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16 Universidade Federal de Itajubá Laboratório de Engenharia Química III Determinação dos Parâmetros Cinéticos de uma Reação Enzimática Gabriela de Almeida Brito – 2016000300 Jéssica da Silva Pereira – 28843 Karina Siqueira de Azevedo – 2017019861 Katherine de Kássia da silva – 2017019870 Marina de Sa Moreira – 28115 ITAJUBÁ 2017 Universidade Federal de Itajubá Laboratório de Engenharia Química III Gabriela de Almeida Brito – 2016000300 Jéssica da Silva Pereira – 28843 Karina Siqueira de Azevedo – 2017019861 Katherine de Kássia da silva – 2017019870 Marina de Sa Moreira – 28115 Determinação dos Parâmetros Cinéticos de uma Reação Enzimática Relatório submetido ao Prof. Luciano Jacob Corrêa como requisito parcial para aprovação na disciplina de EQI029 – Laboratório de Engenharia Química III do curso de graduação em Engenharia Química da Universidade Federal de Itajubá. ITAJUBÁ 2017 INTRODUÇÃO TEÓRICA A cinética enzimática estuda a velocidade da reação e os parâmetros que podem influenciá-la durante o processo, como concentrações de substrato, produto e da enzima utilizada. Através desse estudo pode-se obter outras informações, como tempo de reação e rendimento (DUTTA, 2008). Para se calcular a velocidade de reação, é possível determiná-la em função do consumo do substrato (equação 1) ou da formação de produto (equação 2), por um período de tempo. Na figura 1 é mostrado o comportamento de ambos os casos (DUTTA, 2008). (1) (2) Nas quais, VS e VP são as velocidades de consumo de substrato e formação de produto, respectivamente, e CS é a concentração de substrato e CP a de produto formado. Figura 1: Variação de concentração de substrato e produto em função do tempo Fonte: DUTTA, 2008 Para poder descrever com mais detalhamento o mecanismo enzimático, Brown (1902, DUTTA, 2007) propôs que durante a reação, as enzimas formam um complexo enzima-substrato (ES) para, posteriormente, formar o produto final (figura 2). A partir dessa proposta, surgiram diversas abordagens para determinar a velocidade de reação. A abordagem utilizada neste relatório é a de Michaelis-Menten, ela determina que a segunda etapa da reação (figura 2.2) por ser mais lenta define a taxa reacional (equação 3), chamada de Equação Michaelis-Menten (DUTTA, 2008). Figura 2: Forma esquemática da reação enzimática proposta por Brown Fonte: DUTTA, 2008 (3) Na qual, KM é a constante de Michaelis-Menten, Vmax é a velocidade máxima de reação e [S] a concentração de substrato. Avaliação dos Parâmetros Cinéticos Para facilitar a determinação dos parâmetros cinéticos, Vmax e Km, a equação de Michaelis-Menten foi rearranjada, de maneira a se obter um gráfico linear, nos seguintes métodos: Lineweaver-Burk e Langmuir (DUTTA, 2008). Pelo método de Lineweaver-Burk, a equação 3 foi reescrita da seguinte maneira (equação 4) (DUTTA, 2008): (4) E o método de Langmuir define a equação 3 na forma mostrada pela equação 5 (DUTTA, 2008): (5) A partir destas duas linearizações da equação 3, foram plotados os gráficos que ilustram de maneira mais simples a determinação de Vmax e Km (figuras 3 e 4) pelos métodos citados anteriormente. Figura 3: Método gráfico para determinar Vmax e Km pela equação de Langmuir. Fonte: DUTTA, 2008 Figura 4: Método gráfico para determinar Vmax e Km pela equação de Lineweaver-Burk. Fonte: DUTTA, 2008 MATERIAIS E MÉTODOS Os materiais utilizados na prática foram: banho termostático; balança analítica; espátula; béquer (50 mL); balão volumétrico (50 mL); sacarose (C12H22O11); solução da enzima invertase; água destilada; cronômetro; tubos de ensaio; pipeta automática e de vidro (10 mL); pêra; reagente DNS (Ácido dinitro-salicílico); luvas; espectrofotômetro e banho com água fervente e de água gelada. Iniciou-se o procedimento pesando as quantidades da reagente sacarose na balança analítica com o auxílio da espátula e béqueres para preparar 0,05 L de solução com as concentrações desejadas de 10, 20, 30 e 50 g/L. Depois de pesada às massas adicionou-se água destilada nos béqueres e homogeneizou para dissolver a sacarose, em seguida verteu-as em balões volumétricos de 50 ml para obter com precisão os volumes e as concentrações. Logo após, retornou as soluções preparadas em outros béqueres e as colocaram no banho termostático na temperatura de 40ºC durante um período de 5 minutos cronometrados. Estabelecida a temperatura, adicionou 100 μL da solução da enzima invertase com o auxílio de uma pipeta automática, agitou e cronometrou o tempo de reação (5 minutos), após esse tempo retirou alíquotas de 500 μL do meio reacional e as colocou nos tubos de ensaio nos tempos 2, 4, 6 e 8 minutos de reação. Depois, levou os tubos imediatamente ao banho de água fervente deixando-os por aproximadamente 5 minutos. Logo após, retirou os tubos da água fervente e colocou-os em água fria. A segunda etapa do procedimento consistiu em preparar o branco contendo 0,5 mL de água destilada e adicionou em cada tubo reacional e no branco 1 mL do reagente DNS, para deixar a solução colorida e conseguir realizar a leitura no espectrofotômetro. Em seguida, levou os tubos novamente para o banho de água fervente por aproximadamente 5 minutos. Dado esse tempo retirou-os e os colocaram em água fria, depois, diluiu a concentração dos tubos, adicionando 10 mL de água destilada com o auxilio da pipeta de vidro e a pêra. Fez-se essa diluição para poder realizar a leitura da absorbância no espectrofotômetro, estabelecendo o comprimento de onda de 540 nm. APRESENTAÇÃO E ANÁLISE DOS RESULTADOS Os valores de absorbância da sacarose obtidos através do espectrofotômetro, em função do tempo e da concentração inicial de sacarose, estão dispostos na Tabela 1 a seguir: - SACAROSE (g/L) tempo (min)/ABS 5 10 20 30 50 80 2 0,0030 0,0000 0,0010 0,0570 0,0340 0,0330 4 0,0080 0,0020 0,0265 0,0950 0,0660 0,0470 6 0,0130 0,0210 0,0420 0,1360 0,0940 0,0630 8 0,0180 0,0360 0,0600 0,1860 0,1240 0,0680 TABELA 1: Tempo x ABS Fonte: Pessoal, 2017. Os valores de absorbância padrão e de concentração de ART padrão se encontram dispostos na tabela 2: TABELA 2: Dados Curva Padrão Curva Padrão [G] ABS 0,05 0,005 0,1 0,022 0,2 0,051 0,4 0,128 0,8 0,229 Fonte: Pessoal, 2017. A partir dos dados da Tabela 2, foi possível construir a curva padrão de açúcares redutores (GRÁFICO 1). Linearizando estes dados, obteve-se a equação da reta. Assim, ao substituir os valores de absorbância e os intervalos de tempo correspondentes presentes na Tabela 1 na equação da reta, foi possível obter os valores de concentração de açúcares redutores. (Tabela 3). GRÁFICO 1: Curva padrão [ART] Fonte: Pessoal, 2017. TABELA 3: Tempo x Concentração ART - SACAROSE (g/L) tempo (min)/[ART] (g/L) 5 10 20 30 50 80 2 0,0315 0,0215 0,0249 0,2105 0,1343 0,1310 4 0,0481 0,0281 0,1094 0,3365 0,2404 0,1774 6 0,0647 0,0911 0,1608 0,4725 0,3332 0,2304 8 0,0812 0,1409 0,2205 0,6383 0,4327 0,2470 Fonte: Pessoal, 2017. Em seguida, a velocidade da reação para cada concentração de substrato foi obtida através da derivada da curva de concentração de produto formado em função do tempo inicial (Equação 2). Para isso, utilizou-se o método de regressão linear dos valores de concentração de açúcares redutores nos correspondentes intervalos de tempo. TABELA 4: Velocidade da Reação x Concentração de Substrato - SACAROSE (g/L) - 5 10 20 30 50 80 v(g/Lmin) 0,0083 0,0211 0,0319 0,0708 0,0494 0,0201 Fonte: Pessoal, 2017. A partir do valor da velocidade da reação enzimática, foi possível plotar o gráficov versus [S] com o objetivo de estudar o efeito da concentração de substrato na reação. Pode-se analisar, através do GRÁFICO 2, que ocorre uma queda na curva a partir de uma concentração de aproximadamente 30 g/L de substrato. GRÁFICO 2: Velocidade da Reação Enzimática x Concentração de Substrato Fonte: Pessoal, 2017. Com o objetivo de se obter os valores de Km e vmax, utilizou-se os métodos de Lineweaver- Burk e Langmuir. A regressão linear em ambos os métodos foi realizada somente nos pontos que seguem o modelo de Michaelis-Menten. Os parâmetros cinéticos Km e vmax são obtidos através dos coeficientes lineares e angulares das equações das retas. Os valores obtidos para a realização do método de Lineweaver-Burk e o gráfico 1/ V vs 1/[S] plotado a partir desses dados são apresentados a seguir na Tabela 5 e no GRAFICO 3, respectivamente. TABELA 5: Dados Método Lineweaver-Burk [S] (g/L) Y = 1/v X = 1/[S] 5 120,480 0,200 10 47,393 0,100 20 31,348 0,050 30 17,182 0,033 Fonte: Pessoal, 2017. GRÁFICO 3: MÉTODO DE LINEWEAVER-BURK Fonte: Pessoal, 2017. Através da Equação 4, sabe-se que: Os dados obtidos para a realização do método de Langmuir e o gráfico 1/v vs [S] a partir desses dados estão dispostos na Tabela 6 e no GRAFICO 4, respectivamente. TABELA 6: Dados Método Langmuir [S] (g/L) Y = s/v X = [S] 5 602,4096 5 10 473,9336 10 20 626,9592 20 30 515,4639 30 Fonte: Pessoal, 2017. GRÁFICO 4: MÉTODO DE LANGMUIR Fonte: Pessoal, 2017. Sabe-se, através da Equação 5, que: -4,2355 Através dos resultados obtidos, pode-se constatar que o método de Lineweaver-Burk se mostrou mais eficiente, pois apresentou uma linearidade mais acentuada do que o método de Langmuir. Já a reta de linearização gerada aplicando o método de Langmuir apresentou uma linearidade não satisfatória visto que o R² foi muito baixo. Pode-se explicar esse fato devida a discrepância dos dados de absorbância coletados. Sabe-se também que a temperatura da reação tem grande influência sobre a atividade da enzima. De acordo com a literatura a temperatura ótima para atividade da invertase é de 50ºC (BAGAL; KARVE, 2006 e MAQUEZ, 2007). É necessário o controle da temperatura para mantê-la no nível de atividade desejado, pois a temperaturas baixas a sua atividade é inibida e a temperaturas acima de um certo ponto a enzima começa a sofrer desnaturação. Essa influencia pode ser observada no gráfico 5: GRÁFICO 5: Velocidade Reação Enzimática x Temperatura Fonte: CORRÊA, 2017 Após retirar as alíquotas durante o experimento, estas foram levadas ao banho com água fervente a 100ºC a fim de cessar a reação por meio de desnaturação das enzimas. Nota-se com os resultados que, a partir da concentração de 30 g/L, a velocidade da reação diminui. Isso pode ser explicado pelo fato de a enzima saturar em altas concentrações de substrato, como mostrado pelo gráfico 6: GRÁFICO 6: Inibição por substrato Fonte: CORRÊA, 2017 As fontes de erro do experimento são associadas principalmente pelas aproximações lineares realizadas para chegar aos resultados e pela discrepância dos dados coletados no experimento. CONCLUSÃO Com este trabalho foi possível observar que o aumento da concentração de substrato promove um aumento na velocidade da reação enzimática até se alcançar a velocidade máxima, a partir deste ponto notou-se a queda deste parâmetro, isto pode estar associado à saturação da enzima pela elevada concentração de substrato ou pelo consumo do substrato pelo produto, configurando uma reação indesejada que inibe a reação principal através do consumo do substrato e consequente queda da velocidade. Nota-se também a importância da temperatura para a ação efetiva das enzimas, pois ao trabalhar próxima a temperatura ótima, ficou evidente o alto rendimento gerado na reação estudada. Essa característica foi comprovada quando a solução foi colocada no banho a 100ºC e a reação terminou devido à desnaturação das enzimas. A constante de Michaelis Menten (Km) mede a concentração de substrato na qual é possível atingir metade da velocidade máxima da reação, portanto, ela assume um determinado valor para cada reação enzima-substrato. Neste caso, houve discrepância entre os valores encontrados, que se deve ao método de linearização usado. Contudo, entende-se que o valor mais próximo do real foi o dado pela relação de Lineweaver-Burk, pois foi o que resultou no maior coeficiente de correlação, ou seja, foi o método que melhor adequou os dados coletados a um modelo linear. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BAGAL, D.; KARVE, M. S. Entranpment of plant invertase within novel composite of agarose-gvar gum biopolymer membrane. Analytica Chimica Acta, v. 555, p. 316-321, 2006. CORRÊA, Luciano Jacob. Slide Cinética Enzimática, Eng. Bioquímica, 2017. DUTTA, Rajiv. Fundamentals of Biochemical Engineering. 1ª ed. Nova Delhi, Índia. Springer. Madrid 2008.