Determinação dos Parâmetros Cinéticos de uma Reação Enzimática

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Universidade Federal de Itajubá
Laboratório de Engenharia Química III
Determinação dos Parâmetros Cinéticos de uma Reação Enzimática
Gabriela de Almeida Brito – 2016000300 
 Jéssica da Silva Pereira – 28843 
Karina Siqueira de Azevedo – 2017019861 
Katherine de Kássia da silva – 2017019870
Marina de Sa Moreira – 28115 
ITAJUBÁ
2017
Universidade Federal de Itajubá
Laboratório de Engenharia Química III
Gabriela de Almeida Brito – 2016000300 
 Jéssica da Silva Pereira – 28843 
Karina Siqueira de Azevedo – 2017019861 
Katherine de Kássia da silva – 2017019870
Marina de Sa Moreira – 28115 
	
Determinação dos Parâmetros Cinéticos de uma Reação Enzimática
Relatório submetido ao Prof. Luciano Jacob Corrêa como requisito parcial para aprovação na disciplina de EQI029 – Laboratório de Engenharia Química III do curso de graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Itajubá.
ITAJUBÁ
2017
INTRODUÇÃO TEÓRICA
A cinética enzimática estuda a velocidade da reação e os parâmetros que podem influenciá-la durante o processo, como concentrações de substrato, produto e da enzima utilizada. Através desse estudo pode-se obter outras informações, como tempo de reação e rendimento (DUTTA, 2008).
Para se calcular a velocidade de reação, é possível determiná-la em função do consumo do substrato (equação 1) ou da formação de produto (equação 2), por um período de tempo. Na figura 1 é mostrado o comportamento de ambos os casos (DUTTA, 2008).
	
	(1)
	
	
	
	(2)
	
	
Nas quais, VS e VP são as velocidades de consumo de substrato e formação de produto, respectivamente, e CS é a concentração de substrato e CP a de produto formado.
Figura 1: Variação de concentração de substrato e produto em função do tempo
Fonte: DUTTA, 2008
Para poder descrever com mais detalhamento o mecanismo enzimático, Brown (1902, DUTTA, 2007) propôs que durante a reação, as enzimas formam um complexo enzima-substrato (ES) para, posteriormente, formar o produto final (figura 2). A partir dessa proposta, surgiram diversas abordagens para determinar a velocidade de reação. A abordagem utilizada neste relatório é a de Michaelis-Menten, ela determina que a segunda etapa da reação (figura 2.2) por ser mais lenta define a taxa reacional (equação 3), chamada de Equação Michaelis-Menten (DUTTA, 2008).
Figura 2: Forma esquemática da reação enzimática proposta por Brown
Fonte: DUTTA, 2008
	
	(3)
Na qual, KM é a constante de Michaelis-Menten, Vmax é a velocidade máxima de reação e [S] a concentração de substrato. 
Avaliação dos Parâmetros Cinéticos
Para facilitar a determinação dos parâmetros cinéticos, Vmax e Km, a equação de Michaelis-Menten foi rearranjada, de maneira a se obter um gráfico linear, nos seguintes métodos: Lineweaver-Burk e Langmuir (DUTTA, 2008).
Pelo método de Lineweaver-Burk, a equação 3 foi reescrita da seguinte maneira (equação 4) (DUTTA, 2008):
	
	(4)
E o método de Langmuir define a equação 3 na forma mostrada pela equação 5 (DUTTA, 2008): 
	
	(5)
A partir destas duas linearizações da equação 3, foram plotados os gráficos que ilustram de maneira mais simples a determinação de Vmax e Km (figuras 3 e 4) pelos métodos citados anteriormente.
Figura 3: Método gráfico para determinar Vmax e Km pela equação de Langmuir.
Fonte: DUTTA, 2008
Figura 4: Método gráfico para determinar Vmax e Km pela equação de Lineweaver-Burk.
Fonte: DUTTA, 2008
MATERIAIS E MÉTODOS
Os materiais utilizados na prática foram: banho termostático; balança analítica; espátula; béquer (50 mL); balão volumétrico (50 mL); sacarose (C12H22O11); solução da enzima invertase; água destilada; cronômetro; tubos de ensaio; pipeta automática e de vidro (10 mL); pêra; reagente DNS (Ácido dinitro-salicílico); luvas; espectrofotômetro e banho com água fervente e de água gelada. 
Iniciou-se o procedimento pesando as quantidades da reagente sacarose na balança analítica com o auxílio da espátula e béqueres para preparar 0,05 L de solução com as concentrações desejadas de 10, 20, 30 e 50 g/L. 
Depois de pesada às massas adicionou-se água destilada nos béqueres e homogeneizou para dissolver a sacarose, em seguida verteu-as em balões volumétricos de 50 ml para obter com precisão os volumes e as concentrações. Logo após, retornou as soluções preparadas em outros béqueres e as colocaram no banho termostático na temperatura de 40ºC durante um período de 5 minutos cronometrados. 
Estabelecida a temperatura, adicionou 100 μL da solução da enzima invertase com o auxílio de uma pipeta automática, agitou e cronometrou o tempo de reação (5 minutos), após esse tempo retirou alíquotas de 500 μL do meio reacional e as colocou nos tubos de ensaio nos tempos 2, 4, 6 e 8 minutos de reação. Depois, levou os tubos imediatamente ao banho de água fervente deixando-os por aproximadamente 5 minutos. Logo após, retirou os tubos da água fervente e colocou-os em água fria. 
A segunda etapa do procedimento consistiu em preparar o branco contendo 0,5 mL de água destilada e adicionou em cada tubo reacional e no branco 1 mL do reagente DNS, para deixar a solução colorida e conseguir realizar a leitura no espectrofotômetro. Em seguida, levou os tubos novamente para o banho de água fervente por aproximadamente 5 minutos. Dado esse tempo retirou-os e os colocaram em água fria, depois, diluiu a concentração dos tubos, adicionando 10 mL de água destilada com o auxilio da pipeta de vidro e a pêra. Fez-se essa diluição para poder realizar a leitura da absorbância no espectrofotômetro, estabelecendo o comprimento de onda de 540 nm.
APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS RESULTADOS 
Os valores de absorbância da sacarose obtidos através do espectrofotômetro, em função do tempo e da concentração inicial de sacarose, estão dispostos na Tabela 1 a seguir: 
	-
	SACAROSE (g/L)
	tempo (min)/ABS
	5
	10
	20
	30
	50
	80
	2
	0,0030
	0,0000
	0,0010
	0,0570
	0,0340
	0,0330
	4
	0,0080
	0,0020
	0,0265
	0,0950
	0,0660
	0,0470
	6
	0,0130
	0,0210
	0,0420
	0,1360
	0,0940
	0,0630
	8
	0,0180
	0,0360
	0,0600
	0,1860
	0,1240
	0,0680
TABELA 1: Tempo x ABS
Fonte: Pessoal, 2017.
Os valores de absorbância padrão e de concentração de ART padrão se encontram dispostos na tabela 2:
TABELA 2: Dados Curva Padrão
	Curva Padrão 
	[G]
	ABS
	0,05
	0,005
	0,1
	0,022
	0,2
	0,051
	0,4
	0,128
	0,8
	0,229
Fonte: Pessoal, 2017.
A partir dos dados da Tabela 2, foi possível construir a curva padrão de açúcares redutores (GRÁFICO 1). Linearizando estes dados, obteve-se a equação da reta. Assim, ao substituir os valores de absorbância e os intervalos de tempo correspondentes presentes na Tabela 1 na equação da reta, foi possível obter os valores de concentração de açúcares redutores. (Tabela 3).
GRÁFICO 1: Curva padrão [ART] 
Fonte: Pessoal, 2017.
TABELA 3: Tempo x Concentração ART
	-
	SACAROSE (g/L)
	tempo (min)/[ART] (g/L)
	5
	10
	20
	30
	50
	80
	2
	0,0315
	0,0215
	0,0249
	0,2105
	0,1343
	0,1310
	4
	0,0481
	0,0281
	0,1094
	0,3365
	0,2404
	0,1774
	6
	0,0647
	0,0911
	0,1608
	0,4725
	0,3332
	0,2304
	8
	0,0812
	0,1409
	0,2205
	0,6383
	0,4327
	0,2470
Fonte: Pessoal, 2017.
Em seguida, a velocidade da reação para cada concentração de substrato foi obtida através da derivada da curva de concentração de produto formado em função do tempo inicial (Equação 2). Para isso, utilizou-se o método de regressão linear dos valores de concentração de açúcares redutores nos correspondentes intervalos de tempo. 
TABELA 4: Velocidade da Reação x Concentração de Substrato
	-
	SACAROSE (g/L)
	-
	5
	10
	20
	30
	50
	80
	v(g/Lmin)
	0,0083
	0,0211
	0,0319
	0,0708
	0,0494
	0,0201
Fonte: Pessoal, 2017.
A partir do valor da velocidade da reação enzimática, foi possível plotar o gráficov versus [S] com o objetivo de estudar o efeito da concentração de substrato na reação. Pode-se analisar, através do GRÁFICO 2, que ocorre uma queda na curva a partir de uma concentração de aproximadamente 30 g/L de substrato. 
GRÁFICO 2: Velocidade da Reação Enzimática x Concentração de Substrato
Fonte: Pessoal, 2017.
Com o objetivo de se obter os valores de Km e vmax, utilizou-se os métodos de Lineweaver- Burk e Langmuir. A regressão linear em ambos os métodos foi realizada somente nos pontos que seguem o modelo de Michaelis-Menten. Os parâmetros cinéticos Km e vmax são obtidos através dos coeficientes lineares e angulares das equações das retas. 
Os valores obtidos para a realização do método de Lineweaver-Burk e o gráfico 1/ V vs 1/[S] plotado a partir desses dados são apresentados a seguir na Tabela 5 e no GRAFICO 3, respectivamente.
TABELA 5: Dados Método Lineweaver-Burk
	[S] (g/L)
	Y = 1/v
	X = 1/[S]
	5
	120,480
	0,200
	10
	47,393
	0,100
	20
	31,348
	0,050
	30
	17,182
	0,033
Fonte: Pessoal, 2017.
GRÁFICO 3: MÉTODO DE LINEWEAVER-BURK
Fonte: Pessoal, 2017.
Através da Equação 4, sabe-se que: 
Os dados obtidos para a realização do método de Langmuir e o gráfico 1/v vs [S] a partir desses dados estão dispostos na Tabela 6 e no GRAFICO 4, respectivamente.
TABELA 6: Dados Método Langmuir
	[S] (g/L)
	Y = s/v
	X = [S]
	5
	602,4096
	5
	10
	473,9336
	10
	20
	626,9592
	20
	30
	515,4639
	30
Fonte: Pessoal, 2017.
GRÁFICO 4: MÉTODO DE LANGMUIR
Fonte: Pessoal, 2017.
Sabe-se, através da Equação 5, que:
-4,2355
Através dos resultados obtidos, pode-se constatar que o método de Lineweaver-Burk se mostrou mais eficiente, pois apresentou uma linearidade mais acentuada do que o método de Langmuir. Já a reta de linearização gerada aplicando o método de Langmuir apresentou uma linearidade não satisfatória visto que o R² foi muito baixo. Pode-se explicar esse fato devida a discrepância dos dados de absorbância coletados. 
Sabe-se também que a temperatura da reação tem grande influência sobre a atividade da enzima. De acordo com a literatura a temperatura ótima para atividade da invertase é de 50ºC (BAGAL; KARVE, 2006 e MAQUEZ, 2007). É necessário o controle da temperatura para mantê-la no nível de atividade desejado, pois a temperaturas baixas a sua atividade é inibida e a temperaturas acima de um certo ponto a enzima começa a sofrer desnaturação. Essa influencia pode ser observada no gráfico 5:
GRÁFICO 5: Velocidade Reação Enzimática x Temperatura
Fonte: CORRÊA, 2017
Após retirar as alíquotas durante o experimento, estas foram levadas ao banho com água fervente a 100ºC a fim de cessar a reação por meio de desnaturação das enzimas.
Nota-se com os resultados que, a partir da concentração de 30 g/L, a velocidade da reação diminui. Isso pode ser explicado pelo fato de a enzima saturar em altas concentrações de substrato, como mostrado pelo gráfico 6:
GRÁFICO 6: Inibição por substrato
Fonte: CORRÊA, 2017
As fontes de erro do experimento são associadas principalmente pelas aproximações lineares realizadas para chegar aos resultados e pela discrepância dos dados coletados no experimento.
CONCLUSÃO
Com este trabalho foi possível observar que o aumento da concentração de substrato promove um aumento na velocidade da reação enzimática até se alcançar a velocidade máxima, a partir deste ponto notou-se a queda deste parâmetro, isto pode estar associado à saturação da enzima pela elevada concentração de substrato ou pelo consumo do substrato pelo produto, configurando uma reação indesejada que inibe a reação principal através do consumo do substrato e consequente queda da velocidade.
Nota-se também a importância da temperatura para a ação efetiva das enzimas, pois ao trabalhar próxima a temperatura ótima, ficou evidente o alto rendimento gerado na reação estudada. Essa característica foi comprovada quando a solução foi colocada no banho a 100ºC e a reação terminou devido à desnaturação das enzimas.
A constante de Michaelis Menten (Km) mede a concentração de substrato na qual é possível atingir metade da velocidade máxima da reação, portanto, ela assume um determinado valor para cada reação enzima-substrato. Neste caso, houve discrepância entre os valores encontrados, que se deve ao método de linearização usado. Contudo, entende-se que o valor mais próximo do real foi o dado pela relação de Lineweaver-Burk, pois foi o que resultou no maior coeficiente de correlação, ou seja, foi o método que melhor adequou os dados coletados a um modelo linear.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BAGAL, D.; KARVE, M. S. Entranpment of plant invertase within novel composite of agarose-gvar gum biopolymer membrane. Analytica Chimica Acta, v. 555, p. 316-321, 2006.
CORRÊA, Luciano Jacob. Slide Cinética Enzimática, Eng. Bioquímica, 2017.
DUTTA, Rajiv. Fundamentals of Biochemical Engineering. 1ª ed. Nova Delhi, Índia. Springer. Madrid 2008.