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Disciplina: Perícia Forense - Genética Forense Aula 6: Marcadores genéticos: DNA fingerprint, polimorfismos genéticos – Parte II Apresentação Como já comentamos em aulas anteriores, cada indivíduo da nossa espécie apresenta diferenças em sua molécula de DNA. Por isso, a identificação dessas diferenças tem sido tão importante para a Genética Forense na elucidação de crimes, como também na determinação de paternidade. Portanto, nesta aula, continuaremos o nosso estudo sobre os polimorfismos genéticos, agora dando ênfase para os polimorfismos de sequências repetidas em regiões chamadas de minissatélites e microssatélites. Com isso, vamos entender um pouco porque eles são preferencialmente escolhidos para a determinação de perfis genéticos para uso em análises forenses. Além disso, vamos conhecer um pouco sobre marcadores de linhagens parentais maternas e paternas. Objetivos Reconhecer os polimorfismos de sequências repetidas in tandem (VNTRs e STRs) como os principais marcadores utilizados na identificação humana; Identificar os STRs como os marcadores genéticos padronizados em protocolos para análises forenses; Explicar a utilização de polimorfismos associados à herança uniparental em análises forenses. Anemia falciforme Vamos começar esta segunda parte da nossa aula sobre polimorfismos com uma curiosidade sobre a anemia falciforme. Glóbulo vermelho normal Glóbulo vermelho em forma de foice (falciforme) (Fonte: Sebastian Kaulitzki / extender_01 / Shutterstock) A anemia falciforme faz parte de um grupo de doenças decorrentes de defeitos na molécula de hemoglobina que constitui os nossos glóbulos vermelhos e, portanto, é chamada de Hemoglobinopatia. Como você pode ver na imagem acima, a hemácia do indivíduo adquire um formato parecido a uma foice (hemácia falcêmica). Dessa forma, é uma variação na estrutura da hemoglobina (Hemoglobina S ou HbS). Como estudamos na aula passada, esse defeito é resultado de uma mutação no gene de uma das cadeias da hemoglobina. Porcentagem da população que possui o alelo da célula falciforme (Hemoglobina S) > 6 2 - 6 Malária falciparum endêmica Contudo, existe um fato bem interessante relacionado à frequência dessa mutação nas populações, principalmente, nos afrodescendentes. Ou seja, a incidência de anemia falciforme é maior nesse grupo étnico e, isso, tem relação com a origem dessa mutação. Se você observar o mapa à esquerda, mostra a distribuição do alelo da hemoglobina S, e o outro, à direita, indica as regiões do continente africano endêmicas para a malária. Essa doença tem uma distribuição geográfica característica, ocorrendo com mais frequência na África Equatorial e de modo menos comum na área do Mediterrâneo e da Índia. Exemplo O surgimento dessa mutação está relacionado à incidência de malária, um exemplo clássico de seleção natural. No continente africano, que é endêmico para a malária, quem tem anemia falciforme consegue sobreviver mais tempo do que quem não tem a mutação. Para a população, contrair malária é muito mais prejudicial, pois as chances de óbito são muito maiores. Já quem tem anemia falciforme, apesar de todas as complicações da doença, como anemia crônica, hemorragias, dores nas articulações etc., consegue sobreviver por mais tempo do que quem adquire malária. Isso se deve ao fato de que as hemácias anormais não favorecem a sobrevivência do protozoário. Portanto, quem tem anemia falciforme não adquire malária. Então, como a mutação, nesse ambiente, trouxe uma vantagem para esses indivíduos, ela foi selecionada positivamente. Ou seja, os indivíduos com anemia falciforme sobrevivem mais tempo, se reproduzem e transmitem a mutação para as próximas gerações. Por isso, a frequência do alelo que causa a HbS é bem alta no continente africano. É só observar os dois mapas: a área de maior frequência do alelo está de acordo com as regiões endêmicas para a malária. Logo, podemos afirmar que esta mutação é na verdade um polimorfismo, já que a sua frequência nessa população é maior do que 1%. Atividade 1. De acordo com o explicado acima, como deve ser a frequência de uma mutação na população? Polimorfismos de sequências repetidas in tandem Agora, já que relembramos o conceito de polimorfismo, vamos falar exclusivamente dos polimorfismos de sequências repetidas in tandem usadas na genética forense. Quando falamos deste polimorfismo estamos nos referindo às regiões de minissatélites ou VNTRs (número variável de repetições in tandem) que estão dispersas no genoma humano, geralmente em regiões de DNA não codificante (íntrons). Entretanto, para se fazer a análise desses VNTRs, é necessária uma quantidade específica de DNA. E, com a descoberta dos microssatélites, a amplificação dessas sequências tornou-se o método de primeira escolha, devido ao seu poder de discriminação. Microssatélites são sequências de 2 a 8 nucleotídeos repetidas in tandem, chamadas de STR (Short Tandem Repeats). Exemplo 2 CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CACAGCCAT 4 CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT 5 CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT 6 CAGATACCGCTCGCGCT CGA CGA CGA CGA CGA CGA CACAGCCAT Perceba que a sequência destacada em vermelho acima (CGA) é de trinucleotídeos e repete-se de maneira diferente. Depois da amplificação do DNA, essas repetições são visualizadas em bandas de acordo com o número de repetições. Veja na figura abaixo: Bandas de tamanhos menores ficam embaixo (na representação do gel de eletroforese mostrado na figura) e as maiores ficam na parte de cima do gel. O número de repetições para cada polimorfismo pode variar de indivíduo para indivíduo. Esta característica permite diferenciar indivíduos de uma determinada população, até mesmo entre irmãos. Em caso de gêmeos monozigóticos, ambos possuem a mesma informação para estes marcadores, salvo raras exceções em que ocorrem mutações. Os STRs mais usados na Genética Forense são os tri, tetra e pentanucleotídeos, sendo os tetranucleotídeos (unidade de repetição com 4 nucleotídeos, por exemplo GATA). Calcula-se que no genoma humano existam 500.000 STRs, dos quais 6.000 a 10.000 são tri ou tetraméricos. Por serem de tamanhos próximos, os STRs podem ser analisados todos ao mesmo tempo, ou seja, em uma única reação de PCR. Por isso, até mesmo em amostras muito degradadas se consegue amplificar essas sequências. Saiba mais O FBI americano (Federal Bureau of Investigation) adota uma série-padrão de 13 locus de STRs, com sequências de 4 a 5 nucleotídeos, para análises em Genética Forense. Além desses locus, é analisado o gene da amelogenina, responsável pelo desenvolvimento do dente no feto. Existe uma diferença relacionada à sequência desse gene nos cromossomos X e Y. Portanto, analisando a variação dessa sequência é possível determinar o sexo do indivíduo que está sendo analisado. Posições de marcadores STR em cromossomos humanos (Fonte: Slide Player <https://slideplayer.com/slide/5821636/> ) Na figura acima, está representada a localização cromossômica de cada loco de STR analisado pelo FBI em análises forenses adotadas por laboratórios de vários países. Cada STR se encontra em cromossomos diferentes ou em pontas extremas de um mesmo cromossomo. Dessa forma, sabe-se que eles serão herdados de maneira independente. Em cada loco, podem ser detectados vários alelos com diferentes números de sequências repetidas, gerando inúmeros genótipos possíveis. AmpFLSTR Identifiler™ PCR Amplification Kit para 15 STRs AmpFℓSTR Identifiler™ ® ® https://slideplayer.com/slide/5821636/ GS500-internal lane standard Fonte: STRBase (SRD-130) <https://strbase.nist.gov/kits/Identifiler.JPG> Atualmente, esses locus são amplificados por kits comerciais. Existem diversos desses kits, como, por exemplo, o PowerPlex sistemas ESX (16 STRs) e o ESI (os mesmos 16 STRs com adição do SE33). São usados corantes fluorescentes para discriminar cada loco. Os fragmentos de tamanhos diferentes são separados por ordem de tamanho no gel de poliacrilamida e detectadospor raio laser à medida que alcançam o final do gel. Um computador acoplado ao aparelho de eletroforese produz a leitura do tamanho e cor do fragmento em separado gerando um gráfico. Cada pico no gráfico representa um alelo e cada loco exibe um pico único (se o indivíduo for homozigoto) ou um par de picos (se o indivíduo for heterozigoto). Veja a figura abaixo: ® https://strbase.nist.gov/kits/Identifiler.JPG Quando se faz a análise por eletroforese capilar e, portanto, se obtém os picos para cada alelo de cada loco, é necessário se ter uma unidade de referência para se ter certeza dos alelos que aparecem no eletroferograma. Para isso, se usa um Ladder ou marcador de peso molecular, também conhecido como escada alélica. Portanto, para cada um dos alelos analisados se tem um pico comparativo para que você possa ter certeza sobre os alelos de cada loco analisado. Observe a figura a baixo: Para a determinação do sexo são analisados os alelos para o gene da amelogenina. O comprimento da sequência de nucleotídeos desse gene varia entre os sexos. No homem, o gene tem 112 pares de nucleotídeos (pb) e na mulher são 106 pb. Existe uma pequena diferença no tamanho do pico. E como as mulheres tem 2 cromossomos X, aparece apenas um pico para indivíduos do sexo feminino. No caso de indivíduos do sexo masculino aparecem dois picos: Um para o cromossomo X Outro para o cromossomo Y Fonte: PNCQ <https://www.pncq.org.br/> Os locus de STR adotados pelo FBI foram extensivamente estudados em populações caucasoides, hispânica, afro-americana e asiática, e a frequência dos alelos varia significativamente de uma população para outra. Depois de analisadas as amostras, existe um cálculo estatístico com base na frequência de cada alelo na população. Dessa forma, se chega a um número que permite dizer que somente uma pessoa em cada 10 quatrilhões ou em cada 100 quatrilhões poderia apresentar os mesmos alelos para todos os 13 locus. https://www.pncq.org.br/ Por isso, a chance de uma pessoa de uma população qualquer ter os mesmos alelos que outra é quase zero. Assim, depois de todas as análises, não há dificuldade em se ter um resultado conclusivo. Marcador do tipo Indel Recentemente, o estudo da identificação humana tem se direcionado ainda para o uso de SNPs (polimorfismos de nucleotídeo único) que, por serem marcadores de inserção/deleção (indels) pode atuar como auxiliares na determinação correta de uma análise forense, a favor ou contra a relação assumida e, também, por permitirem a identificação de indivíduos, mesmo a partir de amostras altamente degradadas, comuns na criminalística. Na figura abaixo, observe a representação de um marcador do tipo Indel (inserção/deleção): wild-type sequence ATCTTCAGC CATAAAA GATGAAGTT exclusão 3 bp ATCTTCAGC CAAA GATGAAGTT inserção 4 bp (em vermelho) ATCTTCAGC CATA TGTG AAA GATGAAGTT Fonte: PNCQ <https://www.pncq.org.br/> Observe a primeira sequência de nucleotídeos mostrada na figura. Comparando com a segunda, observe que nesta houve perda de nucleotídeos. Por isso, deleção. Na terceira sequência, observe que houve adição de uma sequência TGTG (em vermelho). Por isso, inserção. Em ambos os casos, a deleção ou a inserção, muda o tamanho dos alelos observados durante a análise, porque aumentou ou diminui o número de repetições. Esses marcadores, assim como os SNPs, são importantes em casos de análises de DNA extraído de amostras muito degradadas. Marcadores de Herança Uniparental Quando a análise de STRs se torna difícil ou impossível devido à quantidade ou qualidade do DNA que foi recuperado, há também outra opção para se fazer o exame a partir do DNA mitocondrial (mtDNA). Embora esteja longe de ser tão informativa como as análises STRs, o mtDNA pode fornecer informações úteis tanto no quesito investigativo quanto na confirmação da identidade. https://www.pncq.org.br/ Além do DNA nuclear, nós temos ainda outro DNA que fica no interior da mitocôndria, por isso chamado de DNA mitocondrial. Fonte: InfoEscola <https://www.infoescola.com/> Trata-se de um DNA circular e apresenta uma região de interesse chamada D-loop que é altamente polimórfica e, portanto, usada para identificação humana na Genética Forense. Além dessa região polimórfica, o DNA mitocondrial se torna importante para análises forenses devido à quantidade encontrada nas células. Uma única célula pode conter entre 200 e 1.700 mitocôndrias, ou seja, se tem múltiplas cópias desse DNA. Por isso, mesmo em caso de amostras com mínimas quantidades de DNA e de esse estar tão degradado a ponto de não ser possível se fazer a análise do DNA nuclear, muitas vezes a identificação pode ser realizada com base na análise do DNA mitocondrial. Por ser de origem materna, o DNA mitocondrial pode ser útil para o estabelecimento de linhagens familiares. Isso significa que os restos mortais de uma pessoa podem ser comparados com amostras da sua mãe ou avó materna, uma irmã, tios ou tias por parte de mãe ou mesmo com parentes mais distantes desde que pertençam à linhagem materna. https://www.infoescola.com/ Saiba mais Na Argentina, durante a ditadura (período de 1976 e 1983), os filhos de muitas mulheres vítimas de represálias desapareceram. As “Avós da Praça de Maio” começaram, então, uma busca por seus netos. A identificação de muitos deles só foi possível pela análise do DNA mitocondrial. As sequências desse DNA foram então comparadas com as sequências das avós, já que estas passaram esse DNA para as filhas e estas passaram para os seus netos. Foi desenvolvido, assim, o sequenciamento do DNA mitocondrial para as avós que até hoje é usado para a identificação dos possíveis netos. Marcadores do Cromossomo Y – STRs de Y É possível analisar um painel de STRs localizado no cromossomo Y para fazer a vinculação dos restos da pessoa falecida com seus parentes homens. Este método pode ser útil quando não há parentes próximos disponíveis para a comparação. Qualquer pessoa da linhagem paterna pode ser usada para a vinculação: irmãos, tios e primos homens do lado paterno. PowerPlex Y ILS-600 ® Fonte: STRBase (SRD-130) <https://strbase.nist.gov//kits/PowerPlexY.htm> Existem kits comerciais para a análise dos STRs de Y (veja figura acima). Como os STRs de Y são exclusivos de indivíduos do sexo masculino, eles só exibem um alelo para qualquer STR. Portanto, a presença de mais de um alelo para cada STR do Y indica que DNA de mais de um indivíduo do sexo masculino está presente na amostra. Assim, pode-se confirmar, por exemplo, casos de estupro coletivo. Padrão de hereditariedade CODIS STR Loci Autossômico (Passado para todos os herdeiros) Marcadores Cromossomo Y (Passado para os filhos do sexo masculino) https://strbase.nist.gov//kits/PowerPlexY.htm Cromossomo X (Herdado da linhagem materna) Fonte: Modificado de Butler, J. M. (2005) Observando o padrão de hereditariedade acima, veja que: Os marcadores de STR autossômicos são herdados do pai e da mãe. Já os marcadores de DNA mitocondrial são herdados apenas da mãe (é transmitido tanto para filhos quanto para filhas). E os STRs de Y são herdados pelo filho (sexo masculino) do seu respectivo pai. Atividade 2. Existem algumas condições genéticas, como, por exemplo, a neuropatia óptica de Leber que causa cegueira no adulto jovem, decorrentes de mutações no DNA mitocondrial. Por ser de origem genética, essa doença não tem cura e é passada ao longo das gerações. Neste caso, de qual dos pais o indivíduo afetado herda essa condição? 3. Na Argentina, durante a ditadura militar iniciada em 1976, muitas crianças foram sequestradas com seus pais ou nasceram em centros clandestinos de detenção. Essas crianças foram adotadas, vendidas ou abandonadas em orfanatos. A Associação Civil “Avós da Praça de Maio” tem buscado localizar essas crianças com a finalidade de restituí-las a suas famílias legítimas, empregando para isso testes de identificação genética, que são possíveis, atualmente, mesmo na ausência dos pais. Fonte: abuelasatournet.com.arA comparação entre os DNAs mitocondriais de possíveis netos e avós tem sido um dos testes utilizados nesses processos de identificação de parentesco. A escolha desse teste está relacionada com o fato de: a) O DNA mitocondrial, por ser herdado da avó materna, através das mitocôndrias existentes no citoplasma do ovócito da mãe, permitir traçar árvores familiares confiáveis. b) O DNA mitocondrial, por ser herdado das duas avós, através de uma mistura dos genes do pai e da mãe, garantir um registro familiar que se mantém de geração a geração. c) O DNA mitocondrial, por ser herdado da avó paterna, através das mitocôndrias existentes no citoplasma do ovócito da mãe, permitir traçar árvores familiares confiáveis. d) O DNA mitocondrial, por ser herdado do avô paterno, através das mitocôndrias existentes no citoplasma do espermatozoide do pai, permitir identificar a filiação com segurança. 4. Uma vítima de acidente de carro foi encontrada carbonizada devido a uma explosão. Indícios, como certos adereços de metal usados pela vítima, sugerem que a mesma seja filha de um determinado casal. Uma equipe policial de perícia teve acesso ao material biológico carbonizado da vítima, reduzido, praticamente, a fragmentos de ossos. Sabe-se que é possível obter DNA em condições para análise genética de parte do tecido interno de ossos. Os peritos necessitam escolher, entre cromossomos autossômicos, cromossomos sexuais (X e Y) ou DNAmt (DNA mitocondrial), a melhor opção para identificação do parentesco da vítima com o referido casal. Sabe-se que, entre outros aspectos, o número de cópias de um mesmo cromossomo por célula maximiza a chance de se obter moléculas não degradadas pelo calor da explosão. Com base nessas informações e tendo em vista os diferentes padrões de herança de cada fonte de DNA citada, a melhor opção para a perícia seria a utilização: a) do DNAmt, transmitido ao longo da linhagem materna, pois, em cada célula humana, há várias cópias dessa molécula. b) do cromossomo X, pois a vítima herdou duas cópias desse cromossomo, estando assim em número superior aos demais. c) do cromossomo autossômico, pois esse cromossomo apresenta maior quantidade de material genético quando comparado aos nucleares, como, por exemplo, o DNAmt. d) do cromossomo Y, pois, em condições normais, este é transmitido integralmente do pai para toda a prole e está presente em duas cópias em células de indivíduos do sexo feminino. e) de marcadores genéticos em cromossomos autossômicos, pois estes, além de serem transmitidos pelo pai e pela mãe, estão presentes em 44 cópias por célula, e os demais, em apenas uma. 5. Os polimorfismos escolhidos e padronizados como primeira escolha nos laboratórios de Genética Forense são aqueles que permitem resultados mais conclusivos. A característica desses polimorfismos está associada a sua taxa de mutação nas populações, como também ao número de alelos presentes em cada um dos locus presentes nos cromossomos. Os polimorfismos que melhor respondem a essas características são os chamados polimorfismos de sequências repetidas in tandem, que constituem regiões do nosso genoma chamadas de minissatélites e microssatélites. De quais marcadores estamos falando? a) VNTRs b) Indels c) SNP d) STRs e) RFLP Referências FARAH, S. B. DNA segredos e mistérios. 2. ed. São Paulo: Sarvier, 2007. GARRIDO, R. G. & RODRIGUES, E. L Ciência forense: da cena do crime ao laboratório de DNA. 1. ed. Projeto Cultural, 2014. Próximos Passos Técnicas de biologia molecular aplicadas à Genética Forense; Reação em Cadeia da Polimerase (PCR); Princípios e aplicações da PCR. Explore mais Leia: “Polimorfismos Genéticos e Identificação Humana: O DNA como Prova Forense <http://docs.wixstatic.com/ugd/b703be_e8abacaf0933454cb651a1ff7bec8bf2.pdf> ”, por Leonardo Arduino Marano, Aguinaldo Luiz Simões, Silviene Fabiana de Oliveira, Celso Teixeira Mendes-Junior. Assista ao vídeo: Teste de paternidade. <http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1967> http://docs.wixstatic.com/ugd/b703be_e8abacaf0933454cb651a1ff7bec8bf2.pdf http://eaulas.usp.br/portal/video.action?idItem=1967