Disponível em:
<https://www.scielo.br/j/qn/a/pnCxFMPrQkjW5vj38BT5kbG/?format=pdf&lang=pt>. Acesso
em: 21 jul. 2021.
MÉTODOS espectrofotométricos mais utilizados para a determinação de proteínas totais: O
MÉTODO DE BIURETO. ed. São Paulo: XV Curso de Verão Portal do Conhecimento do
Procedimento Operacional Padrão
POP 3 Proteínas Data de elaboração: Data de revisão: Versão:
Elaborado por: Andressa Dantas e Eloá Avelino Pg. ___/_____
Revisado por:
Departamento de Bioquímica XV Curso de Verão em Bioquímica e Biologia Molecular, 2019.
XV Curso de Verão. Disponível em:
http://cursobioquimica.iq.usp.br/paginas_view.php?idPagina=503&idTopico=1060#.YPcckExv
_IV. Acesso em: 20 jul. 2021.
FELTES, M., C. Procedimentos operacionais padronizados de bromatologia de alimentos [et
al.]. – Blumenau: Instituto Federal Catarinense, 2016. Disponível em:
<https://mail.google.com/mail/u/0/?tab=rm#search/bromatologia/FMfcgzGkXSfrCbCdrDtnFqd
TTGfhWdWL?projector=1&messagePartId=0.3> Acesso em: 20 de julho de 2021.